微生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)?zāi)K“天然酵母菌的篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)和鑒定”的教改研究與實(shí)踐

梁寶東　魏海香　朱九濱等

摘要 以“天然酵母菌的篩選、培養(yǎng)和選育”為主線，設(shè)計(jì)了一個(gè)由4個(gè)相互關(guān)聯(lián)、前后銜接一體的實(shí)驗(yàn)組成的綜合性研究型實(shí)驗(yàn)?zāi)K，進(jìn)行教學(xué)實(shí)踐與改革。實(shí)驗(yàn)?zāi)K主要包括：培養(yǎng)基的配制、分裝與滅菌，酵母菌的分離與純化，酵母的擴(kuò)大培養(yǎng)，菌種的鑒定。強(qiáng)化實(shí)踐，提高學(xué)生對(duì)于知識(shí)的綜合應(yīng)用能力。

關(guān)鍵詞 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)；天然酵母菌；實(shí)驗(yàn)?zāi)K

中圖分類號(hào) S-01 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）05-01581-02

Abstract A group of related experiments， focusing on isolation， cultivation and identification of natural yeast into an experiment module， was designed and applied in microbiological experiment teaching. The experiment module included preparation and sterilization of media， isolation of the strain， enlarge cultivation conditions and identification of the strain. The teaching method can strengthen the practice ability and improve the students` ability of comprehensive application of knowledge.

Key words Microbiological experiment； Natural yeast； Experiment module

微生物學(xué)是生物工程專業(yè)重要的一門核心專業(yè)課程，實(shí)驗(yàn)課是理論課程的重要組成部分，具有很強(qiáng)的實(shí)踐性和應(yīng)用性[1]?，F(xiàn)使用教材中，往往都是獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，且實(shí)驗(yàn)之間缺乏相應(yīng)的關(guān)聯(lián)性，導(dǎo)致學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)課程沒(méi)有系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。尤其是新建的地方本科院校，受先前教學(xué)方式的影響和學(xué)生知識(shí)儲(chǔ)備的限制，往往只是掌握一些零星分散的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如何在具體的教學(xué)過(guò)程中提高學(xué)生對(duì)有關(guān)知識(shí)技術(shù)的整合，有針對(duì)性地解決實(shí)際生產(chǎn)和科研問(wèn)題，顯得尤為必要。另外，受傳統(tǒng)教學(xué)方式的影響，學(xué)生經(jīng)常被動(dòng)地去接受和模仿，缺乏主動(dòng)性和獨(dú)立思考。針對(duì)這些問(wèn)題，可在學(xué)生掌握基本實(shí)驗(yàn)技能的基礎(chǔ)上，在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中嘗試性地開(kāi)設(shè)綜合性大實(shí)驗(yàn)，結(jié)合學(xué)院設(shè)立的“大學(xué)生創(chuàng)新性學(xué)習(xí)和研究項(xiàng)目”，以課題驅(qū)動(dòng)構(gòu)建教學(xué)內(nèi)容，提高學(xué)生綜合應(yīng)用和解決實(shí)際問(wèn)題的能力。筆者以“天然酵母菌的篩選、培養(yǎng)和選育”為主線的實(shí)驗(yàn)?zāi)K為主，介紹濟(jì)寧學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的教改研究。該實(shí)驗(yàn)?zāi)K以研究型課題為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計(jì)4次實(shí)驗(yàn)課，按照相互關(guān)聯(lián)、前后銜接的思路， 共同組成一個(gè)研究型實(shí)驗(yàn)， 代替了原微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程幾個(gè)分散的、獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，使微生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)有機(jī)地組合起來(lái)， 具體介紹如下。

1 第1次實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)基的配制、分裝與滅菌（3學(xué)時(shí)）

