天灸防治大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

劉文吉,李勝杰,羅欽,冀美琦,張偉,解秸萍

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天灸防治大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

劉文吉,李勝杰,羅欽,冀美琦,張偉,解秸萍

(北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

目的 觀察天灸防治大鼠肝纖維化(HF)的作用。方法 將30只大鼠隨機(jī)分為治療組、模型組和對照組,每組10只。采用四氯化碳腹腔注射造模的方法建立HF大鼠模型,治療組從造模后第3星期開始進(jìn)行天灸治療,每星期2次,每次6 h,共治療4星期。觀察各組大鼠體重、肝濕重、肝指數(shù),比較血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及血清和肝臟Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、IV型膠原(IV-C)、透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)的含量。結(jié)果 模型組大鼠HF程度分級及HF組織膠原分析指標(biāo)與治療組和對照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。模型組大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)與對照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。治療組大鼠肝濕重和肝指數(shù)與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。模型組大鼠血清ALT、AST含量及血清及肝臟PCIII、IV-C、HA、LN含量與對照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。治療組大鼠血清ALT、AST含量及血清及肝臟IV-C、HA、LN含量與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。治療組大鼠血清PCⅢ含量與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。結(jié)論 天灸具有一定的防治大鼠肝纖維化的作用。

穴位貼敷法;發(fā)泡療法;肝纖維化;大鼠

肝纖維化(HF)是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生,導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過度沉淀的病理過程。各種病因引起的慢性肝病都可能繼發(fā)纖維化,逐步發(fā)展為肝硬化等不良嚴(yán)重后果。近年來,針對此疾病的中西療法已較為明確,但療程較長所帶來的藥物毒副反應(yīng)以及針灸患者的依從性較差都是亟待解決的問題。天灸采用刺激性藥物敷貼于皮膚表面,致使局部充血發(fā)泡,激發(fā)經(jīng)絡(luò)氣血運(yùn)行,起到調(diào)整機(jī)體免疫的作用。本實(shí)驗(yàn)通過建立HF模型,觀察天灸對HF大鼠的防治作用,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級雄性SD大鼠30只,體重為200～220 g,由斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司提供[合格號SCXK(京)2011-0004]。隨機(jī)分為治療組、模型組和對照組,每組10只。所有大鼠均按國家標(biāo)準(zhǔn)固體混合飼料喂養(yǎng),自由飲食。實(shí)驗(yàn)室溫度為18 ℃～22 ℃,相對濕度為50%～60%。

1.2 儀器與試劑

7160型全自動生化分析儀(日本日立公司);美國Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件;放免試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所提供);CCL4分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供);橄欖油分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供);斑蝥(東直門醫(yī)院提供)。

1.3 模型制備

治療組和模型組大鼠普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,參考邵佳亮等[1]造模方法制備HF大鼠模型,即大鼠按0.3 mL/100 g腹腔注射40%四氯化碳(CCL4)橄欖油溶液,每星期2次,連續(xù)6星期。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物處理

各組均給予普通飼料,自由飲水。

治療組造模后第3星期進(jìn)行天灸治療。取肝俞、期門穴。將斑蝥粉碎后,過80目篩,裝入瓶中備用。在直徑為22 mm且內(nèi)含10 mm×10 mm吸水墊的穴位貼上,取提前預(yù)備好的斑蝥粉,每穴0.05 g[2],用清水調(diào)至膏狀后放在吸水墊中央,貼敷穴位,貼敷時(shí)間為6 h[2]。每星期治療2次,共治療4星期。

模型組和對照組大鼠均抓取束縛,每次6 h,每星期2次,共治療6星期。

1.5 標(biāo)本采集

大鼠斷頭取血5～8 mL,離心(4℃,3000 rpm, 10 min)后取上清液,-80℃保存;取肝臟,稱濕重后迅速取兩塊約300 mg肝左葉相同部位組織,一份置10%甲醛溶液中固定,分別用HE 染色和 Masson 法膠原纖維染色;另一份肝組織與PBS緩沖液按1:4比例置于勻漿器中研磨,離心(4℃,3000 rpm,15 min)后取上清液,-80℃保存。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 血清學(xué)檢測

全自動生化分析儀檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST);放射免疫法檢測血清和肝臟勻漿液III型前膠原(PCⅢ)、IV型膠原(IV-C)、透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)的含量,具體檢測方法見試劑盒說明書。

