利用新型DNDF7和攜帶LoxP位點(diǎn)的LPL4質(zhì)粒快速構(gòu)建S-Sox5基因打靶載體*

劉晙玭汪智瓊平光倫石玉琴張 玲張志兵，3

1 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院（武漢 430065）； 2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院血液科；

3. Department of Obstetrics & Gynecology， Virginia Commonwealth University， Richmond， VA， 23298. USA

利用新型DNDF7和攜帶LoxP位點(diǎn)的LPL4質(zhì)?？焖贅?gòu)建S-Sox5基因打靶載體*

劉晙玭1汪智瓊2平光倫1石玉琴1張 玲1**張志兵1，3**

1 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院（武漢 430065）； 2. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院血液科；

3. Department of Obstetrics & Gynecology， Virginia Commonwealth University， Richmond， VA， 23298. USA

目的 體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)S-SOX5蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)纖毛基因Spag6，為進(jìn)一步探索其在體內(nèi)的作用，擬構(gòu)建S-Sox5基因的敲除載體。方法 利用新型DNDF-7和攜帶LoxP位點(diǎn)的LPL4載體，選擇S-Sox5基因第1外顯子作為條件性敲除目的片段，SV129系ES細(xì)胞DNA 為模板分步擴(kuò)增包括S-Sox5第1外顯子的中間段（middle piece），上游同源左臂4.8kb（upper arm）及下游同源右臂2.5kb（down arm）的基因片段；構(gòu)建upper-arm-DNDF7、down-arm-DNDF7和middle-piece-LPL4質(zhì)粒，將middle-piece-LPL4的酶切產(chǎn)物L(fēng)oxP-middle-piece-LoxP和down-arm-DNDF7酶切產(chǎn)物相連，形成攜帶LoxP位點(diǎn)的middle-down-arms-DNDF7重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒與upper-arm-DNDF7酶切產(chǎn)物相連，獲得S-Sox5基因打靶載體。結(jié)果 經(jīng)酶切鑒定及測序證實(shí)，構(gòu)建的upper-arm-DNDF7、middle-piece-LPL4、down-arm-DNDF7重組質(zhì)粒和S-Sox5基因打靶載體結(jié)構(gòu)正確，與設(shè)計(jì)相符。結(jié)論 成功構(gòu)建小鼠S-Sox5條件基因打靶載體，為進(jìn)一步建立S-Sox5條件敲除小鼠，在體內(nèi)研究其功能打下基礎(chǔ)。

S-Sox5基因； 基因打靶載體； DNDF7載體； LPL4載體

SOX蛋白是一組擁有一個(gè)或多個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域即高遷移率組蛋白（high motility group，HMG）DNA結(jié)合區(qū)域的蛋白家族，它們能通過HMG結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合。SOX蛋白通過結(jié)合DNA而激活或抑制基因表達(dá)，調(diào)節(jié)不同的生理發(fā)育過程，如肌肉、血管、B細(xì)胞發(fā)育等，SOX蛋白與許多疾病發(fā)生有關(guān)［1-4］。

SOX 家族可分為10 組，從A組到J組［5］。其中，SOX5 是SOXD 亞家族的一員，該亞家族有3個(gè)基因，SOX5、SOX6和 SOX13［6］。 小鼠Sox5 主要轉(zhuǎn)錄兩種轉(zhuǎn)錄子， 一個(gè)短的轉(zhuǎn)錄子（2 kb），在睪丸表達(dá)［7］，命名為S-Sox5，翻譯 48 kDa的S-SOX5蛋白；另一個(gè)長的轉(zhuǎn)錄子（6 kb），在其它組織表達(dá)［8］，6 kb轉(zhuǎn)錄子最初被命名為L-Sox5，現(xiàn)簡稱為Sox5，與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及多種癌癥的發(fā)生相關(guān)［9，10］。

