多指標綜合評價優(yōu)選葶藶生脈方中丹參、紅花提取工藝△

史紅星，張華潭，張靜宜，李春花

(1.衡水市中醫(yī)醫(yī)院，河北 衡水 053000；2.河北醫(yī)科大學(xué) 研究生學(xué)院，河北 石家莊 050017；3.河北中醫(yī)學(xué)院 藥劑教研室，河北 石家莊 050091)

·中藥工業(yè)·

多指標綜合評價優(yōu)選葶藶生脈方中丹參、紅花提取工藝△

史紅星1，張華潭2，張靜宜2，李春花3*

(1.衡水市中醫(yī)醫(yī)院，河北 衡水 053000；2.河北醫(yī)科大學(xué) 研究生學(xué)院，河北 石家莊 050017；3.河北中醫(yī)學(xué)院 藥劑教研室，河北 石家莊 050091)

目的：優(yōu)選葶藶生脈方中丹參、紅花的提取工藝。方法：以丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、羥基紅花黃色素A為綜合評價指標，通過正交試驗設(shè)計考察乙醇濃度、料液比、提取次數(shù)和提取時間對提取工藝的影響；采用高效液相色譜法測定4種成分的含量。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝為加10倍量60%乙醇超聲提取4次，每次50 min。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、可行。

丹參；紅花；提取工藝；正交試驗；丹參酮I；丹參酮ⅡA；隱丹參酮；羥基紅花黃色素

葶藶生脈方由葶藶子、丹參、紅花、紅參、黃芪等組成，是全國名老中醫(yī)邢月朋治療氣虛血瘀、陽虛水停型充血性心力衰竭(CHF)的經(jīng)驗方。經(jīng)臨床驗證能有效緩解癥狀，改善生活質(zhì)量，減少住院時間?！靶显屡笠鏆饣钛?、溫陽利水法”治療慢性心力衰竭診療方案被列為國家“十一五”科技支撐計劃項目。方中丹參與紅花所含成分不穩(wěn)定，長時間受熱易分解[1-2]，為將葶藶生脈方開發(fā)為現(xiàn)代制劑，筆者探索適于方中丹參、紅花工業(yè)生產(chǎn)的工藝參數(shù)。藥理實驗證明，丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、羥基紅花黃色素A可使冠脈血流量明顯增加，顯著改善缺氧動物的氧分壓和血氧飽和度，降低血粘度，抑制凝血和血栓形成，防止和減輕缺氧心肌超微結(jié)構(gòu)的變化，對缺氧心肌有保護作用[3-5]。而在煎煮過程中這些成分很難保留，為保證藥物療效，本試驗采用L9(34)正交試驗法，以HPLC測定丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、羥基紅花黃色素A含量為綜合評價指標，優(yōu)選出丹參、紅花的最佳超聲波提取工藝，為實際生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器

LC-15C高效液相色譜儀、SIL-10AF自動進樣系統(tǒng)、SPD-15C紫外檢測器(日本島津公司)；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；Mill-Q超純水處理系統(tǒng)(MilliporeBedford，MA，美國)；TG328B型分析天平(上海精科儀器廠)；KQ-100E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2藥材與試劑

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)、紅花(CarthamustinctoriusL.)購于石家莊樂仁堂，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院侯芳潔講師鑒定，符合《中華人民共和國藥典》2010版一部相關(guān)項下規(guī)定；丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110867-200406，110766-200518，110852-200806)；羥基紅花黃色素A對照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-13121913)；甲醇(色譜純，批號：A2005-0001，美國 Grace公司)；乙腈(色譜純，批號：TEN7949768，美國Grace公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(82∶18)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：270 nm；柱溫：室溫；進樣量：10 μL。見圖1～2[6-8]。

注：1.隱丹參酮；2.丹參酮I；3.丹參酮ⅡA。下同。圖1 混合對照品高效液相色譜圖

圖2 樣品高效液相色譜圖

2.1.2 對照品溶液制備 取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥的丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮適量，精密稱定，置于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容，于4 ℃冰箱中避光保存。丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮質(zhì)量濃度分別為30.24、34.8、61.06 μg·mL-1。

