響應(yīng)曲面法優(yōu)化銀杏葉提取物柱層析精制工藝△

馮玉康，王文鵬，郝鵬彬，蔡向杰，趙玉欣，孫勝斌，姜國志

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430；2.河北省中藥注射液工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 051430；3.中藥注射劑新藥技術(shù)開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 051430)

·中藥工業(yè)·

響應(yīng)曲面法優(yōu)化銀杏葉提取物柱層析精制工藝△

馮玉康1*，王文鵬1，郝鵬彬1，蔡向杰1，趙玉欣1，孫勝斌2，姜國志3

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430；2.河北省中藥注射液工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 051430；3.中藥注射劑新藥技術(shù)開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 051430)

目的：利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化銀杏葉提取物柱層析精制工藝，從而得到較高含量的銀杏葉提取物。方法：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法建立數(shù)學(xué)模型，選擇低濃度醇濃度、高濃度醇濃度和上柱溶液pH值為影響因子，以總黃酮含量和內(nèi)酯含量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)曲面分析。結(jié)果：銀杏葉提取物最佳柱層析精制工藝條件：低濃度醇濃度為18%，高濃度醇濃度為67%，上柱溶液pH值為5.8。在最佳精制工藝條件下銀杏葉提取物的總黃酮的平均含量為29.50%，內(nèi)酯平均含量為10.58%。結(jié)論：利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化銀杏葉提取物柱層析精制工藝是穩(wěn)定可行的，可為工業(yè)化大生產(chǎn)提供參考。

響應(yīng)曲面法；銀杏葉提取物；柱層析

銀杏系銀杏科植物，是中國特有的起源久遠(yuǎn)的珍稀樹種之一，屬國家一級保護(hù)植物[1]。其性平，味甘、苦、澀，歸心、肺經(jīng)，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、斂肺平喘、化濁降脂等功能。用于瘀血阻絡(luò)、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、肺虛咳喘、高脂血癥[2]。銀杏葉含有多種化學(xué)成分，藥用價(jià)值主要體現(xiàn)在總黃酮類和內(nèi)酯類化合物。內(nèi)酯類化合物主要包括倍半萜類白果內(nèi)酯、二萜類銀杏內(nèi)酯A、B、C、J和M；銀杏葉中含有38種黃酮類化合物，其中主要分為雙黃酮[3]、黃苷元和黃酮苷，黃酮苷主要是槲皮素、山柰素、異鼠李素糖苷和兒茶素類[4-6]?！吨腥A人民共和國藥典》2010版規(guī)定銀杏總黃酮醇苷含量不得少于24.0%，萜類內(nèi)酯含量不得少于6.0%。

目前銀杏葉提取物的提取方法包括水提取法、有機(jī)溶劑提取物法、超聲提取法[7]、超臨界提取法[8]、微波提取法[9]和酶提取法[10]。其中使用最廣泛的為有機(jī)溶劑提取法，所以本研究提取部分采用的是稀乙醇提取法。在對銀杏葉提取物進(jìn)行精制時，胡敏等[11]通過比較研究發(fā)現(xiàn)，樹脂法優(yōu)于溶劑萃取法。另外由于樹脂成本低、回收率高、有機(jī)溶劑殘留少等優(yōu)點(diǎn)，目前國內(nèi)均采用樹脂吸附法精制銀杏葉提取物。本研究就是利用響應(yīng)曲面優(yōu)化法對柱層析的工藝進(jìn)行優(yōu)化，完成銀杏葉提取物的精制，為舒血寧注射液的生產(chǎn)提供合格的原料。

1 儀器與試藥

1.1儀器

梅特勒托利多METTLER-ALC-210.4電子分析天平；美國戴安UltiMate3000高效液相色譜儀；科偉HH-SB型電熱恒溫水浴鍋；昆山禾創(chuàng)KH3200E型超聲清洗器；無錫申科R501B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.2試藥

