ICAM-1 469K/E基因多態(tài)性與突發(fā)性聾的相關(guān)性研究

張芳　田廣永　黃仲曦　段永暢　楊靜雅　唐玲南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院圖書館

ICAM-1 469K/E基因多態(tài)性與突發(fā)性聾的相關(guān)性研究

張芳田廣永黃仲曦段永暢楊靜雅唐玲
南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院圖書館

目的探討細(xì)胞粘附分子-1（ICAM-1）469K/E基因多態(tài)性是否與突發(fā)性聾存在相關(guān)性。方法 按照入選標(biāo)準(zhǔn)共選取了240例研究對象，包括突發(fā)性聾患者75例（男39例，女36例），對照者165例（男86，女79例），分別抽取2ml外周靜脈血，提取DNA，PCR擴增目的片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性酶切后行瓊脂凝膠電泳，以此確定所有研究對象ICAM-1 469K/E的基因分型。通過統(tǒng)計分析明確ICAM-1 469K/E與突發(fā)性聾是否相關(guān)。 結(jié)果 兩組之間ICAM-1 469K/E基因分型及等位基因分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在不同聽力下降類型中ICAM-1 469K/E基因多態(tài)性分布頻率存在差異，聽力平坦下降型攜帶E等位基因的基因型及E等位基因分布頻率高于其他聽力下降類型，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 ICAM-1 469K/E基因多態(tài)性與突發(fā)性聾不存在明顯的相關(guān)性，攜帶E等位基因可能是引起聽力平坦下降的危險因素。

突發(fā)性聾；ICAM-1；基因多態(tài)性

突發(fā)性聾（以下簡稱突聾）是指72h內(nèi)突然發(fā)生的、至少在相鄰的兩個頻率聽力下降≥20dBHL的感音神經(jīng)性聽力損失，其病因尚未明確［1］。主要的病因假說包括病毒感染、內(nèi)耳微循環(huán)障礙、自身免疫疾病、脂質(zhì)代謝紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常等，其中內(nèi)耳微循環(huán)障礙被認(rèn)為是不同病因最后致病過程中的共同途徑［2］。目前認(rèn)為突發(fā)性聾是一種多因素疾病，可能由遺傳因素及環(huán)境因素相互作用引起。遺傳因素在突聾發(fā)病中的作用，以及對疾病進(jìn)展、預(yù)后的影響是新的研究熱點。

內(nèi)聽動脈亦稱為迷路動脈，與頸內(nèi)、頸外動脈吻合支纖細(xì)，因缺少有效的側(cè)支循環(huán)，易引起內(nèi)耳缺血。位于耳蝸的毛細(xì)胞對于缺血極其敏感，缺血1小時后即可導(dǎo)致毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)上不可逆的改變［3］。結(jié)合內(nèi)耳血供、毛細(xì)胞的生理特點，以發(fā)病急、病程進(jìn)展快為主要臨床特征的突發(fā)性聾類似于心血管事件。而動脈粥樣硬化在心血管事件中發(fā)揮著重要的作用，越來越多研究表明動脈粥樣硬化是慢性血管炎癥性疾病。在冠心病和突聾患者血漿中均發(fā)現(xiàn)炎性標(biāo)記物表達(dá)升高［4，5］。突聾的影像學(xué)研究亦提示炎癥可能參與疾病的發(fā)生發(fā)展。Berretini等［6］通過的3D-FLAIR MRI成像發(fā)現(xiàn)突聾患者內(nèi)耳信號強度增高，提示內(nèi)耳有輕度出血、急性炎癥反應(yīng)以及血迷路屏障障礙的現(xiàn)象。同樣在Yoshida等［7］對突聾患者3D-FLAIR MRI成像中，內(nèi)耳高信號提示炎癥可能參與突聾的發(fā)病過程，并影響疾病預(yù)后?；虻母淖兛捎绊戅D(zhuǎn)錄及翻譯，從而使相應(yīng)的產(chǎn)物含量、生物活性發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)炎癥相關(guān)基因的多態(tài)性與突發(fā)性聾的發(fā)病及預(yù)后存在相關(guān)性。迄今為止，提出的存在這種相關(guān)性的基因有IL-1β（-511C/T、+3953C/T）、IL-1 889C/T、IL-6 174G/G、IL-6 C-572G、IL-4R Q576R等等［8-12］。盡管已發(fā)現(xiàn)這些炎癥因子多態(tài)性與突聾存在相關(guān)性，但突聾的遺傳易感基因仍未完全明確。為了能夠找到突聾的易感基因，有必要對其他炎癥相關(guān)的候選基因進(jìn)行研究。Quaranta等［13］通過病例對照研究發(fā)現(xiàn)，突發(fā)性聾患者血漿中ICAM-1含量顯著升高（p＜0.001），提示ICAM-1含量變化與突聾的發(fā)病存在相關(guān)性。研究表明ICAM-1基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化存在明顯的相關(guān)性［14，15］。但目前關(guān)于ICAM-1基因多態(tài)性與突發(fā)性聾的相關(guān)性研究，國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。我們利用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR-RFLP）技術(shù)檢測ICAM-1 469K/E多態(tài)性，探討ICAM-1 469K/E多態(tài)性與突發(fā)性聾發(fā)病及預(yù)后的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1研究對象

