冀中南地區(qū)16個平菇栽培菌株的ISSR分析

鄭素月　鄭偉　邢志偉等

摘要：應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對16個平菇栽培菌株進行遺傳多樣性研究。從16個ISSR引物中篩選出8個引物，擴增到78個多態(tài)性位點，其大小分布在200～3 000 bp之間。聚類分析結(jié)果表明，16個平菇菌株在遺傳相似系數(shù)為0.75處可分為6個組群：第1組包括為以89為代表的5個菌株；第2組包括白平菇菌株；第3組包括以冀農(nóng)11為代表的4個菌株；第4組包括558菌株；第5組包括以99為代表的3個菌株；第6組包括以夏抗8為代表的2個高溫菌株。

關(guān)鍵詞：平菇；ISSR；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號： S646.1+40.4文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0073-03

收稿日期：2015-04-07

基金項目：河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用菌產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊建設(shè)專項；河北省科技支撐計劃 （編號：15226404D）。

作者簡介：鄭素月（1969—），女，河北石家莊人，博士，教授，主要從事食用菌新品種選育與菌種生產(chǎn)技術(shù)方面的研究。E-mail：zhengsuyue@sina.com。平菇營養(yǎng)豐富，味道鮮美，具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能，是人們喜愛的食用菌之一。平菇抗逆性強、適應(yīng)性好、產(chǎn)量高、易栽培，是我國栽培規(guī)模最大、產(chǎn)量最高的一種食用菌。目前，生產(chǎn)上平菇菌種混雜、種源不清、同物異名嚴(yán)重，嚴(yán)重制約平菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，許多生化和分子生物學(xué)手段已在食用菌種質(zhì)資源研究中得到了廣泛應(yīng)用。微衛(wèi)星間區(qū)分子標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性豐富、穩(wěn)定可靠、試驗重復(fù)性好等優(yōu)點，在食用菌種質(zhì)鑒定方面得到了廣泛的應(yīng)用。張金霞等利用ISSR技術(shù)對側(cè)耳屬菌株進行研究[1-2]；李輝平等利用ISSR技術(shù)研究木耳菌株的遺傳多樣性[3-4]；李瑩等研究杏鮑菇的ISSR標(biāo)記多態(tài)性[5]；秦蓮花等用ISSR鑒別香菇生產(chǎn)用種[6-7]。本試驗采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對河北省冀中南地區(qū)16個平菇生產(chǎn)菌株進行鑒別及遺傳多樣性分析，可為解決平菇品種混亂、對平菇進行資源利用和品種選育奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試菌株及來源

供試平菇菌株共16個，分別收集于河北省冀中南地區(qū)，由筆者所在實驗室保存。菌株編號、名稱見表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取PDA培養(yǎng)基平板上鋪玻璃紙隔膜培養(yǎng)菌表1供試菌株絲，液氮研磨菌絲后用DNA提取試劑盒提取菌株DNA， 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，紫外分光光度計測定其D260 nm、D280 nm ，去離子水稀釋到20 ng/μL左右， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物篩選所用引物及擴增程序參考李輝平的研究[8]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表2。

1.2.3PCR反應(yīng)體系25 μL反應(yīng)體系：2 μL DNA模板（約50 ng），2.5 μL 10×Taq PCR buffer，0.8 μL dNTPs（各0.25 mmol/L） ，1 μL引物（10 μmol/L），0.2 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），18.5 μL雙蒸水。

1.2.4擴增程序94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃補齊10 min； 4 ℃終止反應(yīng)。

1.2.5瓊脂糖凝膠電泳配制1.4%瓊脂糖凝膠，緩沖液為1×TAE，PCR產(chǎn)物在電壓100 V下電泳70 min。

2結(jié)果與分析

2.1DNA提取結(jié)果

16個菌株基因組DNA提取結(jié)果見圖1。由于采用了基因組DNA提取試劑盒，與傳統(tǒng)的DNA提取方法相比，得到的DNA比較純凈，條帶清晰、雜質(zhì)較少，在紫外分光光度計上測定其D260 nm、D280 nm?？梢钥闯?，D260 nm、D280 nm 值均在1.8～2.0

之間，可用于PCR擴增。

2.2引物的篩選

本試驗從供試的16個ISSR引物中篩選出8個擴增效果較好的引物，可擴增出所有供試菌株的DNA條帶，且條帶清晰、穩(wěn)定、分布合理、重復(fù)性好，而在對照中沒有擴增出DNA條帶。這些引物分別為P2、P3、P5、P6、P7、P8、P11、P13。

