卡介菌多糖核酸對慢性阻塞性肺疾病　T淋巴細胞核仁區(qū)酸性非組蛋白水平的影響

唐孝慶，張　程，葉賢偉，劉維佳，張湘燕

卡介菌多糖核酸對慢性阻塞性肺疾病T淋巴細胞核仁區(qū)酸性非組蛋白水平的影響

唐孝慶，張程，葉賢偉，劉維佳，張湘燕

目的 探討卡介菌多糖核酸對慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者T淋巴細胞核仁區(qū)酸性非組蛋白（Ag-NORs）水平的影響。方法 選擇2012年1月—2013年6月貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科及干部醫(yī)療科收治的COPD急性加重期（AECOPD）患者50例及在兩科室治療后COPD穩(wěn)定期患者 40例。采用隨機數(shù)字表法將AECOPD患者和COPD穩(wěn)定期患者分別分為治療組和對照組。AECOPD及COPD穩(wěn)定期對照組患者均僅給予常規(guī)治療，治療組患者在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用卡介菌多糖核酸治療，療程均為1個月。于治療前后均對患者外周血T淋巴細胞Ag-NORs進行染色分析，以核仁銀染面積/核銀染面積（I/S%）作為Ag-NORs的檢測指標。結(jié)果 治療前，AECOPD治療組和AECOPD對照組外周血T淋巴細胞Ag-NORs水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療后，AECOPD治療組外周血T淋巴細胞Ag-NORs水平高于AECOPD對照組（t=-1.708，P＜0.05）。治療前，COPD穩(wěn)定期治療組和COPD穩(wěn)定期對照組外周血 T淋巴細胞Ag-NORs水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療后，COPD穩(wěn)定期治療組外周血T淋巴細胞Ag-NORs水平高于COPD穩(wěn)定期對照組 （t=-1.647，P＜0.05）。AECOPD治療組及COPD穩(wěn)定期治療組治療期間各出現(xiàn)注射部位局部紅腫1例，予熱敷后1周內(nèi)自然消退，其他均未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。結(jié)論 COPD患者使用卡介菌多糖核酸治療，可增加T淋巴細胞Ag-NORs水平，改善其免疫功能。

肺疾病，慢性阻塞性；卡介菌多糖核酸；核仁區(qū)酸性非組蛋白；T淋巴細胞；免疫

唐孝慶，張程，葉賢偉，等.卡介菌多糖核酸對慢性阻塞性肺疾病T淋巴細胞核仁區(qū)酸性非組蛋白水平的影響［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18（2）：172-175.［www.chinagp.net］

Tang XQ，Zhang C，Ye XW，et al.Effects of BCG-polysaccharide nucleic acid on T-lymphocytes argyrophilic nucleolar organizer proteins in COPD patients［J］.Chinese General Practice，2015，18（2）：172-175.

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種具有持續(xù)氣流受限且呈進行性發(fā)展為特征的可以防治的常見呼吸系統(tǒng)疾病。COPD患者常因反復(fù)呼吸道感染致病情反復(fù)發(fā)作、慢性遷延，不僅嚴重影響其身心健康，甚至還可危及生命［1］。反復(fù)呼吸道感染的病因除先天性及環(huán)境因素外，主要還與機體免疫功能下降有關(guān)。隨著中國人口的老齡化，COPD患病率與機體免疫功能的相關(guān)研究也顯著增多。據(jù)研究報道，中老年患者免疫功能缺陷以細胞免疫為主，主要表現(xiàn)為T淋巴細胞的改變［2］。通過使用免疫調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)患者免疫功能，增強其抗病能力，是防治反復(fù)呼吸道感染的一種新舉措［3］。本研究通過檢測COPD患者使用免疫調(diào)節(jié)劑卡介菌多糖核酸治療后外周血T淋巴細胞核仁區(qū)酸性非組蛋白 （Ag-NORs）水平，探討卡介菌多糖核酸對COPD患者T淋巴細胞Ag-NORs免疫的影響，擬對COPD患者進行適時免疫干預(yù)治療提供理論依據(jù)。

