miR-34b在男性不育患者精漿中的表達及其臨床意義*

婁江濤 魏任雄余亮亮 張曉霞 崔 云

浙江中醫(yī)藥大學附屬寧波中醫(yī)院男科實驗室（寧波 315012）

miR-34b在男性不育患者精漿中的表達及其臨床意義*

婁江濤 魏任雄**余亮亮 張曉霞 崔 云

浙江中醫(yī)藥大學附屬寧波中醫(yī)院男科實驗室（寧波 315012）

目的 研究精漿游離miR-34b在體外不同條件下的穩(wěn)定性及其與男性不育癥患者精液參數(shù)的關(guān)系。方法 選取男性不育癥患者80例和同期因女方因素不孕前來檢查的生育力評估正常的健康男性20例為正常對照組，將8例正常的精液標本分別在室溫和-80℃下放置，以不同時間點檢測精漿miR-34b的穩(wěn)定性。采用實時熒光定量PCR檢測精漿游離miR-34b的相對含量，精子濃度及精子活力用計算機輔助精子分析系統(tǒng)，精子存活率采用低鹽膨脹實驗檢測，正常精子形態(tài)百分率采用Diff-Quick染色法。分析男性不育癥組和正常對照組精液參數(shù)及miR-34b表達量的差異，對精漿游離miR-34b在男性不育組精漿中的診斷價值進行ROC曲線分析，并采用Pearson直線相關(guān)分析miR-34b與男性不育組精液各參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果 精漿游離miR-34b在室溫和低溫下不同時間點表達量無明顯變化（F=0.13， P=0.97； F=0.35，P=0.84）。與正常組比較發(fā)現(xiàn)，男性不育組精漿游離miR-34b表達下調(diào)（P＜0.01）。兩組的精子濃度、精子存活率、前向運動精子百分率（PR）和正常形態(tài)精子百分率均有差異（P＜0.01）。ROC曲線顯示miR-34b能夠較好的區(qū)分不育組與健康對照組，曲線下面積分比（AUC）為0.85（0.79-0.95，95%）。Pearson直線相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)男性不育患者精漿miR-34b表達量與精子密度（r =0.28，P＜0.05）、精子活率（r =0.56，P＜0.01）、前向運動精子百分率（r =0.41，P＜0.01）正相關(guān)，與精子形態(tài)無相關(guān)性（r =0.15，P＞0.05）。結(jié)論精漿miR-34b在室溫下穩(wěn)定，并能在-80℃條件下長期保存，在男性不育患者精漿中表達下調(diào)，并與精子濃度、精子存活率、前向運動精子百分率呈正相關(guān)，與精子形態(tài)無相關(guān)性。

不育， 男性； 微RNAs； ROC曲線

男性不育癥診治困難，相關(guān)致病機制尚不清楚。microRNA（miRNA）作為新的切入點，為疾病的認識開辟了一條新的途徑。研究表明miRNA分子在精子形成過程中發(fā)揮重要作用［1］， Bouhallier 和Rokavec等認為miR-34基因家族參與細胞周期、凋亡的調(diào)控，與精子的發(fā)生、凋亡關(guān)系密切［2，3］。本研究通過觀察miR-34b在男性不育癥中的表達特征，旨在闡明男性不育發(fā)生的一種可能機制，為臨床診治提供一種新的分子標志物。

資料與方法

一、對象

選取2012年8月至2014年11月來我院男科就診的男性不育癥患者80例。年齡24～41歲，平均（31.06±4.66）歲。病程2～10年，平均（3.5±4.1）年?；辇g2.4～11年，平均（4.8±4.7）年。身體健康，夫妻性生活正常，未采取任何避孕措施1年以上未使女方懷孕。查體及彩色多普勒超聲檢查未發(fā)現(xiàn)明顯睪丸、附睪、輸精管異常以及精索靜脈曲張。女方均經(jīng)婦科檢查，輸卵管通暢實驗以及B超、內(nèi)分泌測定等排除女方不孕因素，同時排除內(nèi)分泌、遺傳、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、慢性阻塞性肺疾病，肝腎功能異常以及感染等。另外選擇同期因女方因素不孕前來檢查的生育力評估正常的健康男性20例為正常對照組，年齡25～39歲，平均（29.35±3.36）歲。兩組在年齡結(jié)構(gòu)、婚齡等基線資料方面經(jīng)檢驗齊同性良好，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有對象均簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。

