核殼液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法直接檢測20種氨基酸*

陳建秋王玉紅李鵬李靜,閻超,**(.上海交通大學藥學院 上海 0040；．上海通微分析技術有限公司 上海 003)

核殼液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法直接檢測20種氨基酸*

陳建秋1王玉紅2李鵬2李靜1,2閻超1,2**
(1.上海交通大學藥學院 上海 200240；2．上海通微分析技術有限公司 上海 201203)

目的：應用蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light scattering detector, ELSD）、“HALO”核-殼型新型填料液相色譜柱，建立一種高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（HPLC-ELSD）直接測定20種未衍生氨基酸的分析方法，并將其用于復方氨基酸注射液中氨基酸含量的測定。方法：采用核-殼型HALO色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 mm C18），以甲醇-九氟戊酸-七氟丁酸-三氟乙酸-水為流動相進行梯度洗脫，流速0.5 ml/min，ELSD飄移管溫度40 ℃，載氣流速3.0 L/min，對20種基本氨基酸進行分離檢測。結果：氨基酸的質量濃度在0.01～1.0 mg/ml范圍內，其峰面積的對數(shù)值與進樣質量的對數(shù)值呈良好的線性關系；氨基酸的檢出限介于20～50 ng之間，樣品加標回收率為89.0%～111.2%。結論：該方法操作簡便快速、準確可靠，溶劑消耗少，為藥品、食品、飼料及化工生產(chǎn)等領域混合氨基酸樣品的直接檢測提供了參考。

反相高效液相色譜 蒸發(fā)光散射檢測器 核殼型填料 未衍生氨基酸

氨基酸是生命體基本物質之一，也是常見的食品添加劑和藥物制劑成分。由于氨基酸具有高極性、低揮發(fā)性、大部分無強發(fā)色基團的特性，其分離和檢測都較為困難，而目前常規(guī)使用的氨基酸分離檢測方法是柱后在線衍生“茚三酮”法，即經(jīng)典氨基酸分析儀法，其存在儀器昂貴、運行費用高、衍生物不穩(wěn)定、反應條件沖突、操作時間長等諸多問題[1-4]。

本研究采用國產(chǎn)HPLC-ELSD平臺及核殼型填料色譜柱[5-8]，在未衍生情況下將20種氨基酸在30 min內達到基本基線分離[9-10]。

1 實驗部分

1.1 儀器，試劑與材料

EasySepTM-1020高效液相色譜儀（上海通微分析技術有限公司）；UM-5000蒸發(fā)光散射檢測器（上海通微分析技術有限公司）；KQ2200B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；FA1004電子天平（上海恒平科學儀器有限公司）

氨基酸對照品：?；撬幔╰aurine）、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酰胺(Gln)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、脯氨酸(Pro)、胱氨酸(Cys-Cys)、賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)、纈氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、甲硫氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)，純度均大于99.0%，均購自國藥集團化學試劑有限公司；三氟乙酸(TFA)(HPLC級，美國天地公司)；七氟丁酸和九氟戊酸(HPLC級，J&K chemical 公司）；甲醇(HPLC級，國藥集團上?；瘜W試劑有限公司)；水為二次重蒸餾水；其他試劑均為分析純；復方氨基酸注射液（15AA）(批號：1110281-1，江蘇四環(huán)生物股份有限公司); HALO C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 mm）（上海通微分析技術有限公司）。

1.2 溶液制備

對照品儲備液：分別稱取20種氨基酸對照品適量，置于同一量瓶中，加0.2 mol·L-1鹽酸溶液溶解配制成各氨基酸濃度均約為1.0 mg·ml-1的混合溶液，用0.22 mm濾膜過濾備用。

供試品溶液：將復方氨基酸注射液（250 ml∶20 g（總氨基酸））以二次重蒸餾水稀釋50倍，用0.22 mm濾膜過濾備用[11-12]。

1.3 色譜條件

流動相：A相為九氟戊酸-七氟丁酸-三氟乙酸-水(1∶5∶0.6∶1000，V/V/V/V)；B相為甲醇；梯度洗脫程序：0～8 min，0%B；8～13 min，0%B～20%B；13～23 min，20%B～40%B；23～25 min，40%B～60%B，保持至5.5 min。流速0.5 ml·min-1。漂移管溫度40 ℃；載氣流速3.0 L·min-1；進樣體積10 ml；柱溫25 ℃。

