玉米麩皮多糖對人結(jié)腸癌HT-29細胞增殖的抑制作用

徐偉麗，崔鵬舉，魯兆新，張?zhí)m威

(哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院，150090哈爾濱)

玉米生產(chǎn)加工過程中會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物玉米麩皮，其得率約為玉米原料量的10%～15%.因此，由玉米麩皮制備的多糖備受關(guān)注.目前，對于玉米麩皮多糖的研究主要集中于制備方法、降血糖、減肥降脂、抗便秘作用等［1-4］.有研究表明玉米皮多糖還可作為治療結(jié)腸癌的輔助手段［1］，但是還不清楚其確切的分子機制.本研究探討了玉米麩皮多糖體外對結(jié)腸癌HT-29細胞的抑制作用，為進行下一步的機制研究提供實驗依據(jù)，為開發(fā)腫瘤化學預防劑和保健食品的新資源奠定了理論基礎(chǔ).同時，促進了玉米加工副產(chǎn)物的深度開發(fā)利用，對于合理利用糧食資源、全面提高玉米加工產(chǎn)業(yè)的社會及經(jīng)濟效益有重要意義.

1 實驗

1.1 實驗材料

人結(jié)腸癌HT-29細胞購自協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)所細胞中心.玉米麩皮多糖:以玉米麩皮為原料，采用超臨界方法去除玉米麩皮中的油脂，采用淀粉酶、蛋白酶去除玉米麩皮中的淀粉、蛋白質(zhì).以水為提取溶劑，提取玉米麩皮多糖，濾液低溫減壓濃縮，醇沉，得水提玉米麩皮多糖.以水提后的水不溶物為原料，分別采用堿液和堿性過氧化氫溶液為提取劑，中和濾液，低溫減壓濃縮，醇沉，得堿提玉米麩皮多糖和堿性H2O2提玉米麩皮多糖.

1.2 實驗試劑

四氮唑藍(MTT)、RNA 酶、HEPES、DMSO、丙烯酰胺(Sigma Aldrich，美國);L-谷氨酰胺(原平皓公司，中國);RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清(Gibco公司，美國);Giemsa Stain(Amresco，美國);其余試劑均為分析純.

1.3 實驗儀器

Labo AutoCLAve高壓滅菌器、Program Oven干熱滅菌箱，日本SANYO公司;IX70倒置顯微鏡，日本Olympus公司;ELX800酶標儀，Bio-Tek公司;MODEL 5410 CO2培養(yǎng)箱，NAPCO公司.

1.4 細胞培養(yǎng)和處理

HT-29細胞在含有1%谷氨酰胺、10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，用0.02%EDTA/0.25%胰酶消化后進行傳代，取對數(shù)增殖期的細胞用于實驗.

對3種方法得到的玉米麩皮粗多糖(水提、堿提和堿性H2O2提玉米麩皮多糖)進行體外抗腫瘤作用研究.將多糖用改良型RPMI-1640培養(yǎng)液分別配制成10 g/L的溶液，0.22 μm濾膜過濾除菌，密封并于-20℃下保存，備用，使用時用培養(yǎng)基稀釋到所需質(zhì)量濃度.根據(jù)預實驗結(jié)果確定用于培養(yǎng)人結(jié)腸癌HT-29細胞的水提玉米麩皮多糖為 0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.10 g/L 6個劑量組，堿提和堿性H2O2提玉米麩皮多糖為0.02，0.10，0.50，2.50，10.00 g/L 5 個劑量組，腫瘤細胞加培養(yǎng)液為對照組.

1.5 細胞毒性檢測

細胞毒性參考文獻［5］進行檢測.取對數(shù)生長期HT-29細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成2.5×104mL-1的單細胞懸液，接種于96孔板中，每孔5×103個細胞.另設(shè)對照組.置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，換成含不同質(zhì)量濃度玉米麩皮多糖的培養(yǎng)液，從加藥第1天起，每天各取1塊96孔板進行MTT檢測，連續(xù)2 d，測出OD值.檢測玉米麩皮多糖對HT-29細胞生長的抑制情況及IC50.

1.6 細胞形態(tài)學觀察

將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁并達40%以上融合時，分別更換含有不同質(zhì)量濃度玉米麩皮多糖的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)指定的時間.在Olympus相差倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化，并進行拍照.