研究表明，S-SOX5 可調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)纖毛表達(dá)豐富的睪丸組織中一些基因的表達(dá)，如 激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive lipase）、核因子kappaBβ亞族的抑制蛋白IkappaBβ和鋅指蛋白230（zinc finger protein，ZNF230）［11-13］等。除睪丸組織外，人S-SOX5在運(yùn)動(dòng)纖毛表達(dá)豐富的腦組織也高度表達(dá)［14］，提示S-SOX5與運(yùn)動(dòng)纖毛有著密切的聯(lián)系，可能是一個(gè)調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)纖毛基因功能的轉(zhuǎn)錄因子。我們前期實(shí)驗(yàn)也證明，在支氣管源性細(xì)胞（Bronchial Epithelial Cell Line，BEAS-2B）中， S-SOX5可激活小鼠和人精子相關(guān)抗原6（sperm associated antigen 6，SPAG6）啟動(dòng)子功能，將SPAG6啟動(dòng)子區(qū)域S-SOX5結(jié)合位點(diǎn)突變或缺失后，其對(duì)SPAG6的活化效應(yīng)隨之消失［15］。目前已知全長Sox5已有多種變異體（variants），但非常特別的是，我們選擇性分析小鼠L-Sox5 variant 1、variant 2和S-Sox5的外顯子后發(fā)現(xiàn)， S-Sox5的第1外顯子并未在L-Sox5 variant1、variant2中出現(xiàn)，而S-Sox5第2～8外顯子分別對(duì)應(yīng)L-Sox5 variant2的8-14外顯子， S-Sox5的第1外顯子（exon 1）不編碼蛋白，其轉(zhuǎn)錄子從第2外顯子才開始翻譯［15］。因此這個(gè)特異的第1外顯子為進(jìn)一步探索S-Sox5影響運(yùn)動(dòng)纖毛形成及功能的作用機(jī)制提供了可能。本研究通過利用新型載體DNDF7及已攜帶2個(gè)LoxP位點(diǎn)的LPL4質(zhì)粒，通過傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增、酶切和連接技術(shù)，快速構(gòu)建S-Sox5基因第1外顯子的完全敲除打靶載體，為后續(xù)的構(gòu)建并利用S-Sox5基因敲除小鼠模型、深入研究S-Sox5的功能奠定了基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

（一）質(zhì)粒

質(zhì)粒：DNDF7、LPL4 vector由美國弗吉利亞聯(lián)邦大學(xué)Ching-kang Chen教授惠贈(zèng)。

（二）實(shí)驗(yàn)試劑

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BglⅡ、XhoⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、KpnⅠ、NotI、和AvrⅡ購自New ENGLAND Biolabs公司（Ipswich， Massachusetts，USA）；TOPO10 pcr 2.1 TA cloning Kit、SOC培養(yǎng)基、DH5α購自Invitrogen公司（Carlsbad， California，USA）；QIAprep?Spin Minipred Kit （Cat. No. 27104）、QIAquick?Gel Extraction Kit（Cat. No. 28706）和EndoFree?plasmid Maxi Kit （Cat. No. 12362）購自Qiagen公司（Valencia， California，USA）；Expand Long Template PCR system（Cat. No. 11681834001）、Expand High Fidelity PCR system（Cat. No. 11732650001）、Rapid DNA Ligation Kit（Cat. No. 11635379001）購自Roche Diagnostics公司（Indianapolis， Indiana， USA）。

二、S-Sox5基因的生物信息學(xué)分析及同源臂的引物設(shè)計(jì)與合成

依據(jù)GenBank中小鼠S-Sox5基因序列（在EMBL數(shù)據(jù)庫中的序列號(hào)為X65657［7］，BLAST軟件標(biāo)注其8個(gè)外顯子與起始密碼子，選擇第1外顯子前后各15kD的序列，分析基因組重復(fù)序列的大小和具體位置，在避開重復(fù)序列的前提下， 進(jìn)行基因敲除的設(shè)計(jì)。所有PCR引物自行設(shè)計(jì)并引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，見表1。

表1 引物序列及引入的酶切位點(diǎn)