安排學(xué)生配制實(shí)驗(yàn)所需的全部培養(yǎng)基，包括固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基，并進(jìn)行分裝（表1），準(zhǔn)備培養(yǎng)皿、移液管等，分別進(jìn)行高壓蒸汽滅菌和烘箱干熱滅菌。由于配制培養(yǎng)基種類較多，可兩個(gè)同學(xué)為一組，分工配制不同的培養(yǎng)基，然后進(jìn)行交流。這次實(shí)驗(yàn)課的安排與以往不同的是，將單純的培養(yǎng)基配制和滅菌技術(shù)安排為一系列實(shí)驗(yàn)，這樣就大大提高了實(shí)驗(yàn)的針對(duì)性和目的性，豐富了培養(yǎng)基的配制種類，使同學(xué)們更深刻地認(rèn)識(shí)到培養(yǎng)基在微生物實(shí)驗(yàn)中的重要性，實(shí)驗(yàn)的積極性和主動(dòng)性大大增強(qiáng)。如酵母菌富集培養(yǎng)基含有較高的葡萄糖和較酸的環(huán)境，以及能抑制多種雜菌（許多細(xì)菌、放線菌和快速生長(zhǎng)的霉菌）的孟加拉紅，故十分有利于酵母菌的增殖，加強(qiáng)了對(duì)微生物培養(yǎng)的認(rèn)知。

2 第2次實(shí)驗(yàn)：酵母菌的分離與純化（3學(xué)時(shí)）

學(xué)生于課前到校園附近葡萄糖園采集土壤樣本， 不同組學(xué)生分別選擇葡萄糖園表土（鏟去2～3 cm的表土，再采集土樣）、有落果的表土、葡萄糖爛果、新鮮的葡萄糖粒、結(jié)果處的葡萄糖梗，帶回實(shí)驗(yàn)室，投入裝有20 ml酵母菌富集培養(yǎng)液的三角瓶中，置于28 ℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)2～3 d。用平板劃線法、涂布平板法或傾注平板法分離單菌落。若菌株不純，可對(duì)菌落進(jìn)行多次劃線分離，以獲得純菌落。將上述純種接種至麥芽汁試管斜面上，經(jīng)28 ℃培養(yǎng)1～2 d后，在顯微鏡下觀察其形態(tài)，結(jié)合菌落形態(tài)，判斷是否為目的菌株。將得到的菌落純的菌種貼上標(biāo)簽，放4 ℃下保存，備用[2]。該實(shí)驗(yàn)將以往的單純土壤微生物的分離純化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了具體化，變?yōu)榻湍妇姆蛛x純化，稀釋澆注平板、稀釋涂布平板和平板劃線分離、斜面菌種轉(zhuǎn)接、液體培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)全部安排在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使同學(xué)們不但掌握了具體的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，還了解到如何應(yīng)用這些技術(shù)從自然界分離獲得所需要的目的菌株。

3 第3次實(shí)驗(yàn)：酵母菌的擴(kuò)大培養(yǎng)（6 學(xué)時(shí)）

安排學(xué)生先利用搖床進(jìn)行培養(yǎng)， 100 ml三角瓶，12°Bx 麥芽汁培養(yǎng)基，裝液量 20 ml，接新活化的斜面菌種1～2環(huán)，30 ℃靜置培養(yǎng)24～36 h。細(xì)胞濃度達(dá)8.0×108個(gè)/ml以上，無(wú)雜菌，無(wú)死細(xì)胞，作為一級(jí)種子； 500 ml三角瓶，培養(yǎng)基同上，裝液量80 ml，每瓶接種一級(jí)種子液約8 ml，30 ℃培養(yǎng)12～16 h，細(xì)胞濃度達(dá)1.5×109個(gè)/ml以上，無(wú)雜菌，無(wú)死細(xì)胞，為二級(jí)種子。將二級(jí)種子接種于5L-全自動(dòng)發(fā)酵罐，裝液量為4 L 12°Bx 麥芽汁培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)[3]。在培養(yǎng)的過(guò)程中，每2 h取樣，檢測(cè)發(fā)酵液中的還原糖含量、pH和酵母菌的細(xì)胞數(shù)，測(cè)量方法分別為3，5二硝基水楊酸法、數(shù)字pH計(jì)和血球計(jì)數(shù)板法。根據(jù)測(cè)量的數(shù)據(jù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，檢測(cè)參數(shù)為縱坐標(biāo)，分別繪制降糖曲線、pH曲線和生長(zhǎng)曲線，根據(jù)這些曲線判斷酵母菌生長(zhǎng)的規(guī)律。這樣的安排將原來(lái)單一、枯燥的實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)變?yōu)榫C合性的擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，同時(shí)還讓同學(xué)們掌握了搖瓶液體培養(yǎng)、5L-全自動(dòng)發(fā)酵罐的使用和培養(yǎng)、生長(zhǎng)曲線的測(cè)定和發(fā)酵相關(guān)參數(shù)的測(cè)定等，緊密圍繞專業(yè)開(kāi)設(shè)實(shí)驗(yàn)。