1　對象與方法

1.1病例入選與排除標準 入選標準：符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南 （2013年修訂版）》［4］中的診斷標準：（1）肺功能，吸入支氣管舒張劑后第1秒用力呼氣末容積占用力肺活量百分比（FEV1/FVC%）＜70%，可以確定為持續(xù)存在的氣流受限；（2）臨床癥狀，COPD穩(wěn)定期：經(jīng)治療后咳嗽、咳痰、氣促等癥狀明顯減輕，病情基本恢復(fù)至急性加重期前的狀態(tài)；急性加重期：短期內(nèi)出現(xiàn)咳嗽、咳痰、氣促或喘息癥狀加重，表現(xiàn)為痰量增多、痰液黏稠或伴發(fā)熱。排除標準：（1）先天性或獲得性免疫功能缺陷者；（2）自身免疫系統(tǒng)疾病者；（3）近期使用可能影響免疫功能的藥物，如糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺者；（4）嚴重心、肝、腎功能不全、糖尿病者；（5）支氣管擴張、支氣管哮喘、活動性結(jié)核、惡性腫瘤者；（6）在試驗前1周出現(xiàn)下呼吸道感染的COPD穩(wěn)定期者。

1.2一般資料 選擇2012年1月—2013年6月貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科及干部醫(yī)療科收治的COPD急性加重期 （AECOPD）患者50例及在兩科室治療后COPD穩(wěn)定期患者 40例。采用隨機數(shù)字表法將AECOPD患者和COPD穩(wěn)定期患者分別分為治療組和對照組，其中AECOPD治療組25例，男15例、女10例，年齡49～87歲，平均（73.1±6.7）歲，吸煙指數(shù)300 ～800年·支，平均（523.3±193.9）年·支，病程2 ～16年，平均（8.7±2.5）年；AECOPD對照組25例，男13例、女12例，年齡52～85歲，平均 （71.6 ±6.1）歲，吸煙指數(shù)400～900年·支，平均 （479.5 ±236.8）年·支，病程3～15年，平均 （8.3±2.2）年。COPD穩(wěn)定期治療組20例，男12例、女8例，年齡50～82歲，平均（72.1±7.5）歲，吸煙指數(shù)350～700年·支，平均 （466.7±249.5）年·支，病程5～15年，平均（6.7±1.5）年。COPD穩(wěn)定期對照組20例，男10例、女10例，年齡49～83歲，平均（71.4 ±5.2）歲，吸煙指數(shù)400～820年·支，平均（502.8 ±214.9）年·支，病程4～13年，平均（7.2±3.1）年。AECOPD治療組和AECOPD對照組性別、年齡、吸煙指數(shù)、病程比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義0.05）；COPD穩(wěn)定期治療組和COPD穩(wěn)定期對照組性別、年齡、吸煙指數(shù)、病程比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義0.380，P＞0.05）。

1.3治療方法 AECOPD及COPD穩(wěn)定期對照組患者均僅給予常規(guī)治療，治療組患者在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用卡介菌多糖核酸1 ml（規(guī)格：1 ml/支，含卡介菌0.35 mg、核酸≥30 μg）治療，肌肉注射，3次/周。療程均為1個月［5］，檢測各組患者在治療前后外周血T淋巴細胞Ag-NORs水平。

1.4外周血T淋巴細胞Ag-NORs水平檢測方法

1.4.1儀器 KL型免疫圖像分析儀 （北京健爾康醫(yī)療設(shè)備有限公司）；TDZ5-WS臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.4.2材料 YZB/粵穗0096-2011淋巴細胞培養(yǎng)液（廣州市達暉生物技術(shù)有限公司），二氧化碳（CO2）恒溫培養(yǎng)箱（美國Forma公司），5%硝酸銀染液、固定液及其他配套試劑（北京健爾康醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.4.3方法