設(shè)計(jì)打靶載體的5’同源臂（上游同源臂，Upper/Left arm）長約4.8kb，含基因敲除區(qū)域exon1的中間臂長約748bp（中間臂，Middle piece），3’同源臂（下游同源臂，Down/Right arm）長約2.5kb。上述引物均由Invitrogen公司合成。

三、Upper-arm-DNDF7、middle-piece-LPL4和down-arm-DNDF7重組質(zhì)粒構(gòu)建

以SV129系小鼠胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES細(xì)胞）DNA為模版，用相應(yīng)引物分別擴(kuò)增上游、中間和下游同源臂對(duì)應(yīng)的約4.8kb、748bp和2.5kb的基因片段。反應(yīng)體系如下：上下游同源臂：10×PCR 緩沖液③ 5μL；10 mmol/L dNTPs 2.5μL；2 μM P1/P2或P5/P6各10 μL；DNA 1μL；Taq DNA聚合酶1μL；加ddH2O 20.5μL至50μL。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸6 min，10個(gè)循環(huán)；94℃變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸6 min+20 s/循環(huán)，25個(gè)循環(huán)；68℃延伸7 min，使用Expand Long Template PCR system進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳后，回收獲得4.8/2.5kb目的基因片段。中間臂：10×PCR 緩沖液② 5μL；dNTPs 1μL；2 μM P3/P4各8 μL；DNA 1μL；Taq DNA 聚合酶1μL；加ddH2O 26μL至50μL。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸1′30″，30個(gè)循環(huán)；72延伸10 min，使用Expand High Fidelity PCR system進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳后，回收獲得748bp目的基因片段。

上、中、下游同源臂對(duì)應(yīng)目的基因片段經(jīng)TA克隆，分別經(jīng)BglII+XhoI、BamHI+SalI、KpnI+AvrII酶切后，分別連入DNDF7、LPL4和DNDF7載體中。

四、LoxP-middle piece-LoxP/down-arm重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將兩端攜帶LoxP位點(diǎn)的Middle-piece-LPL4質(zhì)粒經(jīng)KpnI+NotI酶切，產(chǎn)物與down-arm-DNDF7質(zhì)粒相連，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆提取質(zhì)粒，分別用KpnI+NotI和KpnI+AvrII雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。

五、S-Sox5條件基因打靶載體的構(gòu)建與鑒定

將upper arm-DNDF7載體和LoxP-middle-LoxP/ down-arm重組質(zhì)粒分別經(jīng)NotI+AvrII酶切后相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取克隆提取質(zhì)粒，酶切 和測序鑒定S-Sox5條件基因打靶載體（conditional gene targeting vector， S-Sox5 KO）。

送測序質(zhì)粒主要鑒定LoxP位點(diǎn)是否成功插入，引物如下：LoxP Forward：5’-TTA CAA GCA TAG AAG CTA GG-3’；LoxP Reverse：5’-AAC ATG CCA TGC TCT TTG GTA GA-3’。引物設(shè)計(jì)遵循原則：為能成功檢測2個(gè)LoxP位點(diǎn)，選擇Middle piece序列5’端和3’端23bp和20bp的堿基，分別設(shè)計(jì)為Reverse和Forward primer。

結(jié) 果

一、S-Sox5條件性基因敲除打靶載體同源臂的設(shè)計(jì)

根據(jù)以前研究的成果，小鼠S-Sox5基因共有8個(gè)外顯子，從第2個(gè)外顯子開始翻譯，第1個(gè)外顯子不存在于L-Sox5中，因而缺失該外顯子不應(yīng)對(duì)L-Sox5有明顯影響，故設(shè)計(jì)基因敲除的區(qū)域?yàn)镾-Sox5的第1外顯子［15］。如果同源重組成功，基因組上這段序列前后會(huì)置入LoxP位點(diǎn)，通過與組織細(xì)胞特異性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交即能達(dá)到條件性敲除的目的。設(shè)計(jì)打靶載體的5’同源臂長約4.8kb，3’同源臂長約2.5kb，如圖1所示。

