響應(yīng)曲面法優(yōu)化新疆阿魏種子總倍半萜香豆素提取工藝△

李廣志，王鈞篪，李曉瑾，曹麗，呂娜，沈連剛，朱軍，陳剛，斯建勇*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002)

·中藥工業(yè)·

響應(yīng)曲面法優(yōu)化新疆阿魏種子總倍半萜香豆素提取工藝△

李廣志，王鈞篪1，李曉瑾2，曹麗1，呂娜1，沈連剛1，朱軍2，陳剛2，斯建勇1*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002)

目的：優(yōu)化新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素的提取工藝。方法：以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間為自變量，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，以總倍半萜香豆素提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果：最佳提取工藝條件為80%乙醇加熱回流提取40 min，料液比為1∶40?？偙栋胼葡愣顾靥崛÷暑A(yù)測(cè)值為6.60%，實(shí)際值為6.62%，相對(duì)誤差為0.3%。結(jié)論：該優(yōu)選工藝穩(wěn)定可靠，為新疆阿魏資源的合理利用提供參考。

新疆阿魏；總倍半萜香豆素；響應(yīng)曲面分析法

新疆阿魏為傘形科阿魏屬植物，主要分布在我國新疆烏魯木齊地區(qū)。倍半萜香豆素為阿魏屬植物特征類型化合物，在新疆阿魏的化學(xué)成分研究中也發(fā)現(xiàn)了多種倍半萜香豆素化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該類型化合物具有抗炎、抑菌、抗腫瘤、艾滋病病毒(HIV)抑制作用等多種生物活性[1-2]。目前有關(guān)總倍半萜香豆素提取工藝的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)在探討了各因素對(duì)提取率影響的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)曲面分析法對(duì)新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素的提取工藝進(jìn)行研究，優(yōu)選出易操作、高得率、低成本的工藝技術(shù)，為倍半萜香豆素類化合物的研究開發(fā)提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器

UV-2102型紫外-可見分光光度計(jì)(尤尼科上海儀器有限公司)；NewClassic電子天平(梅特勒-托利多上海儀器有限公司)。

1.2材料

所用藥材于2014年7月采自新疆伊犁，經(jīng)新疆中藥民族藥研究所李曉瑾研究員鑒定為新疆阿魏FerulasinkiangensisK.M.Shen的種子，標(biāo)本存放于新疆中藥民族藥研究所。Lehmannolone 對(duì)照品為本課題組分離純化，經(jīng)核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。試驗(yàn)中用到的試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1供試品溶液的制備

精密稱取干燥的新疆阿魏種子粗粉1.0g，置250mL圓底燒瓶中，加80%乙醇40mL，回流提取40min，趁熱減壓抽濾，合并濾液，用提取液定容至100mL，充分搖勻后取1mL溶液，置50mL容量瓶定容至刻度，即得。

2.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱取Lehmannolone對(duì)照品11mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲加熱，使其全部溶解。放冷，加甲醇定容至刻度，搖勻即得。

2.3檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

以甲醇為空白液，對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，掃描結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[3]結(jié)果一致，在323nm處該類化合物有最大特征吸收。故本試驗(yàn)選此波長(zhǎng)為該類化合物的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mLLehmannolone對(duì)照品溶液，分別置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。搖勻后分別移取不同體積的溶液至5mL容量瓶，甲醇定容。充分搖勻后，以甲醇為空白對(duì)照，于323nm處測(cè)定吸光度(A)。以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=0.0428X-0.0042(r=0.9991)，表明Lehmannolone質(zhì)量濃度在8.8～44mg·L-1與吸光度線性關(guān)系良好。

2.5樣品測(cè)定

精密量取適量供試品溶液，以相應(yīng)的提取液為空白對(duì)照，按2.3項(xiàng)下方法測(cè)定A，計(jì)算總倍半萜香豆素含量。

新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素提取率=種子中總倍半萜香豆素提取質(zhì)量/種子干重×100%=[(A+0.004 2)×5000/0.042 8]×100%

