牛羊布魯氏菌病四種血清學(xué)檢測方法對比分析

齊景文，依穎新，周艷紅，雷 蕾，楊蘊力，李 祺

（沈陽市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽 110034）

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種廣泛分布于世界各地的人畜共患的傳染病，人類感染后，病程長，反復(fù)發(fā)作，長期不愈，家畜感染則出現(xiàn)流產(chǎn)和不育，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康。近年來，布病在許多國家和地區(qū)再度肆虐[1]，盡管這些國家和地區(qū)都采取各種防控措施，也取得了一定成效，但布病防控工作仍是一個長期而艱巨的任務(wù)。

目前，我國布病的血清學(xué)檢測方法主要有虎紅平板凝集試驗（RBT）、試管凝集試驗（SAT）、補體結(jié)合試驗（CFT）等，RBT用于初篩，SAT和CFT用于診斷定性，就SAT而言，存在一定的假陽性和假陰性[2]，對診斷定性和陽性畜的撲殺有一定影響，而CFT操作復(fù)雜，對檢測者要求高，特異性很好，但有一定假陰性，會出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，對布病的凈化不利，我們希望通過對國際貿(mào)易指定的ELISA檢測方法與國家標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行比對分析，能為國家標(biāo)準(zhǔn)修訂提供參考。

1 材料與方法

1.1 被檢血清

血清樣本為2009-2014年沈陽8涉農(nóng)區(qū)縣（市）送檢復(fù)核樣本669份，其中奶牛樣本383份，羊樣本286份。

1.2 試劑

布魯菌病虎紅平板凝集試驗抗原、標(biāo)準(zhǔn)陰性和陽性血清，來自青島易邦生物工程有限公司；布魯菌病試管凝集試驗抗原、標(biāo)準(zhǔn)陰性和陽性血清，來自青島易邦生物工程有限公司；補體結(jié)合試驗抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清、溶血素和補體，由中國CDC傳染病所提供；布氏桿菌抗體ELISA檢測試驗盒，由美國IDEXX公司提供。

1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀（TECAN，SUNRISE），瑞士TECAN公司產(chǎn)品；洗板機（Columbus M8/2R），瑞士TECAN公司產(chǎn)品；超純水純化系統(tǒng)（Milli-Q-B），美國密理博公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴箱（WS2-261-79），上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠；恒溫培養(yǎng)箱（HPS-250），哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；單、多道移液器（Eppendorf），德國Eppendorf公司生產(chǎn)；離心機（SIGMA，3K30），德國希格瑪離心機有限公司生產(chǎn)。

1.4 試驗方法

虎紅平板凝集試驗（RBT）、試管凝集試驗（SAT）和補體結(jié)合試驗（CFT）按照GB/T 18646-2002進(jìn)行操作與判定，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試驗按試劑操作說明書進(jìn)行操作與結(jié)果判定。

表1 檢測實驗的可能結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 牛羊布魯菌病不同血清學(xué)檢測方法結(jié)果

按《布魯氏菌病防治技術(shù)規(guī)范》要求，RBT陽性而SAT陰性或CFT陰性牛只需間隔30天重新采血檢測，本試驗過程中，出現(xiàn)的可疑牛只，間隔30-45天重新采集血清樣本進(jìn)行了檢測，轉(zhuǎn)陽的和仍然可疑的，按陽性統(tǒng)計，轉(zhuǎn)陰的，按陰性統(tǒng)計，檢測結(jié)果見表2、表3。

為了更好說明四種布魯菌病檢測方法的可靠性，研究中分別利用布魯菌病ELISA檢測結(jié)果與RBT、SAT和CFT檢測結(jié)果分別進(jìn)行比較，采用假陽性率、假陰性率、一致率和Kappa值四種分析指標(biāo)。假設(shè)，實驗中形成的檢測結(jié)果如表1所示。

表2 ELISA與RBT、SAT和CFT檢測同一批奶牛血清樣本布魯菌病結(jié)果

表3 ELISA與RBT、SAT和CFT檢測同一批羊血清樣本布魯菌病結(jié)果

四種分析指標(biāo)的計算方法如下：

假陰性率＝（c/e1）×100%

假陽性率＝（b/e2）×100%

一致率＝[（a+d）/n]×100%

Kappa 值 ={[（a+d）/n]-[（e1r1+e2r2）/n2]}/{1-[（e1r1+e2r2）/n2]}[3]