1.7 細胞核分裂指數(shù)

細胞核分裂指數(shù)參考文獻［5］進行檢測.將HT-29細胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1.0×104個細胞，每個劑量4個平行孔.細胞貼壁后，更換含不同質(zhì)量濃度玉米麩皮多糖的無血清培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24，48 h后，75%乙醇固定，Giemsa染色(稱Giemsa粉末0.5 g，加幾滴甘油研磨，再加入甘油33 mL.56℃保溫90～120 min.加入33 mL甲醇，置棕色瓶中保存，此為Giemsa原液.按要求用PBS稀釋10倍使用).計數(shù)1 000個細胞中所含分裂相的細胞數(shù)，求出分裂指數(shù)，并與對照組比較，計算抑制率.

分裂指數(shù)=分裂細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%;抑制率=(1-給藥組分裂指數(shù)/對照組分裂指

數(shù))×100%.

1.8 集落形成實驗

集落形成實驗參考文獻［5］進行.常規(guī)培養(yǎng)細胞，將HT-29細胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200個細胞，每組4個平行孔.培養(yǎng)24 h后更換含不同質(zhì)量濃度玉米麩皮多糖的培養(yǎng)液，再分別培養(yǎng)24和48 h后，換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10 d，甲醇固定，Giemsa染色，鏡下計數(shù)每孔＞50個細胞以上的集落數(shù)目，按下式計算:

集落形成率(%)=(每皿集落數(shù)/每皿接種細胞數(shù))×100;

集落形成抑制率(%)=(1-加藥組集落形成率/對照組集落形成率)×100.

1.9 統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異采用方差分析進行處理，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義.

2 實驗結(jié)果

2.1 玉米麩皮多糖對HT-29細胞的毒性作用

采用不同質(zhì)量濃度的玉米麩皮多糖處理HT-29細胞24和48 h，結(jié)果如圖1～3所示.隨著水提玉米麩皮多糖質(zhì)量濃度的增加和作用時間的延長，HT-29細胞的存活率呈下降趨勢(圖1).0.01 g/L的水提玉米麩皮多糖處理24 h，HT-29細胞的抑制率為6.9%，0.02 g/L的水提玉米麩皮多糖作用24和48 h對HT-29細胞抑制率分別為33.1%和60.6%，24 h的IC50值為0.053 g/L，48 h的IC50值為0.038 g/L.其他兩種多糖處理24和48 h對HT-29細胞的毒性作用不顯著(圖2，3).

圖1 水提玉米麩皮多糖對HT-29細胞存活的影響(x±s，n＝5)

圖2 堿提玉米麩皮多糖對HT-29細胞存活的影響(x±s，n＝5)

圖3 堿性H2O2提玉米麩皮多糖對HT-29細胞存活的影響(x±s，n＝5)

2.2 細胞形態(tài)觀察結(jié)果

采用倒置顯微鏡觀察不同方法獲得的多糖對細胞形態(tài)的影響，結(jié)果如圖4～6所示.對照組細胞形態(tài)正常，細胞呈菱形或不規(guī)則形，細胞體積大，生長緊密，細胞間隙小(圖4(a));經(jīng)過水提玉米麩皮多糖處理后，細胞體積和密度逐漸變小，附壁疏松、變圓.隨著多糖處理時間的延長和質(zhì)量濃度的增大，細胞貼壁能力明顯下降，脫落增加，飄浮于培養(yǎng)液中，細胞破裂、壞死增多.在低質(zhì)量濃度下(0.02 g/L)處理HT-29細胞96 h，細胞克隆形態(tài)多樣，多數(shù)呈團塊狀、島狀或巢狀，隨時間的延長愈明顯(圖4(b)～(d)).堿提玉米麩皮多糖和堿性H2O2提玉米麩皮多糖 對HT-29細胞的抑制作用不明顯，10 g/L處理96 h才表現(xiàn)出抑制作用，細胞形態(tài)略有變化(圖5(f)和圖6(f)).根據(jù)MTT實驗和形態(tài)學觀察結(jié)果，后面實驗僅對水提玉米麩皮多糖進行檢測.