2.1.3 供試品溶液制備 按處方比例稱取1/2處方量的丹參、紅花各7.5、6 g，加入15倍量50%甲醇，超聲(電功率為100 W，頻率為40 KHZ)提取2次，每次40 min，合并提取液。精密量取提取液適量，減壓回收溶劑至近干，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，即得供試品溶液。

2.1.4 方法學(xué)考察 1)標準曲線：取對照品溶液，按2.1.1色譜條件分別進樣5、8、10、15、18、20、25 μL，記錄峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(Y)，進樣量(X，μg)為橫坐標，進行線性回歸，得線性回歸方程，見表1。結(jié)果表明，在相應(yīng)線性范圍內(nèi)，丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮進樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系；2)精密度試驗：丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮峰面積的RSD分別為0.40%、0.37%、0.40%(n=6)，表明儀器精密度良好；3)穩(wěn)定性試驗：供試品中丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮峰面積的RSD分別為1.68%、1.67%、0.40%(n=6)，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好；4)重復(fù)性試驗：丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮含量的RSD分別為1.53%、1.75%、1.04%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好；5)加樣回收率試驗：精密吸取已知含量的供試品溶液9份于5 mL容量瓶中，3份為一組，加入混合對照品溶液1.06、1.33、1.60 mL，甲醇定容，測定，計算丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮平均加樣回收率分別為97.17%、101.40%、99.22%，RSD分別為1.43%、1.54%、1.42%(n=9)。

2.2羥基紅花黃色素A含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm)，流動相：乙腈-0.1%磷酸(12∶88)；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：403nm；柱溫：室溫；進樣量：10μL。見圖3～4。

2.2.2對照品溶液制備 取羥基紅花黃色素A適量，精密稱定，置于25mL棕色容量瓶中，加25%甲醇溶解并定容，于4℃冰箱中避光保存。羥基紅花黃色素A質(zhì)量濃度為111.20μg·mL-1。

2.2.3供試品溶液制備 按處方比例稱取1/2處方量的丹參、紅花各7.5、6g，加入10倍量50%甲醇，超聲(電功率為100W，頻率為40KHZ)提取3次，每次30min，合并提取液，精密量取提取液適量，減壓回收溶劑至近干，用25%甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，即得供試品溶液。

表1 標準曲線的制備結(jié)果(n=7)

圖3 羥基紅花黃色素A高效液相色譜圖

圖4 樣品高效液相色譜圖

2.2.4 方法學(xué)考察 1)標準曲線：取2.2.2對照品溶液，按2.2.1色譜條件分別進樣2、5、8、10、15、18、20 μL，記錄峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(Y)，進樣量(X，μg)為橫坐標，進行線性回歸，得線性回歸方程：Y=984 785.340 3X-34 569.875 4(r=0.999 7)。結(jié)果表明，在0.222 4～2.224 0 μg，羥基紅花黃色素A進樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系；2)精密度試驗：羥基紅花黃色素A峰面積的RSD為1.45%(n=6)，表明儀器精密度良好；3)穩(wěn)定性試驗：供試品中羥基紅花黃色素A峰面積的RSD為0.55%(n=6)，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好；4)重復(fù)性試驗：羥基紅花黃色素A含量的RSD為2.57%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好；5)加樣回收率試驗：精密吸取已知含量的供試品溶液9份，3份為一組，于10 mL容量瓶中，加入對照品溶液1.20、1.50，1.80 mL，25%甲醇定容，測定，計算羥基紅花黃色素A平均加樣回收率為101.62%，RSD為1.50%(n=9)。

2.3正交試驗優(yōu)選丹參、紅花提取工藝

2.3.1 正交試驗設(shè)計與結(jié)果 在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，選定乙醇濃度(A)、乙醇用量(B)、提取次數(shù)(C)、提取時間(D)為主要影響因素，以丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、羥基紅花黃色素A為綜合評價指標，綜合評分[12]=(丹參酮I含量/最大丹參酮I含量+丹參酮ⅡA含量/最大丹參酮ⅡA含量+隱丹參酮含量/最大隱丹參酮含量)×25+羥基紅花黃色素A含量/最大羥基紅花黃色素A含量×75。采用L9(34)安排正交試驗。提取工藝的因素與水平見表2，正交試驗直觀分析結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4[9-11]。