選取從2014年6月至2015年7月在耳鼻咽喉頭頸外科門診就診的75例突聾患者為病例組，從健康體檢中心選取165對照者。病例組入選的標(biāo)準(zhǔn)為：突發(fā)性聽力下降，純音聽閾（PTA）為至少在相鄰的2個頻率聽力下降20dB的感音神經(jīng)性聽力損失，排除遺傳性聾、老年性聾、噪音性聾、中毒性聾、自身免疫相關(guān)性耳聾，以及其他中耳疾病導(dǎo)致的耳聾，所有患者均行MRI檢查以排除聽神經(jīng)瘤。對照組入選的標(biāo)準(zhǔn)為：年齡＜80歲，既往無慢性中耳疾病、聽力下降的病史。根據(jù)聽力受損所累及的頻率和程度，將突發(fā)性聾分為以下四種類型：低頻下降型（≤1000Hz，聽力受損≥20dBHL）；高頻下降型（≥2000Hz，聽力受損≥20dBHL）；平坦下降型（所有頻率聽力均下降，平均聽閾≤80dBHL）；全聾型：（所有頻率聽力均下降，且平均聽閾≥80dBHL）。

1.2標(biāo)本采集及DNA提取

EDTA抗凝管采集所有研究對象外周靜脈血2ml，利用全組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，保存于-80℃冰箱備用。

1.3ICAM-1 469K/E基因分型的測定

利用PCR-RFLP檢測其多態(tài)性，PCR引物序列如下：上游：5'-AGGATGGCACTTTCCCACT-3'，下游：5'-GGCTCACTCACAGAGCACAT-3'。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，68℃退火45s，72℃延伸60s，共20個循環(huán)，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共20個循環(huán)，最后72℃延伸7min。擴增產(chǎn)物經(jīng)BstUI酶限制性酶切后進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，結(jié)果見圖1。通過直接測序法對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗證，測序反應(yīng)由上海生工完成。

1.4統(tǒng)計分析

利用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組間連續(xù)變量的比較采用獨立樣本t檢驗，Hardy-Weinberg平衡符合程度、基因分型采用卡方檢驗。多因素回歸分析校正混雜因素對基因多態(tài)性與突聾相關(guān)性造成的影響。