二、主要試劑和儀器

WLJY-9000偉力彩色精子檢測系統(tǒng)（北京偉力公司），Diff-Quick染液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，miR-34b TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaqMan miRNA qPCR試劑盒，TaqMan small RNA引物（5×），Taq Man small RNA引物（20×）均購自美國ABI有限公司。Trizol購自美國Invirtrogen 公司，高速冷凍離心機采用美國Beckman Coulter公司Allegra 64R，普通PCR儀為美國BIO-RAD公司S1000 Thermal Cycler，實時熒光定量PCR儀為美國BIO-RAD公司CFX96。

三、試驗方法

（一）標本采集

依WHO要求，采集精液前禁欲3～7d，排小便，洗凈雙手，用手淫法收集全部精液于干燥消毒的精液采集器內(nèi)，置37℃多維混勻恒溫箱，觀察精液液化時間，待充分液化后行精液常規(guī)檢查，3 000×g，離心15min，取精漿即時測定精漿miR-34b，或置-80℃冰箱保存待用，用以批量測定miR-34b。

（二）精液分析

依照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）要求進行精液分析［4］，液化時間通過肉眼觀察和顯微鏡進行識別判讀，待精液液化后借用北京偉力計算機輔助精子分析系統(tǒng)，在帶有加熱37℃載物臺的顯微鏡下分析精子活力和精子濃度，精子存活率采用低滲膨脹實驗（HOS）。精子形態(tài)采用Diff-Quick染色法。

（三）精液總RNA 的提取

1. 預處理：取200μL精漿加入2μL濃度為100μg/mL蛋白酶K于37℃水浴箱1h后，再加入140μL醋酸鈉、60μLβ-巰基乙醇、50μL PBS和0.024 PVP充分混勻于室溫下放置15min，然后4℃1 2000×g，離心10min，取上清液用于TRIzol 法提取RNA。

2. TRIzol法提取RNA：取200μL預處理的精漿加入1mL TRIzol中充分均勻，將勻漿液倒入1.5mL離心管中， 再依次加入氯仿、異丙醇及95%乙醇，獲得總RNA。

3. 提取效率評估：用20μL DEPC 水溶解RNA 沉淀，取2μL總RNA加入 98μL DEPC 水稀釋后用分光光度計測定A260 /A280，比值在1.8～2.0用于后續(xù)實驗。

（四）逆轉(zhuǎn)錄和Q-PCR

按照TapMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按比例配制RT混合液，分別加入TaqManhsa-miR-34b引物（5×）或內(nèi)參TaqMan U6 sn RNA引物（5×），使用RT-PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄。合成cDNA后，按照TaqManmiRNA qPCR試劑說明書進行實時熒光定量PCR檢測，混合加入TaqMan Universal PCR混合試劑Ⅱ（不含UNG），分別加入Taq Manhsa-miR-34b引物（20×）或內(nèi)參TaqManU6snRNA引物（20×）。以U6的量為內(nèi)參照，計算miR-34b的相對表達量△Ct為2Ct（U6）-Ct（miR-34b）。

（五）精液中miR-34b穩(wěn)定性檢測

選取精液參數(shù)正常的男性精液8份，離心后留取精漿2000μL，分成2份，各1 000μL，檢測在以下2種環(huán)境中的穩(wěn)定性：（1）室溫孵育，將精漿分別放置室溫下0、2、4、8和24h后，各取出200μL檢測精漿miR-34b的表達情況。（2）放置-80℃μ冰箱內(nèi)，分別在1、3、7、15和30d 5個時間點各取出200μL，檢測精漿miR-34b的表達情況。。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。經(jīng)正態(tài)性檢驗，精液質(zhì)量參數(shù)和精漿miR-34b相對表達量符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標準差（±s）表示；兩組間比較采用均數(shù)比較的 t 檢驗，多組間比較采用方差分析，用Pearson 進行miR-34b與精液其他參數(shù)的相關(guān)性分析，檢驗水準α=0.05。

