長治地區(qū)19113例新生兒耳聾基因檢測

李曉澤　馬衛(wèi)平　胡志鵬　藥澤蓉　魏魏山西省長治市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳室（長治046011）

·臨床研究·

長治地區(qū)19113例新生兒耳聾基因檢測

李曉澤馬衛(wèi)平胡志鵬藥澤蓉魏魏
山西省長治市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳室（長治046011）

目的用耳聾基因芯片方法檢測19113名新生兒是否存在中國人常見耳聾基因的異常。方法采集2013年6月-12月長治市轄區(qū)內(nèi)出生的19113名新生兒足跟血并提取DNA，應(yīng)用耳聾基因芯片檢測4個常見耳聾基因的9個突變位點，包括GJB2（35 del G，176_191del 16，235 del C，299_300 del AT）、GJB3 （538 C＞T）、SLC26A4（IVS 7-2 A＞G，2168 A＞G）和線粒體DNA 12S rRNA（1555 A＞G，1494 C＞T）。同時對19113名新生兒的基本信息進行了調(diào)查，包括聽力學(xué)檢查。結(jié)果 19113名新生兒中，共檢測出耳聾基因異常者984例（5.15%），其中GJB2基因雜合突變437例（2.29%），235de1C純合突變2例（0.01%），線粒體DNA 12S rRNA突變66例（0.35%），SLC26A4基因雜合突變型395例（2.07%），GJB3基因雜合突變62例（0.32%），雙雜合突變型22例（0.12%）。結(jié)論長治地區(qū)新生兒常見耳聾基因突變以GJB2基因突變、SLC26A4基因突變?yōu)橹??；蛲蛔兟室猿菂^(qū)、長治縣和襄垣縣居多，新生兒耳聾基因篩查可以對藥物性耳聾、PDS綜合征等聽力篩查無法檢測的遲發(fā)性耳聾進行檢測。

新生兒；耳聾基因；突變；基因芯片

耳聾是常見的殘疾之一?？茖W(xué)家研究顯示，超過60%的耳聾是由遺傳因素造成的［1］。據(jù)統(tǒng)計，每1000個新生兒中就有1～3例聾兒。2013年召開的世界衛(wèi)生組織全球防聾合作中心會議暨中國聽力論壇上報告顯示，我國現(xiàn)有聽力殘疾者2780萬人，其中，0～6歲聽障兒童約13.7萬，且每年以2.3萬的數(shù)量遞增［1-2］，而其中至少一半的聾兒是由于遺傳缺陷引起的，可見遺傳因素在致聾中所起的重要作用［3］。因此，正確作出病因分析，提出早期干預(yù)措施，是降低耳聾發(fā)生的有效途徑。本研究應(yīng)用耳聾基因芯片技術(shù)對19113例新生兒進行常見遺傳性耳聾基因的診斷，結(jié)合傳統(tǒng)的新生兒聽力篩查，更加全面的對新生兒進行聽力學(xué)的篩查，避免耳聾發(fā)生。

1　對象與方法

1.1研究對象

2013年6月-12月長治市轄區(qū)內(nèi)出生的19113名新生兒，收集研究對象基本信息患者的聽力學(xué)檢查。采集19113名新生兒足跟血2滴并密封保存，提取DNA，進行耳聾基因檢測。

1.2儀器德國chemagen全自動DNA提取儀晶芯?SlideWasher8芯片洗干儀、長風(fēng)XMTD6000水浴箱、晶芯?LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀-523nm、BIOER Life Express PCR儀、微量核酸濃度測定儀。