圖4 水提玉米麩皮多糖對HT-29細胞生長形態(tài)的影響(100×)

2.3 細胞核分裂指數(shù)結(jié)果

細胞核分裂指數(shù)結(jié)果見表1，不同質(zhì)量濃度的水提玉米麩皮多糖處理24和48 h抑制率分別為9.0%～41.0%和19.8%～67.9%.隨著劑量的增加和時間的延長，水提玉米麩皮多糖對細胞有絲分裂的抑制作用增強.

2.4 細胞的集落形成結(jié)果

細胞的集落形成結(jié)果見表2.水提玉米麩皮多糖各劑量組與對照組相比，對結(jié)腸癌HT-29細胞集落形成均有抑制作用，且隨劑量的增加抑制作用增強.0.1 g/L的水提玉米麩皮多糖作用48 h，集落形成抑制率達88.1%.該結(jié)果顯示水提玉米麩皮多糖能夠有效抑制HT-29細胞的集落形成.

圖5 堿提玉米麩皮多糖對HT-29細胞生長形態(tài)的影響(100×)

圖6 堿性H2O2提玉米麩皮多糖對HT-29細胞生長形態(tài)的影響(100×)

表1 水提玉米麩皮多糖處理對HT-29細胞分裂指數(shù)的影響±s，n＝4)

表1 水提玉米麩皮多糖處理對HT-29細胞分裂指數(shù)的影響±s，n＝4)

* P＜0.05與對照組相比.

組別/(g·L-1)癌細胞有絲分裂數(shù)24 h 48 h分裂指數(shù)/%24 h 48 h抑制率 /%24 h 48 h對照 556.0±4.7 786.0±3.8 27.8 39.3 — —0.01 506.1±3.2 630.0±4.1 25.3 31.5 9.0 19.8 0.02 434.2±2.7 366.0±3.4* 21.7 18.3 21.9 53.4 0.10 328.0±3.1* 252.3±2.2* 16.4 12.6 41.0 67.9

表2 水提玉米麩皮多糖處理對HT-29細胞集落形成能力的影響±s，n＝4)

表2 水提玉米麩皮多糖處理對HT-29細胞集落形成能力的影響±s，n＝4)

* P＜0.05與對照組相比.

組別/(g·L-1)集落數(shù)/孔24 h 48 h集落形成率/%24 h 48 h抑制率/%24 h 48 h對照 28.5±4.0 29.6±3.3 15.1 15.9 — —0.01 22.0±3.1 18.1±2.1* 11.5 10.1 23.8 36.5 0.02 13.1±2.6* 9.7±1.1* 8.6 6.9 43.0 56.6 0.10 7.6±1.9* 4.6±1.3* 3.1 1.9 79.5 88.1

3 討 論

流行病學統(tǒng)計表明［6-7］:全谷物食品中的多糖可以保護機體免受自由基的傷害，還可抵抗一些慢性疾病，如冠心病、糖尿病和癌癥等.大多數(shù)動物實驗和流行病學資料也表明，高纖維膳食可明顯降低結(jié)腸癌的發(fā)病率［8］.各種來源的纖維素都具有預防結(jié)腸癌的作用，半纖維素也有抗癌作用，但由于成分較復雜，目前對其單一成分的研究報道不多.玉米多糖包括玉米麩皮、玉米子粒、玉米須和玉米花粉多糖.玉米麩皮多糖因其制備原料豐富而備受關(guān)注，可將其作為保健食品或保健食品原料使用［9］.

目前，關(guān)于玉米麩皮多糖的研究主要集中在提取［10-11］、純化［12-14］、化學結(jié)構(gòu)［14-16］及生理活性.國內(nèi)外的研究已證實玉米麩皮多糖具有抑制肝損傷、減肥降脂、抗便秘及降血糖等生物活性［1-4］.迄今為止，關(guān)于玉米麩皮多糖對腫瘤的抑制作用及其機制的研究均未見報道.