圖1 S-Sox5條件基因敲除打靶載體示意圖

二、PCR擴(kuò)增同源臂片段

如圖2所示，用0.7%瓊脂糖電泳PCR產(chǎn)物，電泳顯示PCR產(chǎn)物擴(kuò)增片段分別為4.8kb（upper arm）、2.5kb（down arm）和780bp （middle piece），與預(yù)期片段大小一致。

圖2 同源臂PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

三、 DNDF7和LPL4 vector圖譜

DNDF7和LPL4載體的圖譜如圖3所示。其中DNDF7載體同時(shí)含有DTa和NEO兩個(gè)篩選抗性的標(biāo)記（markers）；LPL4載體已連有2個(gè)LoxP位點(diǎn)， middle piece/pc2.1質(zhì)粒選擇BamHI和SalI雙酶切后，與LPL4載體連接，再用KpnI和NotI雙酶切形成LoxP-middle piece/LPL4-LoxP重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒通過KpnI和NotI雙酶切連接到DNDF7載體。

四、Middle-piece和down-arm片段經(jīng)二輪重組，構(gòu)建LoxP-middle piece-LoxP/down arm/DNDF7重組質(zhì)粒

Middle-piece首先與攜帶2個(gè)LoxP位點(diǎn)的LPL4連接，經(jīng)BamHI+SalI雙酶切，電泳結(jié)果顯示3054bp和780bp共2條DNA片段（圖4A）；down-arm與DNDF7載體連接，經(jīng)KpnI+AvrII雙酶切，電泳結(jié)果顯示6700bp和2500bp共2條DNA片段（圖4B）。將middlepiece/LPL4和down-arm/DNDF7重組質(zhì)粒經(jīng)KpnI+NotI酶切后連接，雙酶切鑒定電泳結(jié)果顯示攜帶2個(gè)LoxP位點(diǎn)后的middle-piece大小約為1000bp，down-arm/ DNDF7大小為9200bp（圖4C）。

圖4 兩輪重組后的陽性克隆酶切鑒定A: 用BamI/SalI對(duì)LoxP-中間臂-LPL4-LoxP質(zhì)粒進(jìn)進(jìn)行酶切鑒定，獲得3054bp和780bp共2條DNA片段。1～2為2個(gè)陽性克?。籅: 用KpnI/AvrII對(duì)下游同源臂-DNDF7質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，獲得6700bp和2500bp共2條DNA片段。1～6為6個(gè)陽性克??；C: 用KpnI/ NotI對(duì)LoxP-中間臂-LPL4-LoxP質(zhì)粒和下游同源臂-DNDF7質(zhì)粒的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，獲得9200bp和1000bp共2條DNA片段。1～5為5個(gè)陽性克隆

五、構(gòu)建的S-Sox5條件基因打靶載體測序正確

參照本文“材料與方法”中S-Sox5條件基因打靶載體的構(gòu)建與鑒定，獲得S-Sox5條件基因打靶載體S-Sox5KO。酶切鑒定結(jié)果如圖5所示：經(jīng)BglII/XhoI酶切后得到4.8kb、10.2kb兩個(gè)片段；經(jīng)KpnI+NotI酶切后得到10.4kb、3.6kb、1.0kb三個(gè)片段，原因?yàn)椋簎pper arm 片段5’ →3’端2.8 kb處亦有1個(gè)KpnI酶切位點(diǎn)，結(jié)合DNDF7圖譜可見，從BglII→NotI共約1.6kb（1627bp），而KpnI同時(shí)酶切下upper arm的下游2.0kb片段，最終形成一個(gè)約3.6kb的片段。經(jīng)KpnI/ AvrII酶切后得到7.9kb、4.6kb、2.5kb三個(gè)片段，原因?yàn)椋簎pper arm 片段5’ →3’端2.8 kb處亦有1個(gè)KpnI酶切位點(diǎn)，在DNDF7圖譜上可見，從BglII→KpnI共約1.6kb（1639bp），在KpnI和NotI之間已插入約1.0kb的LoxP-middle piece-LoxP片段，再加上KpnI同時(shí)酶切下upper arm的下游2.0kb片段，最終形成4.6kb片段。經(jīng)AvrII/NotI酶切后得到11.5kb、3.5kb兩個(gè)片段。上述結(jié)果與實(shí)驗(yàn)預(yù)期相符。用設(shè)計(jì)的一對(duì)LoxP特異性引物進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果顯示2個(gè)LoxP位點(diǎn)已成功插入構(gòu)建的載體中（圖6）。