1.3試劑

對984例耳聾基因突變者按地區(qū)進行分析，可見城區(qū)、長治縣和襄垣縣突變率居各縣市區(qū)首位，分別為8.26%、5.51%和4.99%。見表3。

1.4實驗方法

1.4.1血片DNA的提取

用德國PE公司的CMG-777全自動DNA提取儀提取干血片DNA 50μl。

1.5質(zhì)量控制

1.4.2PCR擴增

術(shù)后隨訪6個月～4年，其中1例雙側(cè)聲帶乳頭狀瘤患者分別于術(shù)后3個月、10個月復(fù)發(fā)，再次給于CO2切除，其中一例未復(fù)發(fā)，1例復(fù)發(fā)并癌變，行額側(cè)喉部分切除。其余17例治愈。其中2例發(fā)生聲帶前部粘連。所有患者術(shù)后均未出現(xiàn)呼吸困難、出血等并發(fā)癥發(fā)生。

1.4.2.1PCR反應(yīng)體系：

25μl的PCR反應(yīng)體系包括：PCR擴增試劑引物混合物A 20 μl，模板DNA5.0 μl；PCR擴增試劑引物混合物B 20 μl，模板DNA 5.0 μl。

1.4.2.2PCR擴增程序

（以0.5℃/s的速度從94℃降溫至55℃；以0. 2℃/s的速度從55℃升溫至70℃）擴增程序見表1。

影響蜂蜜黏度的關(guān)鍵因素是溫度和蜂蜜的含水量，在5 ℃～25 ℃范圍內(nèi)，蜂蜜的黏度隨溫度升高而降低，隨含水量升高而降低且含水量越低的蜂蜜黏度對溫度的變化越敏感。

1.4.3芯片雜交

按每份樣品4 μ1磁珠和20 μ1結(jié)合液進行配制，混勻后分裝到8聯(lián)排管中。將擴增好的產(chǎn)物A、B分別取10 μ1加入到配制好的磁珠中，混勻后靜置10min，磁力板吸附棄廢液，每份樣品中加入0.1mol/L NaOH 60μ1，混勻，靜置10min，磁力板吸附棄廢液，再加入提前50℃預(yù)熱的雜交緩沖液40μ1，磁力板吸附棄廢液，加入20μ1雜交緩沖液。將雜交反應(yīng)混合物經(jīng)蓋片上的加樣孔垂直加入14 μ1雜交混合物，迅速蓋上雜交盒蓋并密封。將密封好的雜交盒水平放入50℃預(yù)熱的水浴箱中雜交60 min。

1.4.4芯片洗滌

雜交反應(yīng)結(jié)束后，將雜交盒水平取出拆開，將芯片取出，放入芯片洗滌機中按程序進行洗滌，洗滌完成后放入芯片甩干機中離心3-5min。

1.4.5芯片掃描

DNA提取、PCR擴增、雜交過程的所有試劑及器皿均進行嚴(yán)格的消毒。對無法判斷結(jié)果的樣品進行重復(fù)實驗，并隨機抽取5%樣品進行重復(fù)實驗。樣品DNA濃度純度測定按照5%進行抽檢，濃度純度均達(dá)到實驗要求。

1.4.6結(jié)果判讀

QC：表面化學(xué)質(zhì)控探針　PC：雜交陽性對照探針I(yè)C：基因擴增內(nèi)對照探針　BC：空白對照探針NC：陰性對照探針　MC：磁珠質(zhì)控探針

若在同個位點中W行檢測數(shù)據(jù)為陽性，同時M行為陰性，判讀結(jié)果為該位點野生型；若在同個位點中W行檢測數(shù)據(jù)為陽性，同時M行為陽性，判讀結(jié)果為該位點突變雜合型；若在同個位點中W行檢測數(shù)據(jù)為陰性，同時M行為陽性，判讀結(jié)果為該位點突變純合型。

根據(jù)全省閃電監(jiān)測數(shù)據(jù)分析顯示,7月27日19:00—20:00,在事發(fā)地5 km范圍內(nèi),共監(jiān)測到4次負(fù)地閃,強度分別為25.7～43.6 kA,地閃位置距離事發(fā)地分別為0.97～3.46 km。廊橋附近的監(jiān)控視頻顯示,27日19:35事發(fā)前后,廊橋所在地出現(xiàn)大風(fēng)、雷電、降雨等天氣。

為了進一步刻畫研究區(qū)縣域經(jīng)濟的時間演變特征，采用ArcGIS的自然間斷點分級法，將綜合經(jīng)濟得分排名變化劃分為三類，分別表示綜合實力穩(wěn)定區(qū)、綜合實力上升區(qū)和綜合實力下降區(qū)三種類型，繪制了2000—2015年成都平原城市群縣域經(jīng)濟發(fā)展水平變化圖(見圖1).