1.6.2 組織學(xué)檢查

肝臟組織常規(guī)石蠟切片,分別采用HE染色和Masson染色,在光鏡下觀察肝臟炎癥壞死程度及膠原分布情況。

1.6.2.1 HE染色

肝炎病變依纖維化程度分為0～4期[3]。0期為匯管區(qū)及小葉內(nèi)無纖維化;1期為匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大,限局竇周及小葉內(nèi)纖維化;2期為匯管區(qū)周圍纖維化,纖維間隔形成,小葉結(jié)構(gòu)保留;3期為纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂,無肝硬化;4期為早期肝硬化。

1.6.2.2 MASSON染色

膠原分布情況按肝纖維化半定量方法(SSS)[4]進(jìn)行纖維化計(jì)分和美國IPP專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行定量分析,具體操作為,病理片在顯微鏡下放大10×10倍,于標(biāo)本四角和中央位置選取5個(gè)視野,測定每1個(gè)視野中膠原纖維含量,以纖維占視野面積的百分比表示,取平均值[5]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。若數(shù)據(jù)呈正態(tài)性分布,方差齊用單因素ANOVA方差分析(檢驗(yàn)),法進(jìn)行兩兩比較,方差不齊用Welch (檢驗(yàn)),檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;若數(shù)據(jù)是非正態(tài)分布,用秩和檢驗(yàn),用兩個(gè)獨(dú)立非參進(jìn)行兩兩比較,數(shù)據(jù)以)表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠HF程度分級比較

對照組HE染色光鏡下示肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞索排列規(guī)則有序,肝細(xì)胞間連接緊密,呈放射狀分布,肝竇與匯管區(qū)無成纖維細(xì)胞。模型組肝細(xì)胞索排列紊亂,纖維結(jié)締組織增生形成條狀纖維間隔,可見假小葉形成,肝纖維化病理分期80%在2～3期,與對照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。治療組可見匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生及纖維間隔形成均較模型組少,肝纖維化病理分期30%在2～3期,與模型組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠HF程度分級比較 (n)

注:與對照組比較1)＜0.01

2.2 各組大鼠HF組織膠原分析指標(biāo)比較

對照組Masson染色可見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,中央靜脈及肝竇內(nèi)匯管區(qū)少量膠原纖維分布;模型組可見匯管區(qū)和小葉間有大量增生的粗大膠原纖維,有大量大小不等的假小葉形成,半定量評分與圖像分析與對照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。治療組見中央靜脈星芒狀增厚,匯管區(qū)纖維間隔形成,假小葉形成較少,半定量評分和圖像分析與模型組與對照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠HF組織膠原分析指標(biāo)比較 (±s)

表2 各組大鼠HF組織膠原分析指標(biāo)比較 (±s)

組別n 半定量評分(分)圖像分析(%) 治療組7 9.91±1.172)16.82±3.962) 模型組715.84±3.621)29.55±4.131) 對照組70.00±0.000.65±0.37

注:與對照組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.05

2.3 各組大鼠體重、肝濕重、肝指數(shù)比較

各組大鼠體重均有所增長,模型組大鼠體重明顯低于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。治療組體重低于模型組,有下降趨勢(P＞0.05)。模型組大鼠肝濕重和肝指數(shù)均明顯增加,與對照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。治療組大鼠肝濕重和肝指數(shù)與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。詳見表3。

表3 各組大鼠體重、肝濕重、肝指數(shù)比較 (±s)

表3 各組大鼠體重、肝濕重、肝指數(shù)比較 (±s)

組別n體重(g)肝濕重(g)肝指數(shù)(%) 治療組7321.85±6.7010.67±0.392)3.29±0.742) 模型組7337.71±6.781)12.68±0.571)3.75±0.131) 對照組7371.86±9.358.92±0.452.39±0.68

注:與對照組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.4 各組大鼠血清ALT、AST含量比較

模型組大鼠血清ALT、AST含量較對照組明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。治療組血清ALT、AST含量均低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠血清ALT、AST含量比較 (±s,IU/L)

表4 各組大鼠血清ALT、AST含量比較 (±s,IU/L)

組別n ASTALT 治療組7 170.14±4.832)58.43±4.593) 模型組7 204.51±4.251) 84.36±10.191) 對照組790.80±6.9637.92±3.82