4 第4次實(shí)驗(yàn)：酵母菌的鑒定（3學(xué)時(shí)）

形態(tài)學(xué)特征：分別將待鑒定菌種接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3 d觀察，記錄細(xì)胞形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特征。用測(cè)微尺在顯微鏡下測(cè)定鑒定菌株個(gè)體的大小。將鑒定菌株接種于M cclary培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d，涂片在顯微鏡下觀察子囊孢子的形成。

生理生化特征：分別進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、碳源和氮源同化實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)類淀粉化合物和產(chǎn)酯測(cè)定實(shí)驗(yàn)、牛奶凍化、無(wú)維生素培養(yǎng)基生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、需維生素測(cè)定、耐滲透壓、尿素分解、明膠液化實(shí)驗(yàn)、培養(yǎng)溫度實(shí)驗(yàn)等。

菌種的培養(yǎng)過(guò)程盡可能都安排在課余時(shí)間，課堂上側(cè)重特征鑒定。鑒于此部分實(shí)驗(yàn)多，依據(jù)前期菌種分離過(guò)程記錄的菌種特征，選擇較為典型的菌種進(jìn)行鑒定，同時(shí)將2～3小組同學(xué)合并成1組，分別做相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，減少工作量，又完成鑒定工作。根據(jù)記錄鑒定菌株的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征，對(duì)照參考文獻(xiàn)[4]，確定菌株的門、綱、目、科、屬、種。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程要求學(xué)生客觀、真實(shí)記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，學(xué)生寫(xiě)出一份完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，要求實(shí)驗(yàn)報(bào)告按照研究型論文的寫(xiě)作方式進(jìn)行。隨后，每組同學(xué)分別將試驗(yàn)內(nèi)容做成PPT格式，擇優(yōu)進(jìn)行課堂講解（選擇1名學(xué)生）和討論，分析實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的各種問(wèn)題，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行必要的歸納總結(jié)和理論探討，并將此部分內(nèi)容進(jìn)行整理歸納，附實(shí)驗(yàn)報(bào)告后再統(tǒng)一上交[5]。

要開(kāi)展好這類綜合型、研究型的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，總結(jié)出以下幾個(gè)問(wèn)題：①學(xué)生需要利用較多的課外時(shí)間，就要求合理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和時(shí)間分配，避免實(shí)驗(yàn)與其他課程相沖突；②實(shí)驗(yàn)空間的限制性，若多組同時(shí)進(jìn)行，需占用較大實(shí)驗(yàn)室空間和設(shè)備，要合理進(jìn)行調(diào)節(jié)；③每組實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，學(xué)生欠缺研究經(jīng)驗(yàn)，需要教師花費(fèi)較多精力和時(shí)間，大大增加了工作量；④篩選菌種的偶然性可能會(huì)使部分組同學(xué)的實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)負(fù)結(jié)果，需進(jìn)行組間人員調(diào)配或共享菌株進(jìn)行后續(xù)分實(shí)驗(yàn)；⑤實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，學(xué)生要及時(shí)總結(jié)問(wèn)題，分析原因，組間交流經(jīng)驗(yàn)，團(tuán)隊(duì)合作。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的討論過(guò)程中，同學(xué)反映真實(shí)體會(huì)到了科研工作的艱辛，認(rèn)識(shí)到細(xì)致觀察、耐心的重要性。此類實(shí)驗(yàn)開(kāi)設(shè)方式得到大家的認(rèn)可，增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)的整體性、系統(tǒng)性和學(xué)生獨(dú)立自主研究的能力，增加了發(fā)散性思維，使學(xué)生初步學(xué)會(huì)研究型論文的寫(xiě)作方法，并將學(xué)到的理論知識(shí)更好地應(yīng)用于解決問(wèn)題上，很好地鍛煉了實(shí)踐操作能力，不但為后續(xù)的畢業(yè)課題或研究工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，還增強(qiáng)了學(xué)生在就業(yè)市場(chǎng)中的競(jìng)爭(zhēng)力。

參考文獻(xiàn)

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