槲皮素、山柰素、異鼠李素、銀杏內(nèi)酯A、白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為100081-200907，110861-201310，110860-201109，110862-201310，110865-201306，110863-201209，110864-201307)；甲醇、乙腈、四氫呋喃等試劑為色譜純；乙醇分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1銀杏葉粗提物的制備

稱取1000g銀杏葉，加入8倍量的70%乙醇，溫浸提取4h，過濾，藥渣再次提取2次，每次4h，合并過濾液。濃縮至1000mL后，加入4倍量的水冷藏過濾，得到銀杏葉提取液，減壓濃縮至干，得到銀杏葉粗提物。

2.2銀杏葉有效成分總黃酮醇苷和銀杏內(nèi)酯的含量測定

參照《中華人民共和國藥典》2010年版一部銀杏葉提取物項(xiàng)下總黃酮醇苷與萜類內(nèi)酯含量測定方法[2]測定。

2.3大孔吸附樹脂的優(yōu)選

2.3.1大孔樹脂的吸附率測定 將銀杏葉提取物粗品溶于30倍的水中，分別量取50mL，加入經(jīng)過前處理活化好的30g大孔吸附樹脂LX-38、DM130、HPD-500、AB-8和D101，室溫震蕩24h后離心測定離心藥液含量。平行進(jìn)行3次試驗(yàn)并計(jì)算樹脂的吸附率。測定結(jié)果見表1、圖1。

2.3.2大孔樹脂的解吸率測定 將離心完畢后的樹脂加入75%的乙醇50mL，室溫震蕩24h，離心測定離心藥液含量并計(jì)算樹脂的解吸率。測定結(jié)果見表1、圖1。

表1 樹脂優(yōu)選結(jié)果

注：表內(nèi)數(shù)據(jù)為3次試驗(yàn)平均值。

圖1 不同樹脂對黃酮、內(nèi)酯的吸附率和解吸率

從圖1可以看到，不同樹脂對銀杏葉提取物中的黃酮和內(nèi)酯的吸附不同。AB-8大孔吸附樹脂的黃酮和內(nèi)酯的吸附率較其他樹脂高，而解吸率也較其他樹脂高，說明樹脂死吸附少，能將吸附的黃酮和內(nèi)酯釋放，利于精制純化。AB-8型大孔吸附樹脂是純化銀杏葉提取物的最佳樹脂。

2.4銀杏葉提取物柱層析精制方法

將銀杏葉粗提物加30倍純化水溶解，調(diào)節(jié)pH值，過濾，加入經(jīng)過預(yù)處理(大孔樹脂過篩，篩除小樹脂和碎樹脂，經(jīng)10倍純化水充分膨脹裝柱，并經(jīng)2%～3%鹽酸浸泡4h后，用3倍體積2%～3%鹽酸洗脫，然后使用純化水洗脫至中性。再更換5%氫氧化鈉溶液浸泡4h后，用3倍體積5%氫氧化鈉溶液洗脫，再用純化水洗脫至中性。再次更換95%乙醇浸泡4h后，用3倍體積95%乙醇洗脫，用純化水洗至無醇，備用)的大孔樹脂中，用2倍柱體積純化水洗脫，然后更換低濃度醇洗脫1倍柱體積，然后更換高濃度醇洗脫3倍柱體積，并收集洗脫液，減壓濃縮后干燥，即得銀杏葉提取物精品。