結(jié) 果

一、精漿miR-34b穩(wěn)定性檢測

在室溫分別放置0、2、4、8和24h以及在-80℃冰箱內(nèi)放置1、3、7、15和30d后精漿miR-34b相對表達量均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），結(jié)果見表1。

二、男性不育癥組及正常對照組精液常規(guī)主要參數(shù)和精漿miR-34b表達的比較

男性不育癥組miR-34b表達量明顯下調(diào)，兩組比較精子濃度、前向運動精子百分率、精子存活率、正常精子形態(tài)百分率以及miR-34b表達均有非常顯著性差異（P ＜0.01），見表2。

表 1 不同條件下精漿miR-34b相對表達量比較（n=8）

表 1 不同條件下精漿miR-34b相對表達量比較（n=8）

室溫放置（h） -80℃冰箱內(nèi)放置（d）時間點 0 2 4 8 24 1 3 7 15 30 miR-34b（×10-2） 9.43±5.57 9.84±4.79 9.14±5.62 10.06±3.81 9.64±5.02 8.68±4.62 9.09±4.05 8.23±3.36 9.81±5.13 9.14±4.71 F 013 0.35 P 0.97 0.84

表2 男性不育癥組及正常組精液常規(guī)主要參數(shù)和精漿miR-34b表達的比較（）

表2 男性不育癥組及正常組精液常規(guī)主要參數(shù)和精漿miR-34b表達的比較（）

分組 n 精子濃度 精子存活率 前向運動精子 正常精子形態(tài) miR-34b含量（×106/mL） （%） （%） （%） （×10-2）正常組 20 107.40±48.68 69.50±5.92 43.50±5.91 8.01±1.45 9.19±3.11男性不育癥組 80 71.76±54.21 43.40±17.96 20.11±13.25 3.53±1.51 4.83±2.24 t 2.68 10.85 11.77 11.99 5.89 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

三、ROC曲線

繪制ROC曲線評估精漿miR-34b對男性不育癥的診斷價值，其曲線下面積為0.85（0.79～0.95，95%），當選擇最佳診斷截斷值4.66×10-2時，其敏感度為95.00%，特異度為70.00%，見圖1。

四、男性不育癥組精液常規(guī)參數(shù)與精漿miR-34b的相關(guān)性分析

miR-34b與精子濃度、精子存活率、前向運動精子百分率呈非常顯著正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），與正常精子形態(tài)百分率無相關(guān)性，結(jié)果見表3。

表3 男性不育癥組精液常規(guī)參數(shù)與精漿miR-34b的相關(guān)性分析

圖1 miR-34b診斷男性不育癥的ROC曲線

討 論

在我國，15%生育年齡的夫婦不能生育，其中20%完全是男性的原因， 30%與夫婦雙方有關(guān)，即大約50%的不育因素涉及到男性［5］。由于其致病因素復雜，往往僅表現(xiàn)為精子常規(guī)質(zhì)量異常甚至正常，臨床診治手段還很有限，評估男性生殖能力主要應用精液常規(guī)質(zhì)量分析，但精液質(zhì)量常規(guī)參數(shù)受睪丸內(nèi)部及外部多種因素的影響，反映的僅是表象數(shù)據(jù)，因此無任何一項常規(guī)質(zhì)量參數(shù)可作為不育癥的決定性診斷，尋找不育癥的生物學標志一直以來都是一個重要的研究方向，由于體液的易于獲得，人們更傾向于在體液中尋找生物學標志。miRNA作為新的切入點是近年來各學科關(guān)注的焦點， miRNA是一種非編碼的、大小為22nt左右的單鏈小分子RNA，由于可游離于體液中，被認為是一種潛在的很有前途的具有組織特異性的無創(chuàng)生物標記物［6］。已有相當多的研究報道了在產(chǎn)前［7］以及各種腫瘤［8-10］、心血管?。?1］等多種疾病的診斷和預后中利用血清、唾液、尿液、胸腹水等體液miRNA。同樣，精漿游離miRNA 有望成為男性生殖疾病的非侵入性診斷標記分子和生殖遺傳的表觀遺傳篩查的指標。