2.3ISSR擴增圖譜分析

用篩選出的8個引物對16個平菇菌株進行ISSR擴增，共擴增出78個多態(tài)性位點（圖2），且分布均勻，大小在200～3 000 bp之間。以凝膠DNA片段的有無分別記為1或0，用統(tǒng)計軟件NTSYSpc計算菌株間的遺傳相似性系數(shù)，進行遺傳相似性分析。由圖3聚類分析結(jié)果可知，遺傳相似水平在0.75 左右，16個菌株分為6個組群：第1組（Ⅰ）包括為以89為代表的5個菌株；第2組（Ⅱ）包括白平菇菌株；第3組（Ⅲ）包括以冀農(nóng)11為代表的4個菌株；第4組（Ⅳ）包括558菌株；第5組（Ⅴ）包括以99為代表3個菌株；第6組（Ⅵ）包括夏抗8為代表的2個高溫菌株。

3結(jié)論與討論

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是1994年由Zietkiewicz等創(chuàng)建的一種簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性分子標(biāo)記，其技術(shù)原理是在SSR序列的3′端或5′端加錨1～4個隨機的堿基為引物，對兩側(cè)具有反向排列的簡單序列間的基因片段進行擴增，不僅多態(tài)性好、穩(wěn)定性高，而且簡單、快速、通用性好，在食用菌種質(zhì)資源研究中得到了廣泛的應(yīng)用[9]。筆者所在課題組在前期工作中收集了冀中南地區(qū)54個不同栽培平菇菌株，并進行了拮抗與酯酶同工酶測定，將54個菌株分為12個營養(yǎng)不親和群[10]。本試驗在此基礎(chǔ)上選取16個代表菌株進一步進行ISSR分析。結(jié)果表明，用篩選出的8個引物對平菇菌株DNA進行ISSR擴增，共擴增出78個多態(tài)性位點，大小在200～3 000 bp 之間，且分布均勻。聚類分析結(jié)果表明，同一營養(yǎng)親和群的平菇89和早秋615、雙抗黑平和新平106、以及99、特抗黑平和平菇206菌株群內(nèi)ISSR圖譜完全相同，不同營養(yǎng)親和群菌株ISSR圖譜存在差異，進一步說明ISSR分析在食用菌菌株鑒定方面的可靠性。

參考文獻：

[1]張金霞，黃晨陽，管桂萍，等. 白黃側(cè)耳Pleurotus cornucopiae微衛(wèi)星間區(qū)（ISSR）分析[J]. 菌物學(xué)報，2007，26（1）：115-121.

[2]馬志剛，呂作舟，鄭和斌，等. ISSR標(biāo)記在側(cè)耳屬菌株分類學(xué)中的初步應(yīng)用[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，25（1）：55-59.

[3]李輝平，黃晨陽，陳強，等. 黑木耳栽培菌株的ISSR分析[J]. 園藝學(xué)報，2007，34（4）：935-940.

[4]戴肖東，馬銀鵬，張介馳，等. 黑龍江省木耳主栽品種遺傳多樣性分析[J]. 生物技術(shù)，2014，24（5）：86-89.

[5]李瑩，李莉，劉艷玲，等. 杏鮑菇菌種遺傳多態(tài)性的ISSR分析[J]. 微生物學(xué)雜志，2014，34（2）：24-28.

[6]秦蓮花，宋春艷，譚琦，等. 用ITS和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒別香菇生產(chǎn)用種[J]. 菌物學(xué)報，2006，25（1）：94-100.

[7]賈定洪，王波，鄭林用，等. 應(yīng)用拮抗及ISSR方法鑒定袋料香菇菌株[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，26（2）：832-834.

[8]李輝平. 應(yīng)用ISSR標(biāo)記對食用菌的遺傳多樣性分析[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007.

[9]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20（2）：176-183.

[10]鄭素月，張慶橋.生化標(biāo)記在河北省栽培平菇種質(zhì)資源鑒別中的應(yīng)用研究[J]. 北方園藝，2011（14）：162-164.謝菲，陳茹陽，趙惠恩. 蒙菊（Chrysanthemum mongolicum）再生體系的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11：76-78.