表2 提取工藝因素水平表

表3 提取工藝的正交試驗結(jié)果

表3(續(xù))

表4 提取工藝的方差分析結(jié)果

注：F0.05(2，2)=19。

由表4直觀分析可知，各因素對提取效率影響大小為A>C>D>B。由方差分析結(jié)果可知，乙醇濃度和提取次數(shù)對提取效果的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)合正交試驗結(jié)果最佳提取工藝為A3B2C1D3，即加10倍量60%乙醇超聲提取4次，每次50 min?？紤]到試驗效率并結(jié)合試驗結(jié)果，確定每次提取時間為40 min。

2.3.2 最優(yōu)提取工藝驗證試驗 按處方規(guī)定量稱取丹參、紅花藥材，共3份，依據(jù)確定的最優(yōu)工藝參數(shù)進行驗證試驗，結(jié)果丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、羥基紅花黃色素A的平均質(zhì)量分數(shù)分別為0.91、1.42、0.84、6.13 mg·g-1，RSD分別為1.65%、2.10%、2.31%、1.96%。結(jié)果表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

為將葶藶生脈口服液開發(fā)為新藥，“葶藶生脈口服液研究與開發(fā)”被列入2015年度河北省科技支撐計劃項目。方中丹參、紅花、川芎活血祛瘀，丹參中的丹參酮ⅡA等對光、熱均較敏感，其溶液在光照、高溫條件下易分解[13]；紅花中的羥基紅花黃色素A是紅花活血化瘀有效成分，由于羥基紅花黃色素A為熱不穩(wěn)定物質(zhì)，在常壓沸騰狀況下隨著時間的延長不斷分解[14]。因此，本研究采用超聲波提取，可以很好地控制提取過程中溫度、光照對不穩(wěn)定物質(zhì)的影響。

丹參、紅花中的藥效成分性質(zhì)相同，我們采用高效液相色譜法測定丹參中丹參酮I、丹參酮ⅡA、隱丹參酮與紅花中羥基紅花黃色素A含量，為平衡各指標對工藝優(yōu)化的影響，使丹參與紅花成分含量在綜合評分中所占比例相同，最終確定綜合評價指標為(丹參酮I含量/最大丹參酮I含量+丹參酮ⅡA含量/最大丹參酮ⅡA含量+隱丹參酮含量/最大隱丹參酮含量)×25+羥基紅花黃色素A含量/最大羥基紅花黃色素A含量×75[12]，旨在篩選更合理的提取工藝參數(shù)。

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Multi-indexEvaluationofIntegrationTechniqueforExtractingofSalviamiltiorrhizaandCarthamustinctoriusfromTingliShengmaidecoction

SHIHongxing1，ZHANGHuatan2，ZHANGJingyi2，LIChunhua3*

(1.HengshuiHospitalofTraditionalChineseMedicine，Hengshui053000，China；2.Past-graduateSchool，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050017，China；3.Dept.ofTCM，HebeiUniversityofChineseMedicine，Shijiazhuang050091，China)

Objective：To optimize an integration technique for extracting ofSalviamiltiorrhizaandCarthamustinctoriusfrom Tingli Shengmai decoction.Methods：With composite score of contents of tanshinone I，tanshinone ⅡA，cryptotanshinone and hydroxyl safflower yellow A as index，orthogonal test was adopted to optimize extraction technology by taking the concentration of ethanol solid-liquid ratio extraction times and extraction time as factors.Contents of tanshinone I，tanshinone ⅡA，cryptotanshinone and hydroxyl safflower yellow A were determined by HPLC.Results：The optimal extraction process is thatSalviawas added with 10 times ethanol of 60% and extracted 50 minutes for 4 times.Conclusion：These optimized extraction processes are stable，feasible and suitable for industrial production of Tingli Shengmai decoction.

Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma；CarthamustinctoriusL.；extracting technology；orthogonal design；tanshinone I；tanshinone ⅡA；cryptotanshinone；hydroxyl safflower yellow A

河北省科技支撐計劃項目(15272701D)

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李春花，教授，研究方向：中藥制劑新技術(shù)、新方法；E-mail：13803369966@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.022

2015-07-12)