Weber等［12］通過比較12種體液的游離miRNA發(fā)現(xiàn)，精漿中游離miRNA種類數(shù)高居第二位。Huang等［13］發(fā)現(xiàn)精漿中游離RNA含量豐富，明顯高于血漿和唾液。精漿是由前列腺、精囊、尿道球腺和旁腺等附屬腺分泌的物質(zhì)，成分復雜，內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)、多糖及降解酶，因此本研究通過先將精漿蛋白質(zhì)、多糖進行去除預處理后再進行TRIzol法提取RNA，發(fā)現(xiàn)其提取效率明顯高于直接TRIzol法，經(jīng)紫外分光光度計測定A260/A280比值均在1.8～2.0之間，而直接TRIzol法僅在1.1左右。為驗證其在體外不同條件下保存的穩(wěn)定性，本研究通過建立的熒光定量PCR技術(shù)檢測了精漿在室溫和-80℃條件下放置不同時間后miR-34b的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各時間點比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示精漿中游離miRNA可能存在某種保護機制而不被機體內(nèi)、外環(huán)境中RNase 降解，在室溫和冰凍條件下均可穩(wěn)定存在，Ikeda等［14］認為miRNA能夠在體外穩(wěn)定存在的原因之一可能是由于miRNA與蛋白共結(jié)合存在。

miR-34是一個保守的miRNA家族，在脊椎動物中，由3個同源miRNA分子組成miR-34a，miR-34b和miR-34c。成熟miR-34a序列位于其主基因原初轉(zhuǎn)錄本的外顯子2內(nèi)，而成熟miR-34b和miR-34c序列分別位于同一主基因原初轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子1 和外顯子2 內(nèi)［15，16］。目前對miR-34基因家族的研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在腫瘤方面具有獨特作用，而miR-34c與雄性生殖關(guān)系密切，如miR-34c能通過Nanos2提高小鼠精原干細胞的分化［17］；在分離粗線期的精母細胞和圓形精子細胞時期miR-34c呈高度表達狀態(tài)［18］；從出生到性成熟期在小鼠的睪丸組織中含量明顯增高［1］。另外miR-34家族成員受p53 直接調(diào)控，同時其還能夠通過對某些p53活性調(diào)節(jié)基因的調(diào)控，進而參與p53 通路的反饋調(diào)節(jié)［19-21］，而p53在睪丸組織高度表達，并與精母細胞的分裂和生精細胞的凋亡關(guān)系密切，參與精子質(zhì)量的控制［2］，提示miR-34可能通過對p53的調(diào)節(jié)而影響精子的生成、發(fā)育。Bouhallier等［2］通過研究證實了miR-34c 可調(diào)節(jié)TGIF2 和NOTCH2 基因表達，進而改變TGFb和NOTCH通路，從而影響精子的發(fā)生和分化。miR-34b和miR-34c的初始轉(zhuǎn)錄本位于同一主基因內(nèi)，而有關(guān)miR-34b與男性生殖系統(tǒng)的研究卻鮮有報道。本研究結(jié)果表明，男性不育組精漿miR-34b表達量明顯下調(diào)，與正常對照組相比有非常顯著性差異（P＜0.01）， 通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，男性不育患者精漿miR-34b表達量與精子密度、精子存活率、前向運動精子百分率均呈正相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）。提示miR-34b可通過某種途徑影響精子質(zhì)量，但miR-34b是否與p53、TGIF2 和NOTCH2等基因存在聯(lián)系尚需進一步研究。通過繪制ROC曲線評估m(xù)iR-34b對男性不育癥的診斷價值，發(fā)現(xiàn)其曲線下面積為0.85（0.79～0.95，95%），當選擇最佳診斷截斷值4.66×10-2時，其敏感度為95.00%，特異度為70.00%，盡管目前的研究結(jié)果在實際的臨床應用中價值有限，但可提示精漿游離miR-34b有望成為男性生殖能力評估的生物學分子，為進一步研究其在不同原因引起的男性不育癥的診斷、療效觀察以及預后評估中提供實驗基礎。

