PDGF-BB對(duì)大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

羅金泰余文俊韋安陽(yáng)袁 堅(jiān)曾國(guó)華

1. 廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院微創(chuàng)外科中心泌尿外科（廣東省泌尿外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）（廣州 510230）；2. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院惠僑樓泌尿外科

PDGF-BB對(duì)大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

羅金泰1*余文俊1韋安陽(yáng)2袁 堅(jiān)1曾國(guó)華1

1. 廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院微創(chuàng)外科中心泌尿外科（廣東省泌尿外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）（廣州 510230）；2. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院惠僑樓泌尿外科

目的 探討血小板源性生長(zhǎng)因子BB（PDGF-BB）對(duì)大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞（CCSMC）增殖和周期的影響。方法 使用改良組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組和不同濃度PDGF-BB處理組，分別采用MTS法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PDGF-BB對(duì)CCSMC增殖和周期的影響。結(jié)果 MTS法提示PDGF-BB促進(jìn)CCSMC增殖，且在一定時(shí)間范圍和濃度范圍內(nèi)分別呈時(shí)間依賴和濃度依賴；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示PDGF-BB作用后G0/G1期細(xì)胞由（90.79±3.46）%減少至（77.57±5.72）%；而S期的細(xì)胞由（7.85±2.68）%升高至（16.47±4.42）%；G2/M期由（2.46±1.25）%升高至（5.96±2.18）%，兩組間差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 PDGF-BB可促進(jìn)大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞增殖。

血小板源性生長(zhǎng)因子； 肌細(xì)胞，平滑肌； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞周期

血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是體內(nèi)一種強(qiáng)效促有絲分裂劑，在細(xì)胞的增殖、分化、組織損傷的修復(fù)及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中起重要作用。PDGF對(duì)血管平滑肌細(xì)胞相類似的陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞（corpus cavernosum smooth muscle cell，CCSMC）是否有促進(jìn)其增殖的作用，目前尚不清楚。本研究將探討PDGF-BB對(duì)促進(jìn)CCSMC增殖的影響。

材料與方法

一、材料

SD大鼠購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，PDGF-BB購(gòu)于美國(guó)R&D公司，MTS購(gòu)于美國(guó)Premoga公司。

二、方法

（一）CCSMC原代培養(yǎng)

采用改良組織塊法原代培養(yǎng)CCSMC，選取200g左右7周齡雄性SD大鼠1只（清潔級(jí)），斷頸椎處死大鼠，以75%酒精浸泡大鼠約3 min。在無菌條件下快速切開包皮，在陰莖腳水平橫行切取陰莖，迅速移入含有雙抗的PBS緩沖液中，去除陰莖軟骨、尿道、纖維、脂肪及血管等組織。經(jīng)PBS漂洗2次洗去血細(xì)胞后，將海綿體組織剪成（0.5～1）mm3組織塊，按0.5 cm的間隔放置到涂有含20%胎牛血清的DMEM/ F12培養(yǎng)基的25 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，再將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)使組織塊位于上方，5 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊與培養(yǎng)基接觸，在37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 d左右見有細(xì)胞從組織塊爬出，遂剔除組織塊。細(xì)胞融合至約90%時(shí)用胰酶消化細(xì)胞，后加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，制成單細(xì)胞懸液，靜置20min后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)培養(yǎng)皿中，再次靜置、貼壁，如此重復(fù)兩次后，將培養(yǎng)皿放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至約90%時(shí)，按1:3傳代培養(yǎng)。

（二）CCSMC鑒定

1. 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞大小、形態(tài)和生長(zhǎng)特點(diǎn)等。

2. α- SMA免疫熒光染色：將約1×105個(gè)細(xì)胞接種于含無菌載玻片的12孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至80%～90%融合后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌5min×3次，用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌5min×3次，0.3%Triton X-100破膜3min，PBS洗滌5min×3次，5%BSA封閉45min，吸去BSA，SMA一抗（1:200稀釋）4℃孵育過夜，PBS洗滌5min×3次，熒光二抗（1:200稀釋）避光室溫孵育45min，PBS洗滌5min×3次， DAPI染核，PBS洗后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

（三）實(shí)驗(yàn)分組

原代培養(yǎng)的2-4代大鼠CCSMC用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和不同濃度（5、10、20、40ng/mL）PDGF-BB組，不同濃度PDGF-BB作用細(xì)胞24h。以及空白對(duì)照組和20ng/mL PDGF-BB作用細(xì)胞不同時(shí)間（24、48、72h）組。