2 結果

2.1 對照氨基酸溶液的分離

取對照品儲備液適量，稀釋成0.05 mg·ml-1混合溶液，以10 ml定量環(huán)進樣，20種氨基酸的分離結果如圖1所示。通過色譜圖，計算各組分的理論塔板數(shù)和分離度，其最小值分別為3 167（按taurine峰計)和1.13（Gly峰與Ser峰)，在該色譜條件下，20種氨基酸峰能在30 min內基本達到基線分離。

圖1 20種氨基酸對照品混合液的HPLC-ELSD色譜圖

2.2 線性關系和檢出限

分別取20種氨基酸質量濃度均約為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 mg·ml-1的對照品混合溶液，在上述條件下分析，以各氨基酸樣品濃度（mg·ml-1）的對數(shù)X為橫坐標，以各氨基酸峰面積的對數(shù)Y為縱坐標進行線性回歸，各氨基酸的線性回歸方程見表l。以0.01 mg·ml-1對照品混合溶液進樣，并讀取各氨基酸的對應峰高，逐步稀釋混合溶液，當各氨基酸信噪比約為3時，計算得到各氨基酸組分的檢出限介于20～50 ng之間，其中絲氨酸的檢出限最高，為50 ng（折合質量濃度為0.005 mg·ml-1）[13]。

表l 20種氨基酸線性方程

2.3 方法的精密度

取0.05 mg?ml-1混合對照品溶液，在上述色譜條件下進樣10 ml，重復進樣6次，測定保留時間和峰面積。各組分保留時間的相對標準偏差（RSD）為0.04%～0.6%，峰面積的RSD為1.7%～2.8%。

2.4 樣品回收率

精密量取3份復方氨基酸注射液樣品分別置于容量瓶中，加入一定量的氨基酸對照品溶解后，按供試品溶液制備方法制備后測定（圖2）。因樣品中Cys含量低于該色譜條件下的檢測限，故僅檢測出了14種氨基酸。樣品中14種氨基酸回收率均在89.0%～111.2%之間，RSD為1.9%～9.7%。

2.5 樣品分析

配制3份供試品溶液進樣分析，結果見表2。

圖2 復方氨基酸注射液的HPLC-ELSD色譜圖

表2 復方氨基酸注射液檢測結果

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

本研究采用的色譜柱為新型核殼型填料色譜柱（HALO色譜柱），其整體粒徑大小為2.7 mm，其中多孔外殼大小為0.5 mm。該色譜柱具有亞2微米色譜柱的超高柱效，可在常規(guī)高效液相色譜儀上進行復雜混合物的快速分離，實現(xiàn)近似UHPLC的性能[14]，但操作背壓卻不高于400 bar（4×107Pa），且易于在不同儀器上進行方法轉移。其原理是因為核殼結構降低了渦流擴散和提供了更快的傳質過程，導致色譜峰擴散和柱背壓較低。核殼型顆粒并不完全多孔，應用Fused-core處理技術與納米結構技術的結合，在堅實的硅膠核心上生成了一個既堅固又均勻的多孔外殼，且?guī)缀鯖]有硅醇活性。此外該色譜柱所用的篩板孔徑（2 mm）要遠遠大于UHPLC（0.5 mm），解決了UPLC柱入口篩板的堵塞問題[15-16]。運用該色譜柱，在30 min內能達到樣品的基線分離，降低了分析成本，提高了樣品檢測速度。

3.2 流動相的選擇

本研究選擇離子對試劑作為流動相結合梯度洗脫進行氨基酸的分離。實驗中分別選擇甲醇和乙腈作為有機相進行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)同一條件下，乙腈對極性弱的氨基酸洗脫較強，造成保留時間提前，分離度明顯變差，綜合考慮，選擇甲醇作為有機相進行梯度洗脫。另外，我們首先選擇七氟丁酸-三氟乙酸-水進行流動相篩選。當逐漸增加七氟丁酸的濃度（0.3%、0.4%、0.5%），甘氨酸和絲氨酸、蘇氨酸和丙氨酸分離度略增加，但仍沒有達到基線分離；同時考察了九氟戊酸離子對試劑對氨基酸分離度的影響，其對蘇氨酸和丙氨酸的分離有了很大的提高。本研究創(chuàng)造性地將九氟戊酸和七氟戊酸按一定比例結合，解決了親水性氨基酸分離度不好的問題。另對三氟乙酸的濃度對氨基酸分離的影響也進行了考察，發(fā)現(xiàn)隨著三氟乙酸濃度的降低，原先較難分離的甘氨酸和絲氨酸的分離度明顯增加，但這種變化對其他氨基酸的分離度也有一定影響，綜合考慮下，最終選擇三氟乙酸的濃度為0.05%。