miRNA作為一個關(guān)鍵因素可以決定生殖細胞的功能及命運，通過細胞間的信號轉(zhuǎn)導既可以維持未分化生殖細胞的數(shù)量，又可以促進精子形成過程中的細胞分化［22］。本實驗研究證實精漿miR-34b在常溫及-80℃冰箱保存條件下能夠穩(wěn)定存在，并且精漿miR-34b差別表達于男性不育癥患者與正常人，并與精子濃度、前向運動精子百分率和精子存活率在顯著相關(guān)性，同時在診斷男性不育癥方面亦顯示出較好的臨床診斷價值，為精漿miR-34b能夠成為臨床診斷指標提供了可能。但本研究僅進行了精漿miR-34b與男性不育的表達關(guān)系，關(guān)于其如何影響男性不育癥的發(fā)生以及疾病發(fā)展過程中相關(guān)作用機制和網(wǎng)絡還有待進一步研究。

參 考 論 文

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3 Rokavec M， Li H， Jiang L， Hermeking H. The p53/miR-34 axis in development and disease. Mol Cell Biol 2014；6（3）: 214-230

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（2015-04-15收稿）

The expression of free miR-34b in seminal plasma of male infertility and its signifi cance*

Lou Jiangtao， Wei Renxiaong**， Yu Liangliang， Zhang Xiaoxia， Cui Yun
Laboratory of Andrology， Ningbo TCM hospital affi liated to Zhejiang Chinese medicine university， Ningbo 315012，China

Wei Renxiaong， E-mail: nbxiaowei @163.com

Objective To study the stability of seminal plasma free miR-34b under different conditions in vitro and explore the relationship between miR-34b and semen parameters of male infertility. Methods Eight semen samples with normal parameters were collected， and the stability of the miR-34b at room temperature and -800C was analyzed respectively by time-course. Total of 80 semen samples of male infertility and 20 semen samples of healthy male were collected in the study. The relative expression of seminal plasma free miR-34b was detected by real-time PCR. Routine semen parameter analysis was performed by computer-assisted sperm analysis system. Sperm survival rate and sperm morphology were assayed by hypo-osmotic swelling test and Diff-Quick staining respectively. Analysis differences of semen parameters and miR-34b expression was done between male infertility group and normal control group， and the diagnostic value of seminal plasma free miR-34b in diseases of male infertility was evaluated by ROC curve， the correlation betweenmiR-34b and semen parameters was analyzed by Pearson linear correlation. Results There was no obvious change in the relative expression of seminal plasma free miR-34b between room temperature and -800C （F=0.13， P=0.97； F=0.35， P=0.84）. Compared with that of the normal group， seminal plasma miR-34b expression significantly decreased in male infertility group （t=3.77， P＜0.01）， In addition， there were signifi cant differences in sperm density， sperm living rate， progressive and sperm morphology between two groups （P＜ 0.01）. ROC curve indicated that miR-34b can better distinguish male infertility from healthy controls， and the area under the curve were 0.85 （0.79-0.95，95%）. Pearson correlation analysis showed that seminal plasma miR-34b expression was positively correlated to sperm density（r=0.28， P＜0.05）， sperm living rate （r =0.41，P＜0.01）， progressive （r =0.41， P＜0.01）， respectively. but no correlation to sperm morphology（r =0.15， P＞0.05）. Conclusion Seminal plasma miR-34b is stabilitly at room temperature and can be long-term preservated at low temperature， its' expression decreased in male infertility group， and positively correlated to sperm density， living rate， progressive， but no correlation to sperm morphology.

infertility， Male； MicroRNAs； ROC curve

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.005

R 698.2

資助: 浙江省中醫(yī)藥基金項目（2014ZA100）

**通訊作者， E-mail: nbxiaowei @163.com