（四）MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

將制備的CCSMC懸液接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種含5×103個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)液100μL。經(jīng)CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，換無血清的DMEM培養(yǎng)液同步化細(xì)胞24 h，分為1%FBS培養(yǎng)基空白對(duì)照組及1%FBS培養(yǎng)基加不同濃度PDGF-BB（5、10、20、40ng/mL）的各組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d，行MTS檢測(cè)，每孔加入MTS20μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光值，記為A490。

（五）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化，再將其分為空白對(duì)照組與20ng/mL PDGF-BB處理組繼續(xù)培養(yǎng)24h，消化細(xì)胞，離心及PBS漂洗，75%冰乙醇中固定，4℃過夜，次日離心并用PBS漂洗，棄上清液后每管加500μL PBS，25μL PI，2.5μL RnaseA溶液，37℃水浴1h，300目濾網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)兩兩比較采用單因素方差分析。

結(jié) 果

一、陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)情況及鑒定

倒置相差顯微鏡觀察：原代培養(yǎng)第4天，可見少許CCSM從組織塊邊緣爬出，形態(tài)多樣，大部分呈梭型，見圖1A。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至融化后，部分區(qū)域呈多層重疊，部分呈單層，高低起伏，呈現(xiàn)平滑肌細(xì)胞特征性的“峰-谷”樣生長(zhǎng)，見圖1B。α-SMA免疫熒光鑒定：熒光顯微鏡下可見綠色熒光分布在胞核和胞漿中，陽(yáng)性率達(dá)95%以上，見圖1C。

圖1 CCSMC生長(zhǎng)情況及鑒定A: CCSMC從組織塊中爬出（×40）； B: CCSMC呈“峰-谷”樣生長(zhǎng)（×100）； C: CCSMC免疫熒光染色α-SMA陽(yáng)性表達(dá)（×200）

二、PDGF-BB對(duì)CCSMCs增殖的影響

MTS結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PDGF-BB刺激后，CCSMCs增殖能力均增強(qiáng)，隨著時(shí)間的增加，增殖能力逐漸增強(qiáng)，第5天達(dá)到峰值，隨后增殖能力開始減弱，在一定時(shí)間范圍內(nèi)呈時(shí)間依賴；一定濃度范圍內(nèi)PDGF-BB刺激后CCSMCs增殖能力隨濃度增加而增強(qiáng)，呈濃度依賴，20ng/mL PDGF為峰濃度，與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 PDGF-BB對(duì)CCSMCs增殖的影響MTS檢測(cè)不同濃度（0、5、10、20、40ng/mL）PDGF-BB作用CCSMCs不同時(shí)間（1～7d）后細(xì)胞的增殖情況。第5天達(dá)到增殖高峰，20ng/mL PDGF為峰濃度

三、PDGF-BB對(duì)CCSMCs周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較G0/G1期細(xì)胞由（90.79±3.46）%減少至（77.57±5.72）%；而S期的細(xì)胞由（7.85±2.68）%升高至（16.47±4.42）%；G2/M期由（2.46±1.25）%升高至（5.96±2.18）%，兩組間差異顯著（P＜0.05），見圖3。

討 論

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是中老年男性的常見病、多發(fā)病。近年來，隨著生活、工作、心理等各方面的壓力逐步加大，ED的患病率呈現(xiàn)不斷增高并出現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)。ED的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程。目前ED的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，有研究表明低氧與ED有著密切的關(guān)系，認(rèn)為低氧引起ED的機(jī)制主要是海綿體纖維化學(xué)說，而另一種可能機(jī)制是產(chǎn)生引起血管緊張度增加的各種因子，如血小板源性生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮素和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等［1，2］。有學(xué)者采用大鼠海綿體體外模擬低氧環(huán)境，發(fā)現(xiàn)短暫的低氧能夠?qū)е麓笫蠛＞d體PDGF及其受體過表達(dá)，長(zhǎng)期則會(huì)導(dǎo)致海綿體纖維化［3］。

PDGF是一類強(qiáng)有效的促有絲分裂劑和化學(xué)誘導(dǎo)劑［4］。PDGF有5種亞型，分別為PDGF-AA、PDGFAB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD，其中PDGFBB被認(rèn)為是其家族中促進(jìn)有絲分裂能力最強(qiáng)的成員。PDGF必須與細(xì)胞表面相關(guān)受體結(jié)合后，才能激活胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，通過自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，參與胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、正常生理活動(dòng)及多種疾病（如纖維增生性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和腫瘤）的發(fā)生發(fā)展等多項(xiàng)生命活動(dòng)［5-8］。目前己發(fā)現(xiàn)多條相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)路徑［9，10］，如ERK通路，PI3K/ Akt通路，MAPK通路，PLC通路，Src通路，Ca2+通路，JAK/STAT通路，PKA通路，G蛋白耦聯(lián)受體等。以上多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑相互聯(lián)系，形成一個(gè)龐大而復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)PDGF對(duì)細(xì)胞的作用。