2.5單因素考察結(jié)果及分析

在保持提取條件不變的情況下，依次考察上柱液體pH值(4.0、5.0、5.5、6.0、7.0)、低濃度醇濃度(5%、10%、15%、20%、25%)和高濃度醇濃度(60%、65%、70%、75%、80%)等3個因素，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，排除誤差，結(jié)果見圖2。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1上柱溶液pH值考察 將溶解后的銀杏葉提取物pH值分別調(diào)節(jié)為4.0、5.0、5.5、6.0、7.0，然后上柱進(jìn)行柱層析精制。用2倍柱體積純化水洗脫，更換15%低濃度醇洗脫1倍柱體積，然后更換75%高濃度醇洗脫3倍柱體積并收集洗脫液，減壓濃縮后干燥即得銀杏葉提取物精品。結(jié)果顯示，當(dāng)液體pH在5.5左右時黃酮和內(nèi)酯含量較高。分析原因?yàn)殂y杏黃酮類化合物多為具有一定的極性和酸性的多羥基酚類化合物，當(dāng)pH為5.5時，呈酸性環(huán)境，銀杏黃酮類化合物在酸性環(huán)境保持其分子狀態(tài)，而大孔樹脂也主要是吸附分子狀態(tài)的化合物，從而容易被吸附并被有機(jī)溶劑洗脫而保留至產(chǎn)品中；內(nèi)酯類化合物在弱酸性環(huán)境下也呈現(xiàn)分子狀態(tài)而被保留至產(chǎn)品中[12]。

2.5.2低濃度醇濃度的考察 將溶解后的銀杏葉提取物pH值調(diào)節(jié)為5.5，然后分別上柱進(jìn)行柱層析精制，用2倍柱體積純化水洗脫，更換5%、10%、15%、20%、25%低濃度醇洗脫1倍柱體積，然后更換75%高濃度醇洗脫3倍柱體積并收集洗脫液，減壓濃縮后干燥即得銀杏葉提取物精品。結(jié)果顯示，15%的乙醇洗脫后終產(chǎn)品含量高。原因?yàn)榈蜐舛却枷疵?5%和10%)時，雜質(zhì)未被洗脫除去，而較高濃度(20%和25%)洗脫時有效成分流失較多，從而影響終產(chǎn)品的含量。

2.5.3高濃度醇濃度的考察 將溶解后的銀杏葉提取物pH值調(diào)節(jié)為5.5，然后分別上柱進(jìn)行柱層析精制，用2倍柱體積純化水洗脫，更換15%低濃度醇洗脫1倍柱體積，然后更換60%、65%、70%、75%、80%高濃度醇洗脫3倍柱體積并收集洗脫液，減壓濃縮后干燥即得銀杏葉提取物精品。結(jié)果顯示，70%的乙醇洗脫3倍體積，總黃酮和內(nèi)酯含量達(dá)到最高點(diǎn)，超過70%后，一些脂溶性雜質(zhì)被洗脫帶入終產(chǎn)品而降低了有效成分含量。

2.6響應(yīng)曲面優(yōu)化法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

依據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，考慮單因素試驗(yàn)的結(jié)果設(shè)計(jì)自變量。以銀杏葉提取物的總黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯含量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面分析進(jìn)行銀杏葉提取物柱層析精制工藝條件的優(yōu)化。

2.6.1因素選擇 單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取對銀杏葉提取物精制含量影響顯著的3個因素(低濃度醇濃度X1、高濃度醇濃度X2和上柱溶液pH值X3)，采用3水平的響應(yīng)曲面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。用Y1表示銀杏葉提取物黃酮含量，Y2表示銀杏葉提取物內(nèi)酯含量。因素與水平選擇見表2。

表2 中心組合試驗(yàn)因素和水平

2.6.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn) 利用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法。按照下表進(jìn)行試驗(yàn)，共含有15個試驗(yàn)點(diǎn)。Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.6.3 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，分別得到Y(jié)1和Y2對X1、X2和X3二次多項(xiàng)回歸模型：

Y1=28.65+1.79X1-1.40X2-0.044X3-0.08X1X2+0.58X1X3-0.72X2X3-1.47X12-1.64X22-1.86X32

Y2=10.53+0.58X1-0.053X2+0.26X3-0.46X1X2+0.08X1X3-0.39X2X3-0.92X12-0.29X22-

1.06X32

分別對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4～5。

表4 Y1回歸方程顯著性檢驗(yàn)