使用晶芯?LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀進行芯片掃描，使用晶芯?遺傳性耳聾基因檢測芯片判別系統(tǒng)進行信號的讀取及判斷。

表1　PCR擴增程序

表2　19113例耳聾患者耳聾基因檢測結(jié)果

2　結(jié)果

2.119113例新生兒耳聾基因檢測結(jié)果

440C高碳高鉻馬氏體不銹鋼鍛件是公司承接的某公司用軸承應(yīng)力環(huán)鍛件。兩批次鍛件的理化試樣在長時間退火后進行淬火，在淬火冷卻過程中和冷處理過程中均出現(xiàn)了開裂現(xiàn)象。為找出斷裂失效原因，對淬裂樣件進行了分析檢測。

19113名新生兒中，共檢測出耳聾基因異常者984例（5.15%），其中GJB2基因雜合突變437例（2.30%），235de1C純合突變2例（0.01%），線粒體DNA 12S rRNA突變66例（0.34%），SLC26A4基因雜合突變型395例（2.07%），GJB3基因雜合突變62例（0.32%），雙雜合突變型22例（0.11%）。見表2。

2.3耳聾基因和聽力篩查結(jié)果

米九每次卸貨的時候和措姆、登子一起進營業(yè)部大院。有幾次休息時，甲洛洛看到米九正用手指頭沾塵土中掉落的幾粒白糖吃，有些時候給他一個裝豆瓣的竹條籠子，他高興得像個孩子，一路舔著竹條上的豆瓣走回家。可甲洛洛不敢肯定他看到的這些是否是真的，因為這么多年的經(jīng)驗告訴他：表象是最不可靠的。

德國全自動提取樣本DNA，耳聾基因檢測用博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯?遺傳性耳聾基因檢測芯片試劑盒（24人份）。

2.2地域性結(jié)果

19113例新生兒均進行了聽力篩查，其中未通過的有39人，均無耳聾家族史，其中耳聾基因異常未通過者有4人，突變類型為235de1C純合突變2人、235de1C雜合突變2人。

學(xué)生的思想品德形成過程中，情感起著“穿針引線”的作用?？梢哉f，學(xué)生的情感因素對整個教學(xué)活動有很大的引導(dǎo)、激勵、強化作用。因此，在品德課教學(xué)活動設(shè)計時，教師要更多地設(shè)計能激發(fā)學(xué)生情感的活動，有助于挖掘?qū)W生的內(nèi)心體驗，喚起、強化、升華學(xué)生的道德情感，使情理交融，從而促進品德內(nèi)化。

3　討論

耳聾是影響人類健康的一種常見疾病，也是臨床上常見的遺傳性疾病。研究表明，遺傳性耳聾約占耳聾患者的60%，其中75%-80%為常染色體隱性遺傳，10%-20%為常染色體顯性遺傳，其余為X連鎖和線粒體遺傳等［4］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國遺傳性耳聾人群以GJB2、GJB3、PDS和線粒體12S rRNA基因突變?yōu)橹鳎?-7］。此外，我國幅員遼闊，各地區(qū)在耳聾基因突變熱點的分布頻率上有一定差異。本研究進行的新生兒耳聾基因篩查是長治市政府組織的惠民工程項目，通過對本地區(qū)新生兒進行聽力篩查和耳聾基因篩查，了解當(dāng)?shù)卣Ｈ巳褐羞z傳性耳聾所占比例及常見耳聾基因突變位點的分布，篩選檢出率較高的致聾突變位點和未見常見耳聾基因突變位點的病例，為減少耳聾患者提供依據(jù)。