2.6單因素試驗(yàn)考察

2.6.1乙醇體積分?jǐn)?shù)考察 精密稱取新疆阿魏干燥種子1.0g，按2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行提取，按2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。其他條件固定不變，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為70%、75%、80%、85%、90%、100%，結(jié)果總倍半萜香豆素的提取率依次為5.27%、7.19%、7.72%、7.53%、4.78%、3.13%，因此乙醇體積分?jǐn)?shù)以80%為宜。

2.6.2 料液比考察 精密稱取新疆阿魏干燥種子1.0g，按2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行提取，按2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。其他條件固定不變，分別加10、20、30、40、50倍量80%乙醇，結(jié)果總倍半萜香豆素的提取率依次為5.01%、7.20%、8.31%、6.80%、6.10%，故選擇加30倍量80%乙醇。

2.6.3 提取時(shí)間考察 精密稱取新疆阿魏干燥種子1.0g，其他條件固定不變，分別按2.1項(xiàng)下方法提取20、30、40、50、60min，按2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果總倍半萜香豆素的提取率依次為6.30%、6.32%、6.33%、6.86%、6.48%，故選擇提取50min。

2.7響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化工藝

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[4-5]，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)和提取時(shí)間(C)為考察因素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法。見表1。選用Design-Expert8.0.6試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總黃酮提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

表1 新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表2 新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素的提取工藝Box-Behnken中心組合試驗(yàn)安排

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得出回歸方程中的各項(xiàng)系數(shù)，見表3。用F檢驗(yàn)檢驗(yàn)顯著性[6-7]。

表3 回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)

由表3可知，各因素對(duì)新疆阿魏種子總倍半萜香豆素的提取工藝影響順序：乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>提取時(shí)間。A、A2、B2、AB、BC的F檢驗(yàn)均很顯著，說明各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而存在交互作用的二次關(guān)系。得出總倍半萜香豆素提取率的回歸方程：Y=6.77-0.71A+0.039B+0.016C-0.18AB+0.06AC-0.13BC-1.68A2-0.24B2-0.074C2。響應(yīng)面回歸方程的F檢驗(yàn)均很顯著；模型的校正決定系數(shù)(Adj R-Squared)=0.992 9，說明該模型幾乎可以解釋全部響應(yīng)值變化；失擬項(xiàng)的F=18.42，P=0.183>0.05，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明可用二次回歸方程模型代替試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，見圖1～3。

由圖1可知，總倍半萜香豆素的提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的增加先增大后變小。圖2表明，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間的增加，總倍半萜香豆素提取率先增加后下降。圖3表明，提取時(shí)間和料液比對(duì)總倍半萜香豆素提取率的影響不顯著。綜上所述，新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素最佳提取工藝條件：80%乙醇，料液比為1∶40，提取時(shí)間為40 min，此條件下總倍半萜香豆素的提取率為6.60%。

2.8精密度試驗(yàn)

精密量取Lehmannolone對(duì)照品溶液2mL，共6份，分別置于10mL容量瓶中，按2.5方法進(jìn)行，RSD為0.98%，說明該方法精密度良好。

2.9驗(yàn)證試驗(yàn)

按最佳提取條件進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，計(jì)算總倍半萜香豆素提取率分別為6.67%、6.65%、6.54%、6.57%、6.59%、6.69%，RSD為0.92%，說明該提取工藝穩(wěn)定可行。

2.10準(zhǔn)確度試驗(yàn)

在已知含量的6份新疆阿魏種子總倍半萜香豆素提取液中各加入Lehmannolone對(duì)照品溶液2mL(0.22g·L-1)，按2.5方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得平均回收率為100.09%，RSD為1.13%，表明該方法測(cè)定總倍半萜香豆素含量是可行的。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比對(duì)新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素提取的影響等高線及響應(yīng)面