注：*為P<0.05；**為P<0.01。下同

表5 Y2回歸方程顯著性檢驗(yàn)

由表4可知，回歸模型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而失擬項(xiàng)P值均大于0.05，說明數(shù)據(jù)中沒有異常點(diǎn)。該模型擬合程度良好，誤差小，信噪比大于4，說明兩個模型可以很好地分析和預(yù)測銀杏葉提取物精制工藝的結(jié)果。

2.6.4 響應(yīng)曲面分析 固定其中的一個因素，考察另外兩個因素的響應(yīng)面和等高線。從交互作用的模擬等高線和曲面圖中發(fā)現(xiàn)AB、AC和BC等高線和曲面圖相似。以AB為例，等高線為橢圓形，表示交互效應(yīng)顯著，方差分析表的P值為0.013 9<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從總黃酮含量方面考慮各個因素的影響程度，排序?yàn)锳>B>C。見圖3。

圖3 Y1=f(A，B)的響應(yīng)曲面和等高線

固定其中的一個因素，考察另外兩個因素的響應(yīng)面和等高線。我們也可以看到該模型中的AB和BC因素之間的交互效應(yīng)顯著。AC等高線為圓形，表示AC交互作用不明顯。從內(nèi)酯含量方面考慮各個因素的影響程度，排序?yàn)锳>C>B。見圖4。

圖4 Y2=f(A，C)的響應(yīng)曲面和等高線

2.6.5 響應(yīng)曲面優(yōu)化銀杏葉提取物精制工藝條件 利用Design-Expert 8.0.6軟件分析，銀杏葉提取物最佳柱層析精制工藝：低濃度醇濃度為17.45%，高濃度醇濃度為66.70%，上柱溶液pH值為5.76。在最佳精制工藝條件下，銀杏葉提取物理論的最高總黃酮含量為29.707 2%，最高內(nèi)酯含量為10.718 4%。

2.7最優(yōu)條件驗(yàn)證試驗(yàn)

在響應(yīng)面軟件分析所得的最佳條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，分別測定銀杏葉提取物中的總黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯的含量，得到實(shí)際平均含量，并計(jì)算與模型給出的理論值的偏差。

全面驗(yàn)證該方法優(yōu)化結(jié)果的可靠性，同時對優(yōu)化數(shù)據(jù)進(jìn)行簡化。將精制工藝參數(shù)調(diào)整為低濃度醇濃度為18%，高濃度醇濃度為67%，上柱溶液pH值為5.8。并在此條件下連續(xù)進(jìn)行了3次試驗(yàn)，銀杏葉提取物的總黃酮含量分別為29.60%、29.51%和29.38%，平均值為29.50%，RSD=0.37%，其中槲皮素與山柰素的峰面積比平均為1.17，異鼠李素與槲皮素的峰面積比值平均為0.23；內(nèi)酯含量分別為10.55%、10.61%和10.58%，平均值為10.58%，RSD=0.28%，其中內(nèi)酯A含量為2.71%，內(nèi)酯B含量為1.42%，內(nèi)酯C含量為1.64%，白果內(nèi)酯含量為4.81%，見圖5。3批驗(yàn)證試驗(yàn)樣品中未檢出銀杏酸，符合中華人民共和國藥典規(guī)定。結(jié)果與理論值偏差總黃酮為0.7%，內(nèi)酯為1.2%。結(jié)果表明，基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化提取條件準(zhǔn)確可靠。3次驗(yàn)證試驗(yàn)(S1、S2、S3)的提取物總收率為2.2%，內(nèi)酯A、B、C基本滿足7∶3∶4的注射劑要求，可以滿足舒血寧注射液的生產(chǎn)需求。