當(dāng)今社會醫(yī)患矛盾異常尖銳，患者對醫(yī)生的信任與滿意度下降，這與醫(yī)生的素質(zhì)密切相關(guān)。醫(yī)生應(yīng)自覺成為醫(yī)學(xué)本身規(guī)律和目的的捍衛(wèi)者，積極把握醫(yī)學(xué)發(fā)展方向和速度，努力參與到醫(yī)療體制改革中來，自覺抵制過度追逐名利、過度依賴儀器設(shè)備的行為，自覺追求醫(yī)學(xué)行業(yè)自誕生起便倡導(dǎo)的職業(yè)道德[5]。為了減少醫(yī)患糾紛，醫(yī)學(xué)教育需要從提升醫(yī)學(xué)生職業(yè)素養(yǎng)入手，為社會輸送具有崇高職業(yè)理想、職業(yè)信念、職業(yè)道德的高素質(zhì)醫(yī)學(xué)人才，將醫(yī)學(xué)生思想政治教育與職業(yè)素養(yǎng)培育相結(jié)合。

本研究采用博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯?九項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒對19113名新生兒的4個耳聾相關(guān)基因9個突變位點進行了檢測。研究發(fā)現(xiàn)，長治地區(qū)正常人群中耳聾基因突變位點以IVS 7-2 A＞G（1.86）和235 del C（1.73%）最多，顯示SLC26A4基因IVS 7-2 A＞G雜合突變和GJB2基因235de1C雜合突變?yōu)楸镜貐^(qū)耳聾基因熱點突變點，與多個研究中的結(jié)果相一致［8］。

勝利油田直井長縫壓裂應(yīng)用效果研究………………………………………………………………………………張軍峰（4.17）

長治地區(qū)13個縣市區(qū)耳聾基因突變類型地域性分布結(jié)果顯示城區(qū)、長治 縣和襄垣縣突變率居各縣市區(qū)首位，分別為8.26%、5.51%和4.99%。這些地區(qū)呈現(xiàn)高突變率趨勢的原因，有待于進一步研究（環(huán)境污染是否導(dǎo)致遺傳性耳聾突變尚無定論，如有相關(guān)報道或考慮相關(guān)性的依據(jù)，可提出）。

研究中我們發(fā)現(xiàn)單純進行聽力篩查可為耳聾發(fā)病原因提供部分依據(jù)，但像藥物性耳聾突變（即線粒體DNA 12S rRNA突變）和PDS類型（即SLC26A4基因雜合突變型）一般的聽力篩查并不能檢測出這些遲發(fā)性耳聾類型；由于晶芯?九項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒只檢測中國人常見的4個耳聾相關(guān)基因9個突變位點，會出現(xiàn)耳聾基因篩查結(jié)果通過其聽力篩查結(jié)果未通過的情況。所以進行聽力和耳聾基因的聯(lián)合篩查可極大地提高新生兒耳聾疾病的檢出率。（未凸顯本研究的意義）。

對于檢測出GJB2基因突變而無其它神經(jīng)及聽覺中樞障礙者，可通過盡早人工耳蝸植入，提高聽力語言康復(fù)效果［9］。對于可引起大前庭水管綜合征的SLC26A4基因IVS純合突變?nèi)巳海m然出生時可能聽力正常，但是在日常生活中需要避免頭部受到碰撞、重?fù)?，以減慢或避免耳聾的發(fā)生。對于線粒體DNA 12S rRNA突變引起的藥物性耳聾易感者，提供生活指導(dǎo)卡片避免接觸相關(guān)藥物，減少藥物性耳聾發(fā)生。本研究提供的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)將為分析病因，早期干預(yù)，降低本地區(qū)耳聾發(fā)生提供幫助。

表3　長治市各地區(qū)耳聾基因突變類型分布結(jié)果

1韓東一.中國聾病防治現(xiàn)狀.中華耳科學(xué)雜志，2007，4（5）：345-349.