圖5 S-Sox5 KO 質(zhì)粒 酶切鑒定1～4孔分別為用BglI/XhoI，KpnI/NotI，KpnI/AvrII和 AvrII/NotI進(jìn)行雙酶切獲得的片段

討 論

最近研究發(fā)現(xiàn)S-Sox5主要存在于睪丸組織中，同時(shí)存在于其他含有運(yùn)動(dòng)纖毛的上皮組織如腦室管膜上皮組織、肺支氣管上皮組織、睪丸附睪管上皮組織中，甚至少量表達(dá)于脾臟組織中［4］，推測其不僅引起運(yùn)動(dòng)纖毛功能障礙，也可能與免疫系統(tǒng)功能相關(guān)。為進(jìn)一步研究S-Sox5在不同組織/細(xì)胞中的功能，有必要構(gòu)建S-Sox5基因敲除靶向載體，探討在S-Sox5轉(zhuǎn)錄因子缺失時(shí)，是否會(huì)引起小鼠表型及相關(guān)系統(tǒng)功能異常。

基因重組工程為研究基因在組織或細(xì)胞中的功能提供了極大的便利。條件敲除通過染色體特異性重組酶系統(tǒng)Cre-LoxP和FLP-frt來實(shí)現(xiàn)，在待敲除的一段目標(biāo)DNA序列的兩端各放置一個(gè)LoxP（或Frt）序列，構(gòu)建條件基因打靶載體選擇標(biāo)記盒，得到flox（Flanked by loxP）小鼠。將fi ox小鼠與帶有細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre（或Flp）的小鼠交配繁殖，以獲得在特定細(xì)胞里把目標(biāo)基因敲除掉的小鼠，即條件性基因敲除小鼠［16］。與傳統(tǒng)的全身敲除技術(shù)相比，條件性基因敲除小鼠可以使靶基因的表達(dá)或缺失發(fā)生在小鼠發(fā)育的某一階段或某一特定的組織器官，從而使對(duì)小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可控狀態(tài)。