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間對(duì)新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素提取的影響等高線及影響

圖3 料液比與提取時(shí)間對(duì)新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素提取的影響等高線及響應(yīng)面

2.11穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取新疆阿魏種子1.0g，按2.1方法處理。對(duì)提取液分別在0.5、1、3、6、12、24h后按2.5方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示吸光度在24h內(nèi)無明顯變化，RSD為1.25%，表明新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素成分在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 討論

通過前期對(duì)新疆阿魏種子化學(xué)成分的系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)半萜香豆素類成分為其主要的特征化合物。本試驗(yàn)對(duì)新疆阿魏種子總倍半萜香豆素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，為深入開發(fā)新疆阿魏總倍半萜香豆素提取物奠定基礎(chǔ)。目前工藝優(yōu)選常采用正交設(shè)計(jì)，但存在精度不夠，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性較差等缺陷。本試驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)[8]，以新疆阿魏種子為原料，建立了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間對(duì)新疆阿魏種子中總倍半萜香豆素提取率的回歸模型，并對(duì)模型進(jìn)行失擬以及F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。結(jié)果表明，可用二次回歸方程模型代替試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

[1] 王月娥，斯建勇，李曉瑾，等.新疆阿魏種子化學(xué)成分的研究(I)[J].中國現(xiàn)代中藥，2011，13(1)：26.

[2] Guangzhi Li，Xiaojin Li，Li Cao，et al.Steroidal esters fromFerulasinkiangensis[J].Fitoterapia，2014，97：247.

[3] Mohamed H，Abd EI-Razek，Shinji Ohta，et al.Sesquiterpene coumarins from the roots of Ferula assa-foetida [J].Phytochemistry，2001，58：1289.

[4] 周向軍，高義霞，張霞.響應(yīng)面法優(yōu)化黃花菜總黃酮提取工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(16)：29.

[5] BOX G E P，Hunter W G.Statistics for experiments：An introduction to design，data analysis，and model building [M].New York：Wiley，1990.

[6] 袁志發(fā)，周靜芋.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析 [M].北京：高等教育出版社，2000.

[7] 徐中儒.回歸分析與試驗(yàn)設(shè)計(jì) [M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[8] 陳詩強(qiáng)，林江蕭，陳劍鋒.相應(yīng)曲面分析法優(yōu)化油茶籽中總黃酮提取工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(8)：26.

OptimizaionofExtractionTechnologyofTotalSesquiterpeneCoumarinsfromSeedsofFerulasinkiangensisbyResponseSurfaceMethod

LIGuangzhi1，WANGJunchi1，LIXiaojin2，CAOLi1，LYUNa1，SHENLiangang1，ZHUJun2，CHENGang2，SIJianyong1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.XinjiangInstituteofChineseMateriaMedicaandEthicalMateriaMedica，Urumqi830002，China)

Objective：To optimize extraction technology of total sesquiterpene coumarins from the seeds ofFerulasinkiangensis.Method：With ethanol concentration，solid-liquid ratio and extraction time as independent variables，and on the basis of single-factor tests，Box-Behnken central composite design was used to establish mathematical method，the yield of total sesquiterpene coumarins was used as response value，response surface methodology was adopted to the analysis of response surface method.Result：Optimum extraction technology conditions were as follows：ethanol concentration 80%，solid-liquid ratio of 1∶40，extraction time 40 min.The predicted extraction yield of total sesquiterpene coumarins was 6.60%，and the verification 6.62%，with relative error of 0.3%.Conclusion：This optimized technology was reliable and stable，and it could provide reference for rational utilization of resources ofFerulasinkiangensis.

Ferulasinkiangensis；total sesquiterpene coumarins；Response Surface Methodology

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81460661，81460586)；國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09301-002-001，2011ZX09307-002-01)

*

斯建勇，研究員，研究方向：天然藥物化學(xué)；Tel：(010)57833299，Email：jianyongsi@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.021

2015-04-25)