1劉學(xué)忠，歐陽小梅，Yan D，等.中國人群遺傳性耳聾研究進展.中華耳科學(xué)雜志，2006，4（2）：81-89.

2陳煥玲.153例耳聾患者的耳聾基因芯片檢測.吉林：吉林大學(xué).2008.

3王繼，張鐵松.遺傳性耳聾的基因研究進展.醫(yī)學(xué)綜述，2013，2（3）：442-444.

4張強偉.129例非綜合征型耳聾患者耳聾基因的篩查.山西：山西醫(yī)科大學(xué).2012.

5戴樸，劉新，于飛，等.18個省市聾校學(xué)生非綜合征性聾病分子流行病學(xué)研究GJB2 235de1C和線粒體DNA 12SrRNAA1555G突變篩查報告.中華耳科學(xué)雜志，2006，1（4）：1-5.

6于飛，戴樸，韓東一.GJB2基因突變及語前遺傳性非綜合征性耳聾.國外醫(yī)學(xué)耳鼻咽喉科學(xué)分冊，2005，29（6）：359-361.

7戴樸，朱秀輝，袁永一，等.Pendred綜合征基因熱點突變篩查赤峰市聾啞學(xué)校大前庭水管綜合征患者.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2006，41（7）：497-500.

8周怡，劉海紅，郝津生，等.15343例新生兒耳聾基因普遍篩查結(jié)果分析.中國聽力語言康復(fù)科學(xué)雜志，2014，2：109-112.

9戴樸.遺傳性耳聾的預(yù)防與阻斷.中華醫(yī)學(xué)雜志，2007，87（40）：2811-2813.

ChangZhi District 19113 Cases Of Neonatal Deafness Gene Detection

LI Xiaoze，MA Weiping，HU Zhipeng，YAO Zerong，WEI Wei
Changzhi city，Shanxi Province maternal and child health care medical genetic chamber，Changzhi，046000，China Corresponding author：WEI WeiEmail：WeiWei2006_1@126.com

Objective 19113 newborns with deafness gene chip testing whether there is a Chinese common deafness gene abnormality.Methods Gathering on June 6,2013-December 19113 infants born within their respective jurisdictions of changzhi city heel blood and extract DNA,application of deafness gene chip to detect nine four common deafness gene mutations,including GJB2(35 del G,176_191del del 16235 C, 299_300 del AT),GJB3(538 C>T),SLC26A4(IVS,7-2 A>G 2168 A>G)and mitochondrial DNA 12 s rRNA(1555 A>G,1494 C>T).The basic information of 19113 newborns were investigated,including audiology examination.Results 19113 infants were detected deafness gene was abnormal in 984(5.15%),hybrid GJB2 gene mutations among 437 cases(2.29%),235 de1c homozygous mutations in 2 cases(0.01%),12 s rRNA mitochondrial DNA mutation in 66 cases(0.35%),hybrid SLC26A4 gene mutation type 395 cases (2.07%),hybrid GJB3 gene mutation in 62 cases(0.32%),double heterozygous mutations in 22 cases(0.12%). Conclusions Changzhi region newborn common deafness gene mutation is given priority to with GJB2 gene mutations,SLC26A4 gene mutations.Gene mutation rate in the majority with city,changzhi county and xiangyuan county,neonatal deafness gene screening of drug-induced deafness,PDS syndrome detecting a late-onset deafness hearing screening cannot be detected.

The newborn；Deafness genes；Mutation；Gene chip

R764.43

A

1672-2922（2015）03-658-4

2015-10-9審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.04.020

李曉澤，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主管技師，研究方向：醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)

魏魏，Email：WeiWei2006_1@126.com