1.4.3.1采血 于安靜狀態(tài)下，采用10∶2的肝素（10%）溫潤無菌注射器抽取患者空腹外周靜脈血2 ml，避免輸血及輸液時采集。

1.4.3.2種血 將注射器搓捏，使血樣混勻，在無菌條件下，用7號針頭垂直種血30～40滴至外周血淋巴細胞培養(yǎng)液內(nèi)，搖勻。

1.4.3.3培養(yǎng) 將培養(yǎng)液放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)期間注意觀察培養(yǎng)液有無凝血、溶血或長菌現(xiàn)象，每天將培養(yǎng)液拿出輕輕搖晃，以便細胞獲得充分的營養(yǎng)。

1.4.3.4制片（1）加秋，在培養(yǎng)完成前4～5 h，加入濃度為20 μg/ml的秋水仙素2～3滴后，繼續(xù)培養(yǎng)4 ～5 h。（2）離心，用吸管將培養(yǎng)液輕輕吹勻后，將其吸至離心管中，以1 700 r/min在離心機中離心7 min，離心半徑19 cm，棄上清，留沉淀。（3）低滲，加入已預(yù)溫至37℃的0.075 mol/L氯化鉀溶液8 ml，用吸管充分吹勻，放入37℃水浴箱中，溫育30 min。（4）預(yù)固定，向離心管中加入現(xiàn)配的預(yù)溫至37℃的固定液（甲醇∶乙酸=3∶1）1.5 ml，輕輕混勻，以1 700 r/min在離心機中離心7 min，離心半徑19 cm棄上清，留沉淀。（5）固定，沿管壁緩慢加入現(xiàn)配的預(yù)溫至37℃的固定液8 ml，輕輕混勻，以1 700 r/min在離心機中離心7 min，棄上清，加入固定液再次固定。離心后再棄上清，加入3滴固定液，吸管吹勻?qū)⒊恋碚{(diào)成細胞懸液備用。（6）滴片，將提前制冷的載玻片置于水平桌面上，用吸管吸取充分混勻的細胞懸液，以距玻片10 cm的高度垂直向其中心滴加細胞懸液3滴，于室溫晾干后編號。（7）染片，將水浴鍋預(yù)熱至90℃，將玻片置鋁板上后將鋁板緩慢放入水面。加5%硝酸銀溶液4滴、3%甲酸和2%明膠2滴于玻片上，用吸管輕吸混勻后蓋好蓋玻片，待涂片變?yōu)樯铧S色 （約3 min）取下。去蓋玻片，以小量、中速自來水沖洗玻片至無黃色脫下，再用去離子水沖洗1次玻片后直立晾干備用。

1.4.4圖像分析 將制好的銀染片置于顯微鏡載物臺上，高倍鏡下全片觀察細胞生長情況，隨機采集30個生長良好的細胞，計算機分析結(jié)果并記錄，以核仁銀染面積/核銀染面積（I/S%）作為Ag-NORs的檢測指標。1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗或配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1AECOPD治療組和AECOPD對照組治療前后外周血T淋巴細胞Ag-NORs水平比較 治療前，兩組外周血T淋巴細胞Ag-NORs水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療后，AECOPD治療組外周血 T淋巴細胞Ag-NORs水平高于AECOPD對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1　AECOPD治療組和AECOPD對照組治療前后外周血 T淋巴細胞Ag-NORs水平比較　（±s，%）Table 1 Comparison of peripheral blood T lymphocyte Ag-NORs level between two groups before and after treatment

表1　AECOPD治療組和AECOPD對照組治療前后外周血 T淋巴細胞Ag-NORs水平比較?。ā纒，%）Table 1 Comparison of peripheral blood T lymphocyte Ag-NORs level between two groups before and after treatment

注：與治療前比較，*P＜0.05

組別　例數(shù)　治療前　治療后AECOPD對照組　25　3.98±0.32　5.24±0.23*AECOPD治療組　25　4.15±0.14　6.33±0.28*t值0.029　0.035 -1.714　-1.708 P值