注:與對照組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01,3)＜0.05

2.5 各組大鼠血清及肝臟HA、PCⅢ、IV-C、LN含量比較

模型組大鼠血清及肝臟PCⅢ、IV-C、HA、LN含量均顯著高于對照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。治療組大鼠血清PCⅢ、IV-C、HA、LN含量均顯著下降,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (＜0.01,＜0.05)。治療組大鼠肝臟IV-C、HA、LN含量也顯著下降,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01,＜0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠血清及肝臟HA、PCⅢ、IV-C、LN含量比較 (±s,ng/mL)

表5 各組大鼠血清及肝臟HA、PCⅢ、IV-C、LN含量比較 (±s,ng/mL)

組別n 類型PCⅢIV-CHALN 治療組7 血清105.75±1.303)118.17±6.564) 112.06±4.384)134.06±4.274) 肝臟16.55±0.64 12.30±1.234) 17.99±0.493) 17.51±0.754) 模型組7 血清109.96±0.791)138.95±6.131) 124.08±3.481)148.14±2.891) 肝臟 18.29±0.691)13.91±1.172) 22.63±0.501) 20.13±0.622) 對照組7 血清95.69±0.5682.03±2.83 83.85±3.59106.28±6.18 肝臟14.15±0.488.81±0.69 11.25±1.57 17.35±0.96

注:與對照組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與模型組比較3)＜0.01,4)＜0.05

3 討論

根據(jù)慢性肝炎及肝硬化的臨床表現(xiàn),中醫(yī)學(xué)認(rèn)為HF與“瘕積”有一定的類同之處,其病機(jī)主要為本虛標(biāo)實(shí)、血瘀痰結(jié)[6]。治療中,扶正祛邪是關(guān)鍵。天灸引起局部發(fā)泡后產(chǎn)生對穴位的機(jī)械、化學(xué)、生物刺激作用,激發(fā)穴位經(jīng)絡(luò)之氣傳至臟腑,達(dá)到協(xié)調(diào)陰陽、調(diào)整氣血,扶正祛邪的作用。本實(shí)驗(yàn)中,選取肝俞、期門是因其對肝臟具有相對特異性。肝主疏瀉,又主藏血,肝之背俞穴肝之經(jīng)氣輸注于背部之處,有疏肝利膽,活血化瘀之功。期門穴為肝之募穴,輸布于全身的氣血由此入肝。肝俞與期門相配為俞墓配伍,前后同治,起到治療肝臟疾病的作用。現(xiàn)代研究[7]顯示,大多數(shù)俞、募穴與相應(yīng)臟腑屬于同神經(jīng)節(jié)段。過往研究可見,針灸肝俞、期門及其他配穴,可有效改善肝臟功能,引起血清中ALT、AST下降及血清PCⅢ、IV-C、HA、LN下降[8]。

天灸作用于體表,通過具有引赤發(fā)泡作用的藥物貼于穴位皮膚上,起到一種微面積的化學(xué)性、燒傷性刺激作用。這種刺激首先作用在皮膚的神經(jīng)感受器上,對機(jī)體的有關(guān)物理、化學(xué)感受器產(chǎn)生影響,直接反射性地調(diào)整大腦皮層和植物神經(jīng)系統(tǒng)的功能,提高機(jī)體免疫功能,達(dá)到治療疾病的目的[9-12]。有研究[13-16]顯示,天灸療法能促進(jìn)機(jī)體免疫細(xì)胞的生成和提高免疫細(xì)胞的活性。過往研究顯示,自然殺傷細(xì)胞(NK)[17]、T細(xì)胞亞群(NKT)[18]、巨噬細(xì)胞[19]等細(xì)胞通過合成分泌細(xì)胞因子、趨化因子等化學(xué)介質(zhì),構(gòu)成影響肝星狀細(xì)胞(HSC)的免疫細(xì)胞-細(xì)胞因子-趨化因子免疫微環(huán)境,而HSC是肝臟內(nèi)合成ECM的主要細(xì)胞,HSC的活化和增值被認(rèn)為是HF發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[20]。