隨著基因打靶小鼠模型的廣泛應(yīng)用，如何快速、有效地構(gòu)建基因打靶載體越來越引起人們的重視。李大力教授實(shí)驗(yàn)室選擇改良后的Red重組系統(tǒng)，利用50bp的同源重組序列直接從BAC載體中克隆出長片段的小鼠基因組序列，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程不涉及大片段的酶切連接反應(yīng)［9］。通過同時(shí)共轉(zhuǎn)染一條單鏈DNA寡核苷酸和一條雙鏈選擇標(biāo)記盒到BAC的兩個(gè)位點(diǎn)，Warming教授將傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)簡化為兩步反應(yīng)：單循環(huán)的BAC修飾和修復(fù)過程［17］。本實(shí)驗(yàn)室所用的基因敲除打靶載體構(gòu)建，是在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增、酶切和連接等技術(shù)構(gòu)建法基礎(chǔ)上，利用新型DNDF7載體和已攜帶LoxP位點(diǎn)的LPL4載體，將目的基因的上、中、下游同源臂依次分段插入，雖然涉及大片段的酶切連接反應(yīng)，但已有利用此兩種新型載體構(gòu)建Spag6條件基因敲除載體的成功經(jīng)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方法成熟，成功率高。利用含LoxP位點(diǎn)的LPL4載體，只需通過酶切把攜帶LoxP位點(diǎn)的目的片段及其上、下游同源臂加載在DNDF7載體上，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)受體靶分子的目的改造，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程不需要再單獨(dú)完成插入LoxP位點(diǎn)的步驟，大大縮短了構(gòu)建載體的時(shí)間。重組酶Cre（Cyclization Recombination Enzyme），是一種來源于噬菌體P1的酶蛋白，可以催化LoxP位點(diǎn)間的DNA進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組。LoxP是重組酶Cre的識(shí)別位點(diǎn)，王雪敏教授所在實(shí)驗(yàn)室曾選擇在PPARγ DNA的第1、2個(gè)外顯子的兩側(cè)分別插入一個(gè)LoxP 序列的轉(zhuǎn)基因純合子小鼠，當(dāng)重組酶Cre表達(dá)后，可以特異性的識(shí)別PPARγ兩側(cè)的這兩個(gè)LoxP序列，并切斷DNA雙鏈，使得PPARγ第1、2個(gè)外顯子缺失，達(dá)到影響PPARγ表達(dá)效果的作用［18］。本文構(gòu)建S-Sox5條件基因敲除載體時(shí)，同樣在S-Sox5兩側(cè)加入兩個(gè)LoxP序列，使得S-Sox5的第1外顯子缺失，達(dá)到影響S-Sox5表達(dá)的效果。隨后對(duì)構(gòu)建的最終載體僅需設(shè)計(jì)針對(duì)性的引物進(jìn)行測序鑒定，確認(rèn)2個(gè)LoxP位點(diǎn)的存在及序列正確，證實(shí)所構(gòu)建的基因打靶載體序列準(zhǔn)確，無突變發(fā)生。

基因敲除研究現(xiàn)在已發(fā)展出很多新的基因編輯技術(shù)，如RNAi、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）和集群規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/Cas9蛋白（CRISPR/Cas9）等［19，20］。這些技術(shù)與同源重組技術(shù)比較，可減少后期陽性細(xì)胞篩選工作，促進(jìn)敲除動(dòng)物的制備，在基因敲除斑馬魚、小鼠等研究中有了很大的進(jìn)展［21，22］，但可能的 “off target”效應(yīng)極大影響該技術(shù)的廣泛應(yīng)用 。本文使用的LPL4質(zhì)粒作為一種功能載體已連接好LoxP位點(diǎn)，并在Ching-kang Chen教授實(shí)驗(yàn)室被廣泛成功使用于基因打靶載體構(gòu)建，獲得了良好效果。因此為簡化實(shí)驗(yàn)步驟提供了便利條件，利于在其他實(shí)驗(yàn)室開展。

打靶載體成功構(gòu)建后，后續(xù)將完成ES細(xì)胞的篩選，根據(jù)Ching-kang Chen教授實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)，DNDF7載體可使ES細(xì)胞陽性克隆率達(dá)到20%～30%［23］。原因是DNDF7質(zhì)粒作為一種新型載體，同時(shí)含有DTa和NEO兩種細(xì)胞篩選抗性的markers，大大增加了ES細(xì)胞篩選的陽性率，從而提高實(shí)驗(yàn)效率。ES細(xì)胞完成后，將產(chǎn)生LoxP fi oxed小鼠（即在目的基因兩端擁有附加LoxP序列的小鼠），與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，產(chǎn)生特定的條件突變小鼠。該過程將耗時(shí)1～1.5年，獲得目的小鼠后方可進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)制備的S-Sox5 KO載體僅僅用于體內(nèi)條件敲除小鼠的制備，無法用于體外功能試驗(yàn)。