圖1.M：DNA梯狀標(biāo)記；3、6：KK純合基因型；1、4、5和7：KE雜合基因型；2、8：EE純合基因型

2　結(jié)果

2.1研究對象臨床特征

本研究選取了≥18歲的240名研究對象，其中75例突發(fā)性聾病例（男39人，女36人），165名對照者（男86人，女79人）。所有研究對象的人口學(xué)特征以及生活習(xí)慣相關(guān)疾病的統(tǒng)計情況見表1。兩組間性別、糖尿病以及高脂血癥差異無統(tǒng)計學(xué)意義。病例組年齡和高血壓的發(fā)病率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2ICAM-1 469K/E基因多態(tài)分布情況

ICAM-1 469K/E基因多態(tài)分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律。各基因型和等位基因在兩組中的分布情況見表2。病例組中KK基因型（44%）低于對照組（55.8%），而攜帶E等位基因的KE+EE基因型頻率（56%）高于對照組（44.2%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.229）。在等位基因分布中發(fā)現(xiàn)，病例組K等位基因（64%）低于對照組（72.1%），而E等位基因頻率（36%）則高于對照組（27.9%），然而等位基因分布差異仍無顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.073）。為探討ICAM-1 469K/E基因多態(tài)性在不同的聽力下降類型是否存在差異，我們進(jìn)一步分析了ICAM-1 469K/ E基因多態(tài)性在不同聽力類型中的分布情況。結(jié)果示在低頻聽力下降的突聾患者中，KK基因型高于攜帶E等位基因的KE+EE基因型，攜帶的K等位基因明顯高于E等位基因，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在平坦下降型中結(jié)果與之相反，攜帶E等位基因的KE+ EE基因型高于KK基因型，E等位基因高于K等位基因，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），此外聽力平坦下降型攜帶的E等位基因高于其他聽力下降類型。

表1　病例組和對照組臨床基本特征

表2　兩組ICAM-1 469K/E各基因型和等位基因分布頻率

2.3多因素logistic回歸分析

在三種遺傳模型中，對性別、年齡、高血壓、高脂血癥、糖尿病進(jìn)行調(diào)整（詳見表4）。通過logistic分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)整前顯性遺傳模型P值接近0.05，但在調(diào)整后P值增大，在調(diào)整前后三種模型的ORs均無顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。

3　討論

ICAM-1是一種跨膜單鏈糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族中的一員，在白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中均有表達(dá)［16］。存在于白細(xì)胞中ICAM-1是淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（LFA-1：CD11a/CD18）和巨噬細(xì)胞抗原復(fù)合體（Mac-1：CD11b/CD18）的配體，在白細(xì)胞遷移和穩(wěn)定細(xì)胞間粘附中發(fā)揮著重要作用。通過p38和ERK1/2MAPK信號通路，ICAM-1可誘導(dǎo)IL-1α、IL-1β、IL-6以及TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展［17］。ICAM-1作為重要的炎癥標(biāo)志物，通過促進(jìn)白細(xì)胞浸潤和粘附于血管內(nèi)皮，參與動脈粥樣硬化的形成。研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1的含量在心絞痛發(fā)作后10h內(nèi)顯著升高，并在隨后的6個月內(nèi)呈逐漸上升趨勢［18］。Hajilooi等［19］研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照者相比較，冠心病患者血漿中sICAM-1的含量顯著升高（p＜0.04），并通過多因素logistic回歸分析表明sICAM-1是冠心病發(fā)病的獨立危險因素。