另一方面,天灸藥物可使皮膚發(fā)生無菌性滲出性炎癥反應(yīng),繼而引起局部皮膚細(xì)胞膜蛋白質(zhì)可逆性結(jié)構(gòu)變化,形成疏松組織,增加皮膚滲透性,從而增加藥物有效成分的滲入。本實(shí)驗(yàn)使用之斑蝥,經(jīng)現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)[21]證明其主要成分為斑蝥素及結(jié)合斑蝥素如去甲斑蝥素、斑蝥酸鈉等,具有破瘀散結(jié)、攻毒蝕皰、抗纖維化、抗腫瘤等作用[22-25]。過往研究[26]顯示,去甲斑蝥素可以抑制活化的 HSCs增殖,并通過降低線粒體膜電位,激活 Caspase3 酶的活性促進(jìn) HSCs凋亡,抑制細(xì)胞周期使細(xì)胞生長阻滯于G2/M期,改善肝纖維化程度。另有研究[27]顯示,斑蝥酸鈉可以明顯降低轉(zhuǎn)氨酶和患者肝纖維化血清標(biāo)志物(PCⅢ、IV-C、HA、LN)。而現(xiàn)代研究[28]發(fā)現(xiàn),斑蝥酊劑引起皮膚水泡的發(fā)泡液中含有中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及IL-12等免疫物質(zhì),證明了斑蝥天灸可以提高患者免疫能力。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)四氯化碳(CCL4)腹腔注射造模后,模型組的肝濕重和肝指數(shù)、血清中AST、ALT以及血清和肝臟HA、PCⅢ、IV-C、LN水平明顯高于對照組,表明造模成功。經(jīng)數(shù)星期治療后,治療組肝濕重和肝指數(shù)、血清中AST和ALT以及血清和肝臟HA、PCⅢ、IV-C、LN水平較模型組有明顯下降,且肝臟病理片有明顯改善,提示應(yīng)用斑蝥天灸肝俞、期門穴治療是有效的。這可能與肝俞、期門與肝屬于同神經(jīng)節(jié)段,天灸產(chǎn)生的機(jī)械刺激可以發(fā)揮其經(jīng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用有關(guān);亦或與天灸產(chǎn)生的化學(xué)刺激激發(fā)機(jī)體免疫有關(guān)。另外,斑蝥中的藥用成分也起到了不容忽視的作用,這可能與去甲斑蝥素通過抑制活化的HSCs增值和促進(jìn)其凋亡實(shí)現(xiàn)抗HF的作用有關(guān),而斑蝥素納也可溶解吸收肝內(nèi)膠原纖維,改善HF。但由于實(shí)驗(yàn)周期較短、檢測指標(biāo)較少,未能深入論述斑蝥天灸防治HF的機(jī)制機(jī)理,有待于在今后的研究中深入完善。

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Experimental Study of Vesiculation Moxibustion for Prevention and Treatment of Rat Hepatic Fibrosis

LIU Wen-ji, LI Sheng-jie, LUO Qin, JI Mei-qi, ZHANG Wei, XIE Jie-ping.

Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100029, China

Objective To investigate the preventive and therapeutic effects of vesiculation moxibustion on rat hepatic fibrosis (HF). Methods Thirty rats were randomly allocated to treatment, model and control groups, 10 rats each. A rat model of HF was made by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride. At three weeks after model making, the treatment group was treated by vesiculation moxibustion 6 hrs twice a week, for a total of 4 weeks. Body weight, liver wet weight, liver index, serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) contents, and serum and liver type Ⅲ procollagen (PC Ⅲ), type Ⅳ collagen (Ⅳ-C), hyaluronic acid (HA) and laminin (LN) contents were measured in every group of rats. Results There were statistically significant differences in HF severity grade and HF tissue collagen analysis indices between the model group of rats and the treatment group or the control group (＜0.01,＜0.05). There were statistically significant differences in body weight, liver wet weight and liver index between the model and control groups of rats (＜0.01). There were statistically significant differences in liver wet weight and liver index between the treatment and model groups of rats (＜0.01). There were statistically significant differences in serum ALT and AST contents, and serum and liver PC Ⅲ, Ⅳ-C, HA and LN contents between the model and control groups of rats (＜0.01,＜0.05). There were statistically significant differences in serum ALT and AST contents, and serum and liver Ⅳ-C, HA and LN contents between the treatment and model groups of rats (＜0.01,＜0.05). There was a statistically significant difference in serum PC Ⅲ content between the treatment and model groups of rats (＜0.01). Conclusion Vesiculation moxibustion has some preventive and therapeutic effects on rat hepatic fibrosis.

Acupoint application; Vesiculation therapy; Hepatic fibrosis; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.05.0460

2014-10-12

1005-0957(2015)05-0460-04

劉文吉(1988 - ),女,2012級碩士生

解秸萍(1961 - ),女,教授,E-mail:xiejieping@sina.com