已知，基因打靶效率的高低往往與打靶載體中所用基因組同源區(qū)的長短有關(guān)，同源區(qū)越長所介導(dǎo)的基因打靶效率就會(huì)越高。然而，用PCR擴(kuò)增來獲得基因同源區(qū)，同源區(qū)越長就越難得到PCR產(chǎn)物，同樣PCR產(chǎn)物越大產(chǎn)生突變的概率越高［24］。本實(shí)驗(yàn)亞克隆的基因組DNA全長約8kb，其中包括約4.8kb的長臂同源區(qū)和2.5kb的短臂同源區(qū)。鑒于上游同源臂片段較長，大小接近5kb，在選擇長鏈PCR專用試劑及特定條件獲得PCR產(chǎn)物后，通過反復(fù)摸索實(shí)驗(yàn)條件，我們選擇構(gòu)建upper-arm/DNDF7和LoxP-middle piece-LoxP/ down-arm/DNDF7兩種重組質(zhì)粒，進(jìn)而經(jīng)AvrII+NotI雙酶切獲得最終S-Sox5 KO。為進(jìn)一步構(gòu)建基因敲除小鼠，研究相關(guān)基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 Reiprich S， Kriesch J， Schreiner S， et al. Activation of Krox20 gene expression by Sox10 in myelinating Schwann cells. J Neurochem 2010； 112（3）: 744-754

2 Hernandez-Hernandez JM， Delgado-Olguin P，Aguillon-Huerta V， et al. Sox9 represses alpha-sarcoglycan gene expression in early myogenic differentiation. J Mol Biol 2009； 394（1）: 1-14

3 Donner AL， Episkopou V， Maas RL. Sox2 and Pou2f1 interact to control lens and olfactory placode development. Dev Biol 2007； 303（2）: 784-799

4 Kormish JD， Sinner D， and Zorn AM， Interactions between SOX factors and Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Dev Dyn 2010； 239（1）: 56-68

5 Chew LJ， Gallo V. The Yin and Yang of Sox proteins:Activation and repression in development and disease. J Neurosci Res 2009； 87（15）: 3277-3287

6 Lefebvre V.The SoxD transcription factors-Sox5， Sox6，and Sox13-are key cell fate modulators. Int J Biochem Cell Biol 2010； 42（3）: 429-432

7 Denny P， Swift S， Connor F， et al. An SRY-related gene expressed during spermatogenesis in the mouse encodes a sequence-specifi c DNA-binding protein. EMBO J 1992；11（10）: 3705-3712

8 Hiraoka Y， Ogawa M， Sakai Y， et al. The mouse Sox5 gene encodes a protein containing the leucine zipper and the Q box. Biochim Biophys Acta 1998； 1399（1）: 40-46

9 姜麗， 葉湘漓， 李大力. 利用Red重組系統(tǒng)快速構(gòu)建基因打靶載體. 中國生物工程雜志 2011； 31（10）: 88-94

10 Wang D， Han S， Wang X， et al. SOX5 promotes epithelialmesenchymal transition and cell invasion via regulation of Twist1 in hepatocellular carcinoma. Med Oncol 2015；32（2）: 461

11 Blaise R， Grober J， Rouet P， et al. Testis expression of hormone-sensitive lipase is conferred by a specific promoter that contains four regions binding testicular nuclear proteins. J Biol Chem 1999； 274（14）: 9327-9334

12 Budde LM， Wu C， Tilman C， et al. Regulation of IkappaBbeta expression in testis. Mol Biol Cell 2002；13（12）: 4179-4194

13 Xu W， Zhang S， Qiu W， et al. Spermatogenesis-related ring fi nger gene ZNF230 promoter: identifi cation and functional analysis. Mol Biol Rep 2009； 36（5）: 1187-1193

14 Wunderle VM， Critcher R， Ashworth A， et al. Cloning and characterization of SOX5， a new member of the human SOX gene family. Genomics 1996； 36（2）: 354-358

15 Kiselak EA， Shen X， Song J， et al. Transcriptional regulation of an axonemal central apparatus gene， spermassociated antigen 6， by a SRY- related high mobility group transcription factor， S-SOX5. J Biol Chem 2010；285（40）: 30496-30505

16 Bouvier J， Cheng JG. Recombineering-based procedure for creating Cre/loxP conditional knockouts in the mouse. Curr Protoc Mol Biol 2009； Chapter 23:Unit 23.13