前期實驗結(jié)果表明，水提玉米麩皮多糖具有良好的抗氧化活性，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，抗氧化性與質(zhì)量濃度呈正相關(guān);本研究中MTT實驗表明，水提玉米麩皮多糖的抗增殖作用與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，堿提法和堿性H2O2法提取的玉米麩皮多糖對HT-29細胞的毒性作用不明顯.HT-29細胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度(0，0.02，0.1，0.5，2.5 和10 g/L)的水提玉米麩皮多糖處理后，細胞生長緩慢，附壁疏松、變圓，細胞體積減小;經(jīng)0.1 g/L以及高于此質(zhì)量濃度的多糖處理后的HT-29細胞，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞脫落增加，飄浮于培養(yǎng)液中，細胞破裂、壞死增多.細胞發(fā)生這一系列變化可能與玉米麩皮多糖作用腫瘤細胞后，引起腫瘤細胞的細胞器和細胞膜的變化，如線粒體腫脹、糖原合成分泌增加有關(guān).同時，水提玉米麩皮多糖能夠抑制HT-29細胞有絲分裂數(shù)和集落形成率，并呈時間和劑量效應.綜上，在抗氧化性和抗腫瘤作用方面水提玉米麩皮多糖均優(yōu)于堿提法和堿性H2O2法提取的玉米麩皮多糖，這可能是由于在采用堿和/或堿性H2O2提取的過程中，多糖的某些功能部分的活性喪失或減弱，因此，擬采用水提玉米皮多糖進行后續(xù)實驗.本研究為下一步對水提玉米麩皮多糖抑制HT-29細胞生長作用機理的研究奠定了實驗基礎(chǔ).

［1］DAIZO A，EGASHIRA Y，SANADA H.Suppressive effect of corn bran hemicellulose on liver injury induced by D-galactosamine in rats［J］.Nutrition，2005，21(10):1044-51.

［2］張艷榮，劉婷婷，王大為.玉米活性多糖減肥降脂作用的研究［J］.食品科學，2006，27(5):227-230.

［3］張艷榮，張雁南，王大為.玉米皮活性多糖的抗便秘作用［J］.吉林大學學報:醫(yī)學版，2005，31(4):509-511.

［4］張艷榮，陳麗娜，王大為.玉米活性多糖對糖尿病小鼠的降血糖作用［J］.吉林大學學報:醫(yī)學版，2005，31(6):846-848.

［5］XU Weili，LIU Jiaren，LIU Huikun，et al.Inhibition of proliferation and induction of apoptosis by γ-tocotrienol in human colon carcinoma HT-29 cells［J］.Nutrition，2009，25(5):555-566.

［6］DECKER E，BEECHER G，SLAVIN J.Whole grains as a source of antioxidants ［J］.Cereal Foods World，2002，47(8):370-373.

［7］GOODLAD R A，ENGLYST H N.Redefining dietary fibre:potentially a recipe for disaster ［J］.Lancet，2001，358:1833-1834.

［8］LUP T J.Is fibre protective agaist colon cancer?Where the research is leading us［J］.Nutrition，2000，16:558-561.

［9］CLEMENS R.Redefining fiber［J］.Food Technology，2001，55(2):100-101.

［10］BENKO Z，ANDERSSON A，SZENGYEL Z，et al.Heat extraction of corn fiber hemicellulose［J］.Appl Biochem Biotechnol，2007，137-140(1-12):253-265.

［11］LEATHERS T D，NUNNALLY M S，PRICE N P.Price co-production of schizophyllan and arabinoxylan from corn fiber［J］.Biotechnol Lett，2006，28(9):623-626.

［12］YADAV M P，PARRIS N，JOHNSTON D B，et al.Fractionation， characterization， and study of the emulsifying properties of corn fiber Gum ［J］.J Agric Food Chem，2008，56(11):4181-4187.

［13］ALLERDINGS E，RALPH J，STEINHART H，et al.Isolation and structural identification of complex feruloylated heteroxylan side-chains from maize bran［J］.Phytochemistry，2006，67(12):1276-1286.

［14］張艷榮，劉相陽，于君，等.玉米皮多糖的組成及結(jié)構(gòu)［J］.食品科學，2011，32(3):64-67.

［15］蘆菲，李波，李春陽，等.玉米皮多糖的制備方法及結(jié)構(gòu)研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36(17):7445-7446，7495.

［16］SAULNIER L，CREPEAU M J，LAHAYE M，et al.Isolation and structural determination of two 5，5＇-diferuloyl oligosaccharides indicate that maize heteroxylans are covalently cross-linked by oxidatively coupled ferulates［J］.Carbohydrate Research，1999，320(1):82-92.