假陰性率是指確診陰性用某種方法檢測為陽性與此種方法檢測所有陽性之和的百分比；假陽性是指確診為陽性用某種方法檢測為陰性與此種方法檢測所有陰性之和的百分比；一致率是指確診的陽性與陰性樣本且與兩種檢測方法結(jié)果相一致的總和與所有檢測樣本的百分比；Kappa值是醫(yī)學(xué)上常用和一種用于計數(shù)資料的一致性評測，是評價一致性的測量值。假陰性與假陽性能反應(yīng)檢測方法的敏感性和特異性，一致率是檢測方法的相關(guān)程度，Kappa值是一致性檢驗的統(tǒng)計指標(biāo)，一般認(rèn)為，Kappa值≥0.75，說明已經(jīng)取得相當(dāng)滿意的一致程度。若Kappa值＜0.4，則說明一致程度不夠理想。

2.2 ELISA與RBT、SAT和CFT檢測結(jié)果的相關(guān)性比較

通過RBT、SAT、CFT和ELISA四種血清學(xué)方法，對牛羊布魯菌病檢測結(jié)果的對比，可以得出：RBT、SAT、CFT與ELISA檢測的一致率較高（88%以上），通過Kappa值檢驗，Kappa值均大于或等于0.75，說明四種檢測方法具有很好的一致性，ELISA方法可以進(jìn)行布魯菌病的診斷定性。但RBT、SAT、CFT與ELISA相比，有一定的假陽性（1.22%～22.97%）和假陰性（2.59%～14.71%）（見表2、表3），假陽性的存在容易發(fā)生牛羊布魯菌病的錯判，假陰性率高表明檢測過程中容易出現(xiàn)病畜漏網(wǎng)狀況，不利于布魯菌病的凈化工作。SAT作為國標(biāo)中布魯菌病診斷定性的方法，在布魯菌病檢測中效果并不理想，CFT敏感性差，易漏檢，而成為群體的潛在威脅。這四種血清學(xué)方法中，RBT操作簡便，快速易行，有一定的敏感性和特異性，用于牛羊布魯菌病初篩效果較好，CFT方法雖然操作復(fù)雜，但特異性好，用于陽性畜的撲殺最為合理，因此采用RBT進(jìn)行初篩，用CFT與ELISA進(jìn)行牛羊布魯菌病聯(lián)合診斷較為理想。

3 討論

雖然對沈陽市2009—2014年牛羊布魯菌病復(fù)核樣本進(jìn)行了研究，但樣品存貯時間與來源是否具有代表性，需要在以后的研究中進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。牛羊布魯菌病的血清學(xué)診斷方法種類較多，但目前還沒有任何一種方法在敏感性、特異性以及操作簡便、易行、快速等方面都是完美無缺的。在對383頭奶牛樣本檢測過程中，發(fā)現(xiàn)有25頭SAT可疑或陰性，而ELISA檢測出現(xiàn)陽性，檢出可疑樣品，間隔一個月需重新采樣檢測，在隨后的檢測中發(fā)現(xiàn)，這25頭新采集奶牛樣本中有20頭出現(xiàn)了SAT轉(zhuǎn)陽的情況；在檢測中也出現(xiàn)了5份樣本RBT陽性SAT陰性，而CFT和ELISA陽性的情況。陽性畜的漏檢，為病原菌的散布和疾病的蔓延提供了機會，陰性畜的誤殺會造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

鑒于這幾種檢測方法的符合率不高，建議在實際檢測工作中，用兩種或兩種以上的方法配合檢測。一般在進(jìn)行大規(guī)模檢疫時，為了降低繁重的工作量，先采用特異性較差但價格低廉、操作比較簡便、敏感性較高的方法進(jìn)行篩選，然后再用敏感性和特異性好的診斷方法進(jìn)行復(fù)核。通過研究認(rèn)為，應(yīng)用RBT初篩較好，因為RBT具有敏感性高，操作簡單易行，不需要太多的儀器設(shè)備，對環(huán)境要求不嚴(yán)格；布病的陽性畜要進(jìn)行撲殺和無害化處理，因此運用特異性好的CFT與ELISA方法進(jìn)行聯(lián)合診斷定性較為理想。

[1]尚德秋.布魯氏菌病再度肆虐及其原因[J].中國地方病防治雜志，2001，16（1）：29-34.

[2]范偉興，鐘旗，何倩倪，等.幾種布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法的比較研究[J].中國動物檢疫，2006，23（6）：31-33.

[3]王蓓.臨床流行病學(xué)[M].南京：東南大學(xué)出版社，2004：251.