17 Newman RJ， Roose-Girma M， Warming S. Efficient conditional knockout targeting vector construction using co-selection BAC recombineering （CoSBR）. Nucleic Acids Res 2015； 43（19）: e124

18 吳巧琪， 章紅妍， 王震，等. 神經(jīng)干細(xì)胞特異性PPARγ基因敲除小鼠模型的制備與鑒定. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2014； 34（12）: 1768-1771

19 Korge S， Grudziecki A， Kramer A. Highly efficient genome editing via CRISPR/Cas9 to create clock gene knockout cells. J Biol Rhythms 2015； 30（5）: 389-395

20 Hendriks WT， Jiang X， Daheron L， et al. TALEN- and CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human pluripotent stem cells using lipid-based transfection. Curr Protoc Stem Cell Biol 2015； 34: 5B.3.1-5B.3.25

21 Qin W， Liang F， Feng Y， et al. Expansion of CRISPR/ Cas9 genome targeting sites in zebrafish by Csy4-based RNA processing. Cell Res 2015； 25（9）: 1074-1077

22 Miura H， Gurumurthy CB， Sato T， et al. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Sci Rep 2015； 5: 12799

23 Shim H， Wang CT， Chen YL， et al. Defective retinal depolarizing bipolar cells in regulators of G protein signaling （RGS） 7 and 11 double null mice. J Biol Chem 2012； 287 （18）: 14873-14879

24 王俊平， 張友明. Red/ET重組在基因打靶載體快速構(gòu)建中的應(yīng)用. 遺傳 2005； 27（6）: 953-958

（2015-06-02收稿）

Construction of a knockout vector targeting S-Sox5 gene using DNDF7 vector and a novel LPL4 plasmid carrying two LoxP sites*

Liu Junpin1， Wang Zhiqiong2， Ping Guanglun1， Shi Yuqin1， Zhang Ling1**， Zhang Zhibing1，3**
1. School of Public Health， Wuhan University of Science and Technology， Wuhan， 430065； 2. Department of Hematology，Tongji Medical College of Huazhong University of Science & Technology； 3. Department of Obstetrics & Gynecology，Virginia Commonwealth University， Richmond， VA， USA. 23298

Zhang Ling， E-mail: zhangling7015@126.com； Zhang Zhibing， E-mail: zhangzhibing@ hotmail.com

Objective It has been shown that S-SOX5 transcriptionally regulates sperm associated antigen 6 （Spag6），a gene essential for ciliary function. The aim of this study is to construct a knockout vector targeting S-Sox5 gene to investigate its function in vivo. Methods The DNDF7 vector and the LPL4 vector carrying two LoxP sites were used to generate the S-Sox5 targeting vector. Briefi y， exon 1 of S-Sox5 was selected as the targeting region （middle piece）， and DNA from ES cells （SV129 background） was used as a template to amplify upper arm and down arm fi anking the targeting region. The middle piece was cloned into LPL4 vector. Then， the middle piece， together with the two LoxP sites were released from the LPL4 vector and ligated to DNDF7 plasmid. The upper arm and down arm were also cloned into DNDF7 vector subsequently to create the fi nal construct targeting exon 1 of S-Sox5. Results The S-Sox5 KO vector was confi rmed by series digestion with restriction enzymes and DNA sequencing. Conclusion Successfully constructing the S-Sox5 KO vector provides a tool to make a fi oxed S-Sox5 mice model and study the role of S-Sox5 in specifi c cells/tissues in vivo.

S-Sox5 gene； gene-targeting vector； DNDF7 vector； LPL4 vector

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.002

R 349

資助: 國家自然基金青年基金項(xiàng)目（81300536，81571428，81502792）；

湖北省衛(wèi)生廳項(xiàng)目青年基金（WJ2015Q026， QJX2012-22）

**共同通訊作者: 張玲， E-mail: zhangling7015@126.com； 張志兵， E-mail: zhangzhibing@ hotmail.com