2.2COPD穩(wěn)定期治療組和COPD穩(wěn)定期對照組治療前后外周血T淋巴細胞Ag-NORs水平比較 治療前，兩組外周血T淋巴細胞Ag-NORs水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）；治療后，COPD穩(wěn)定期治療組外周血T淋巴細胞Ag-NORs水平高于COPD穩(wěn)定期對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05，見表2）。

表2　COPD穩(wěn)定期治療組和COPD穩(wěn)定期對照組治療前后外周血T淋巴細胞Ag-NORs水平比較　（±s，%）Table 2 Comparison of peripheral blood T lymphocyte Ag-NORs level between the two groups before and after treatment

表2　COPD穩(wěn)定期治療組和COPD穩(wěn)定期對照組治療前后外周血T淋巴細胞Ag-NORs水平比較　（±s，%）Table 2 Comparison of peripheral blood T lymphocyte Ag-NORs level between the two groups before and after treatment

注：與治療前比較，*P＜0.05

組別　例數(shù)　治療前　治療后COPD穩(wěn)定期對照組　20　3.52±0.30　5.07±0.26*COPD穩(wěn)定期治療組　20　3.69±0.12　6.92±0.22*t值0.036　0.042 -1.625　-1.647 P值

2.3不良反應(yīng) AECOPD對照組及COPD穩(wěn)定期對照組未出現(xiàn)不良反應(yīng)，AECOPD治療組及COPD穩(wěn)定期治療組治療期間出現(xiàn)注射部位局部紅腫各1例，癥狀較輕，未暫停治療，予熱敷后1周內(nèi)自然消退，其他均未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。

3　討論

COPD是常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病之一，因反復(fù)呼吸道感染、全身炎性反應(yīng)及慢性缺氧均可導(dǎo)致機體免疫功能下降，常無法預(yù)估病情，最終造成死亡［6］。Pauwels等［7］報道，COPD患者的致殘率和病死率呈逐年上升趨勢，目前居全球死亡原因第4位，預(yù)計至2015年病死率將增加5倍。COPD患者存在免疫功能缺陷［8-9］，隨著病情進展，患者外周血T淋巴細胞Ag-NORs水平也逐漸降低［10］。近年有研究發(fā)現(xiàn)，部分多糖具有控制血糖、清除炎性因子、促進傷口愈合、止咳怯痰［11］及治療自身免疫疾?。?2］等生物活性。多糖作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，可增強及調(diào)節(jié)患者的免疫功能，是目前治療反復(fù)呼吸道感染的一種新方法［13］。卡介菌多糖核酸是一種新型免疫調(diào)節(jié)劑，可以促進T、B細胞生長增殖，調(diào)節(jié)機體內(nèi)的細胞免疫和體液免疫功能；還可以刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，激活單核-巨噬細胞功能，提高細胞吞噬功能，增強自然殺傷細胞功能，從而增強機體抗病能力。蔣應(yīng)星［14］研究證實，使用卡介菌多糖核酸治療反復(fù)呼吸道感染患者，通過維持其外周血T淋巴細胞的平衡，從而提高機體的細胞免疫功能，療效肯定、安全，不良反應(yīng)少。

核仁的組成成分包括 rRNA、rDNA和核糖核蛋白，核仁組織區(qū)定位于核仁染色體的次縊痕部位，為常染色質(zhì)，是rDNA所在的位置。核仁的主要功能是轉(zhuǎn)錄rRNA和組裝細胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成的“裝配機”-核糖體。核糖體的生物發(fā)生包括rRNA的合成、加工和核糖體亞單位的裝配等過程，T淋巴細胞免疫活性的表現(xiàn)主要在于核糖體合成蛋白質(zhì)的能力。Ag-NORs通過解除組蛋白對rDNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用，促使rDNA轉(zhuǎn)錄生成rRNA［15］。rRNA可與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體，最終實現(xiàn)蛋白質(zhì)的順利合成。通過檢測COPD患者外周血Ag-NROs水平，可了解T淋巴細胞的增殖活性，是評估患者細胞免疫功能情況的可靠手段。