圖5 驗(yàn)證試驗(yàn)HPLC圖

3 討論

通過響應(yīng)曲面分析預(yù)測，并經(jīng)過3次試驗(yàn)驗(yàn)證后得到了各因素的最佳值：低濃度醇濃度為18%，高濃度醇濃度為67%，上柱溶液pH值為5.8。3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明重現(xiàn)性好，該方法所得銀杏葉提取物含量滿足中華人民共和國藥典標(biāo)準(zhǔn)。

銀杏葉提取物制備的難點(diǎn)在于黃酮和內(nèi)酯的匹配，原料中黃酮和內(nèi)酯不匹配會直接影響制劑產(chǎn)品最終的含量不匹配，導(dǎo)致某一含量過高而另一含量不合格。注射劑中要求內(nèi)酯A∶B∶C=7∶3∶4，提取物中含量配備基本滿足制劑的要求才能生產(chǎn)出合格的制劑產(chǎn)品。經(jīng)過優(yōu)化后的銀杏葉提取物含量完全滿足注射劑的生產(chǎn)要求。此外，銀杏葉提取物精制過程中主要實(shí)現(xiàn)的是內(nèi)酯和黃酮的富集，并去除過多的雜質(zhì)類成分如多糖、蛋白及鞣質(zhì)。經(jīng)過多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃酮在經(jīng)過柱層析后損失率約15%，而內(nèi)酯損失較少，約3%～5%。而經(jīng)過柱層析后的固體損失量約25%～30%，實(shí)現(xiàn)了減少雜質(zhì)，提高有效成分的含量，達(dá)到精制的目的。

響應(yīng)曲面優(yōu)化法考慮了試驗(yàn)隨機(jī)誤差，并通過數(shù)據(jù)模擬出非線性的曲面模型，預(yù)測最優(yōu)方案，方法簡單。筆者利用響應(yīng)曲面法進(jìn)行多組試驗(yàn)的設(shè)計(jì)優(yōu)化[13-14]，實(shí)現(xiàn)對多個因素多個水平的綜合考察，加快了試驗(yàn)進(jìn)度。

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StudyonOptimizationofRefiningProcessofColumnChromatographyofGinkgobilobaLeavesExtractsbyResponseSurfaceMethodology

FENGYukang1*，WANGWenpeng1，HAOPengbin1，CAIXiangjie1，ZHAOYuxin1，SUNShengbin2，JIANGGuozhi3

(1.ShinewayPharmaceuticalGroupCo.，Ltd.，Shijiazhuang051430，China；2.HebeiProvinceEngineeringResearchCenterforTCMInjection，Shijiazhuang051430，China；3.State-LocalJointEngineeringLaboratoryofNewDrugsDevelopmentTechnologyforTCMInjection，Shijiazhuang051430，China)

Objective：In order to get a higher content ofGinkgobilobaleaves extracts，Response Surface Methodology(RSM)are employed to optimize the refining process of column chromatography of Ginkgo biloba leaves extracts.Methods：Based on the single factor experiments，Box-Behnken design was applied to establish the mathematical model.The optimum refining process was investigated by response surface methodology with low ethanol concentration，high ethanol concentration and pH value of solution as influencing factors，and the content of total flavone and lactone were considered as index.Results：The results of RSM suggested that under the experimental conditions of low ethanol concentration 18%，high ethanol concentration 67%，pH value 5.8.The average product content of total flavone and lactone were 29.50% and 10.58% under above conditions.Conclusion：This optimized technology of column chromatography ofGinkgobilobaleaves extracts by response surface methodology is stable，and feasible，which could be extended to the applications of large-scale production

response surface methodology；Gingko leaves extract；column chromatography

中藥大品種舒血寧注射液的技術(shù)改造及安全性評價(jià)(2014ZX09201022-004)

*

馮玉康，工程師，研究方向：中藥提取物工藝質(zhì)量及產(chǎn)業(yè)化研究；E-mail：fykxy_206@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.023

2015-07-02)