PDGF-BB是否可以促進(jìn)CCSMC增殖目前未見報(bào)道，本文是首次報(bào)道PDGF-BB對(duì)CCSMC增殖的影響。本研究通過MTS檢測(cè)PDGF-BB對(duì)CCSMC增殖的影響。MTS結(jié)果提示PDGF-BB的作用在一定時(shí)間范圍和濃度范圍內(nèi)分別呈時(shí)間依賴和濃度依賴，PDGFBB刺激后第5天達(dá)到增殖高峰而后細(xì)胞逐漸凋亡，20ng/mL PDGF-BB為促增殖的峰濃度。

圖3 PDGF-BB對(duì)CCSMCs周期的影響A: 對(duì)照組流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞DNA直方圖； B: PDGF組流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞DNA直方圖； C: PDGF-BB作用后CCSMC細(xì)胞周期的變化情況， 細(xì)胞經(jīng)過PDGF-BB作用后G0/G1期細(xì)胞減少， S期細(xì)胞增加， G2/M期增加，*P＜0.05 與對(duì)照組比較

同時(shí)，為進(jìn)一步探討PDGF-BB促陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞增殖的可能作用機(jī)制。本研究還應(yīng)用流式細(xì)胞儀觀察PDGF-BB對(duì)細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞周期的影響。G1為DNA合成前期，此期為過渡至S期作準(zhǔn)備，發(fā)生的是與DNA合成有關(guān)的生化變化；S期為DNA合成期，可反映細(xì)胞的分裂活力，增殖旺盛的細(xì)胞處于S期的比例較高；G2為DNA合成后期，M期為有絲分裂期，（S+G2M）%為增殖指數(shù)，代表了細(xì)胞中增殖細(xì)胞的數(shù)量，在一定程度上反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PDGF-BB處理組G1期細(xì)胞減少，S期與G2/M期細(xì)胞增多，其可能作用機(jī)制是促使靜止態(tài)的G1期細(xì)胞活躍而向S期轉(zhuǎn)變，使DNA合成量增加，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了PDGFBB作用后CCSMC處于增殖狀態(tài)。

通過以上研究證實(shí)PDGF-BB可促進(jìn)大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞增殖，然而其具體機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步深入研究，為ED發(fā)病機(jī)制的明確和疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。

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（2015-05-25收稿）

The effects of PDGF-BB on cell proliferation and cell cycle of corpus cavemosum smooth muscle cells in SD rat

Luo Jintai1*， Yu Wenjun1， Wei Anyang2， Yuan Jian1， Zeng Guohua1
1. Department of Urology， Minimally Invasive Surgery Center， The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University. Guangdong Key Laboratory of Urology， Guangzhou 510230， Guangdong， China
2. Division of Urinary Surgery， Huiqiao Department， Nanfang Hospital， Southern Medical University

Luo Jintai， E-mail: 2961944548@qq.com， Tel: 13922449294

Objective To evaluate the effect of the platelet-derived growth factor-BB （PDGF-BB） on cell proliferation and cell cycle of corpus cavemosum smooth muscle cells （CCSMCs） in SD rat. Methods CCSMCs were primarily cultured and subjected to immunocytochemical assay. The cells were divided into different concentrations of PDGF-BB groups and a nromal control group. The MTS method and fi ow cytometry were used respectively to detect cell proliferation and cycle. Results MTS analysis suggested PDGF-BB increased CCSMC proliferation， and exhibited time dependent and concentration dependent mode； Flow cytometry results showed that the proportion of cells in G0/G1 phase decreased from（90.79±3.46）% to （77.57±5.72）%； And the proportion of cells in S phase was increased from （7.85±2.68）% to （16.47±4.42）%；G2/M phase cells from （2.46±1.25）% to （5.96±2.18）%， there were signifi cant differences between the two groups （P＜0.05）. Conclusion PDGF-BB may promote rat corpus cavernosum smooth muscle cell proliferation.

platelet-derived growth factor； myocytes， smooth muscle； cell proliferation； cell cycle

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.006

R 698.1

*通訊作者， E-mail: 2961944548@qq.com， Tel: 13922449294