3.3 流速對分離度的影響

分別調整流速為0.5、0.6、0.8和1.0 ml·min-1，考察各氨基酸的分離度，結果流速越高，最難分離的甘氨酸和絲氨酸的分離度越差，且梯度洗脫時柱壓達到最大值?？紤]實際應用，我們選擇流速為0.5 ml·min-1。

3.4 色譜柱柱溫的選擇

分別在室溫（25 ℃）和45 ℃條件下進行液相分離，發(fā)現(xiàn)溫度越高，氨基酸的保留時間越短，甘氨酸和絲氨酸的分離度越差。原因是溫度升高，減少了離子對對色譜柱硅膠的相互作用，使保留減弱。因此，我們選擇室溫條件下進行分離。

3.5 蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)的選擇

實驗中使用的蒸發(fā)光散射檢測器是低溫型ELSD檢測器，可在較低溫度下實現(xiàn)流動相的完全蒸發(fā)，有效降低溶劑形成的背景噪聲，同時避免了儀器在高溫下可能產(chǎn)生的信號噪聲干擾，提高了樣品檢測靈敏度。分別設定漂移管溫度為30、35、40、45和50 ℃，以各氨基酸的信噪比為考察對象，結果顯示漂移管溫度在30～50 ℃無明顯差別?？紤]到漂移管溫度低于溶劑蒸發(fā)溫度時，流動相無法充分揮發(fā)，造成基線背景水平升高；而漂移管溫度過高時，可能會帶來較大的噪聲，且檢測器溫度應保證高于實驗室溫度以便溫度的調節(jié)控制，故本實驗選用了40 ℃作為漂移管溫度。

保持漂移管溫度為40 ℃不變，對載氣流量（2.0、2.5、3.0、3.5 和4 L·min-1）進行考察，結果顯示在低載氣流量下樣品信號響應較高，但甘氨酸和絲氨酸的分離度有所降低，分析其原因，應該是在低氣體流速條件下，樣品色譜峰的展寬造成的；最終選用載氣流量為3.0 L·min-1。

4 總結

本文實驗基于核殼型填料色譜柱，建立了一種反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法分離檢測未衍生氨基酸，可在30 min內完成20種未衍生氨基酸的分離測定，且基本達到基線分離，同時，選擇色譜流速為0.5 ml·min-1，在達到氨基酸分離的同時，也減少了流動相的使用量，明顯降低了檢測成本，也減少了環(huán)境污染。該方法簡便快速、準確可靠，適用于氨基酸注射液中氨基酸含量的直接測定，同時該方法可開發(fā)為飼料中混合氨基酸樣品的檢驗。所以，其對食品安全管理、藥物質量控制和相關生產(chǎn)工業(yè)的工藝改良、質量控制都有積極的作用。

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Simultaneous determination of 20 amino acids by core-shell ODS column HPLC with evaporative light-scattering detection*

CHEN Jianqiu1, WANG Yuhong2, LI Peng2, LI Jing1,2, YAN Chao1,2**
(1. School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; 2. Unimicro (Shanghai) Technologies Co. Ltd., Shanghai 201203, China)

Objective: An analytical method for the determination of 20 underivatized amino acids was established using HPLC with HALO column coupled with an evaporative light-scattering detector (ELSD). Methods: The HALO column was packed with a core-shell C18stationary phase (4.6 mm×150 mm, 2.7 mm). A solvent gradient elution was performed with nonafluoropentanoic acid-heptafluorobutyric acid containing trifluoroacetic acid as mobile phase A and methanol as mobile phase B. The temperature of the drift tube in ELSD was set at 40℃ and the flow rate of carrier gas was 3.0 L/min. Results: There was a good linear relationship between the logarithm of the peak area and logarithm of the mass of each separated amino acid. The limits of detection for the underivatized amino acids were from 20 ng to 50 ng. The average recoveries of the 20 amino acids were between 89.0%and 111.2%. Conclusion: This method is simple, rapid and accurate for the determination of underivatized amino acids and can be widely used for the determination of underivatized amino acids in pharmaceutical, food, animal feeds and chemical industries.

reversed-phase high performance liquid chromatography（RP-HPLC); evaporative light-scatting detection(ELSD); core-shell stationary phase column; underivatized amino acids

R927.2; O657

A

1006-1533(2015)11-0075-05

科技部中小企業(yè)創(chuàng)新基金-核殼型色譜填料及色譜柱的產(chǎn)業(yè)化（12C26213202212）

**

閻超，博士生導師，教授，主要從事微分離分析和電色譜分離領域的研究。E-mail：chaoyan@ unimicrotech.com

2015-04-08）