表3　各基因型和等位基因在病例組四種聽力下降類型中的分布情況

編碼人類ICAM-1的基因位于19號染色體p13.2-p13.3，由7個外顯子、6個內(nèi)含子、2、4kb的上游序列以及1.5kb的3'非編碼序列組成，在第4外顯子241位點、第6外顯子469位點各存在一個功能性多態(tài)位點［20］。但因ICAM-1 241G/R基因多態(tài)性在中國漢族人群中較罕見［21］，所以我們選擇了ICAM-1 469K/E作為研究對象。我們分析了75例突聾患者和165例對照者的ICAM-1基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)病例組中攜帶E等位基因的基因型，以及E等位基因分布頻率高于對照組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。在三種遺傳模型中，利用多因素logistic回歸分析以校正年齡、性別等因素對ICAM-1 469K/E基因多態(tài)性與突聾相關(guān)性造成的影響，但調(diào)整前后ORs均無統(tǒng)計學(xué)意義，表明ICAM-1 469K/E基因多態(tài)性不是突聾發(fā)病的危險因素。但在不同聽力下降類型中ICAM-1 469K/E基因多態(tài)性分布頻率存在差異，病例組E等位基因的分布頻率，聽力平坦下降型高于其他聽力下降類型，且平坦下降型突聾患者攜帶的E等位基因顯著高于K等位基因，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。目前認(rèn)為不同的聽力類型可能存在不同的發(fā)病機制，聽力平坦下降型與血管紋功能障礙或內(nèi)耳血管痙攣相關(guān)［1］。ICAM-1 469K/E基因多態(tài)性在平坦下降型的分布情況提示，E等位基因可能是引起內(nèi)耳微循環(huán)及血管紋功能障礙的危險因素。攜帶E等位基因可能使ICAM-1含量或者結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，級聯(lián)放大炎癥反應(yīng)，損傷血管內(nèi)皮，引起微循環(huán)障礙。本研究為明確ICAM-1 469K/E基因多態(tài)性與突聾是否存在相關(guān)性提供了參考依據(jù)，基因多態(tài)性分布存在種族和地域差異，ICAM-1469K/E基因多態(tài)性與突聾的相關(guān)性的研究在不同人種、不同地區(qū)可能會出現(xiàn)不一樣的結(jié)果。因此，因此，對于明確ICAM-1 469K/E基因多態(tài)性與突聾是否存在相關(guān)性，以及攜帶E等位基因是否成為血管紋功能障礙或內(nèi)耳血管痙攣的高危因素，仍需進(jìn)行多中心、多種群、大樣本的研究。

表4　ICAM-1 469K/E與突聾相關(guān)性的ORs和95%CI

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Association of ICAM-1 gene polymorphism with sudden sensorineural hearing loss

ZHANG Fang，TIAN Guangyong，HUANG Zhongxi，DUAN Yongchang，YANG Jingya，TANG Ling
1 Department of Otorhinolaryngology，Third Affiliated Hospital of Southern Medical University 2 Institute of Oncology，Basic Medical Sciences College of Southern Medical University. 3 Department of Library，Third Affiliated Hospital of Southern Medical University Corresponding author：TIAN GuangyongEmail：782683004@qq.com

Objective To determine the relationship between the 469K/E polymorphism(rs5498)of the ICAM-1 gene and sudden sensorineural hearing loss.Methods Subjects used in this study were derived from the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University.Two milliliters of venous blood were obtained from each participant for genomic DNA extraction.Detection of SNPs rs5498 was performed by polymerase chain reaction(PCR),followed by restriction fragment length polymorphism(RFLP)analysis.The restriction enzyme-digested PCR products were analyzed by 2%agarose gel electrophoresis.The Chi-square test was used to compare the frequency of alleles and genotypes between case and control groups.Results Seventy-five SSNHL patients(39 male and 36 female patients)were compared with 165 controls(86 male and 79 female subjects)enrolled in this study from June 2014 to July 2015.No significant differences in ICAM-1 469K/E genotype and allele frequencies were found between the SSNHL group and controls.However,there were significant differences in ICAM-1 469K/E polymorphism between patients with different types of hearing loss.Conclusion Our study results do not show significant association between 469K/E polymorphism of the ICAM-1 gene and sudden sensorineural hearing loss.The E allele may influence the susceptibility to the development of flat type of hearing loss.

sudden sensorineural hearing loss；ICAM-1；polymorphism.

R764.437

A

1672-2922（2015）04-726-4

2015-10-9審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.04.039

張芳，碩士，研究方向：耳科學(xué)

田廣永，Email：782683004@qq.com