AECOPD患者T淋巴細胞Ag-NROs水平顯著下降，解除組蛋白對DNA轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用在一定程度上有所減低。T淋巴細胞活性明顯減退，使機體的免疫應(yīng)答、免疫監(jiān)視及免疫穩(wěn)定等功能低下，而變態(tài)反應(yīng)性增加，最終導(dǎo)致機體細胞免疫功能低下，極易導(dǎo)致病毒、細菌或其他病原微生物感染［16］。本研究結(jié)果顯示，AECOPD治療組治療后外周血T淋巴細胞Ag-NROs水平高于治療前和AECOPD對照組治療后；且COPD穩(wěn)定期治療組治療后外周血T淋巴細胞Ag-NROs水平高于治療前和COPD穩(wěn)定期對照組。表明卡介菌多糖核酸能夠提高AECOPD及COPD穩(wěn)定期患者外周血T淋巴細胞Ag-NROs水平，增強COPD患者的細胞免疫功能，在COPD的防治中具有重要意義。通過使用卡介菌多糖核酸可增強患者免疫力，縮短急性發(fā)作期病程，值得臨床進一步推廣使用。因本研究時間有限，入選對象數(shù)量受限，且未能對使用卡介菌多糖核酸后患者癥狀緩解、體征消失時間等臨床療效進行評估，有待繼續(xù)收集相關(guān)數(shù)據(jù)后再做分析。

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（本文編輯：賈萌萌）

Effects of BCG-polysaccharide Nucleic Acid on T-lymphocytes Argyrophilic Nucleolar Organizer Proteins in COPDPatients

TANG Xiao-qing，ZHANG Cheng，YE Xian-wei，et al.Department of Respiratory and Critical，People′s Hospital of Guizhou，Guiyang 550002，China

Objective To detect the effects of BCG-polysaccharide nucleic acid on peripheral blood T-lymphocytes argyrophilic nucleolar organizer proteins（Ag-NORs）in patients with chronic obstructive pulmonary disease（COPD）. Methods Fifty patients of acute exacerbation of COPD （AECOPD）were divided randomly into groups AECOPD study，AECOPD control and 40 remitting COPD（RCOPD）patients into groups RCOPD study，RCOPD control in People′s Hospital of Guizhou from January 2012 to June 2013.Four groups were given conventional treatment，the study groups given additional BCG -polysaccharide nucleic acid，the courses lasted 1 month.Taking nucleolar silver staining/nuclear silver staining（I/S%）as the test index of Ag-NORs，a staining analysis on peripheral blood T-lymphocyte Ag-NORs was performed before and after treatment.Results There was no significant difference in Ag-NORs level between groups AECOPD study，control before treatment（P＞0.05），higher in AECOPD study group than in AECOPD control after treatment（t=-1.708，P＜0.05）.No difference was noted in Ag-NORs between groups RCOPD study，control before treatment（P＞0.05），and higher in RCOPD study group than in RCOPD control group after treatment（t=-1.647，P＜0.05）.One patient from AECOPD study group and 1 from RCOPD study group had local swelling on injection sites and regressed spontaneously.No obvious adverse reactions appeared in the other patients.Conclusion BCG-polysaccharide nucleic acid can increase T-lymphocyte Ag-NORs level and improve its immune function in COPD patients.

Pulmonary disease，chronic obstructive；BCG-polysaccharide nucleic acid；Argyrophilic nucleolar organizer proteins；T-lymphocytes；Immunity

R 563

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.02.012

貴州省發(fā)展和改革委員會資助項目（黔發(fā)改高技［2006］858號）

550002貴州省貴陽市，貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

張湘燕，550002貴州省貴陽市，貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；E-mail：zxy35762@126.com

2014-03-20；

2014-08-06）