0#柴油中的水溶性石油烴對中華絨螯蟹溞狀幼體的急性毒性

孫娜, 侯鑫, 萬紅芳, 劉胥, 梁芳

(1.盤錦光合蟹業(yè)有限公司，遼寧省中華絨螯蟹育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧省，盤錦市 124200； 2.大連海洋大學(xué) 遼寧省，大連市)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)，又稱河蟹，是中國的傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)蟹類，每年的繁殖期將洄游至海水區(qū)或者是河口半咸水域進(jìn)行繁殖。其幼體發(fā)育可分為溞狀幼體(Ⅰ～Ⅴ期)和大眼幼體兩個階段[1]，這兩個階段是河蟹育苗中的兩個關(guān)鍵幼體時期。特別是溞狀幼體時期對外界環(huán)境的抵抗能力較弱，易受水中有毒物質(zhì)的影響，造成生長發(fā)育不良甚至死亡。2014年Julie等[2]研究了石油水溶性成分對泥蟹(Rhithropanopeusharrisii)幼體的急性毒性實(shí)驗(yàn)，表明石油水溶性成分對其有明顯的毒性作用。因此，探究溞狀幼體時期對有毒物質(zhì)的耐受性對于河蟹育苗具有重要的意義。

盤錦地處遼河平原南部的遼河三角洲核心地帶，是中國北方河蟹的主產(chǎn)區(qū)，同時盤錦地區(qū)地下也蘊(yùn)藏著豐富的油氣資源[3]。隨著油氣資源的滾動開發(fā)和石油化工企業(yè)的迅猛發(fā)展，石油烴類污染物在石油勘探、開采、煉制和加工運(yùn)輸過程中以含油廢水、落地原油和含油廢棄泥漿等形式進(jìn)入水體、土壤中，目前該區(qū)域水環(huán)境已經(jīng)受到不同程度的石油污染[4]。溶解分散在水體的石油烴是石油類污染物對水生生物產(chǎn)生直接毒性的成分，主要包括多環(huán)芳香烴、直鏈和支鏈烷烴、環(huán)烷烴與不飽和烴[5]。尤其是其中的多環(huán)芳香烴，不易降解，在水體和生物體內(nèi)的殘留時間較長[6]。多環(huán)芳烴對鋸緣青蟹(Scyllaserrata)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、普通濱蟹(Carcinusmaenas)等蟹類均有明顯的毒性效應(yīng)[7-9]。盤錦地區(qū)是中國北方中華絨螯蟹蟹苗的主產(chǎn)地，而且因?yàn)楸P錦石油的開發(fā)，已有部分地區(qū)的水體受到污染，所以擬通過本次研究為科學(xué)評價水溶性石油烴對中華絨螯蟹各期溞狀幼體的毒性提供依據(jù)，同時為河蟹養(yǎng)殖環(huán)境風(fēng)險預(yù)警監(jiān)測提供數(shù)據(jù)參考，對于合理規(guī)避河蟹養(yǎng)殖過程中影響河蟹健康生態(tài)養(yǎng)殖的環(huán)境風(fēng)險因子具有良好的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

中華絨螯蟹種蟹取自盤錦光合蟹業(yè)三角洲基地室外育苗池，在室內(nèi)暫養(yǎng)10 d至排幼，取發(fā)育變態(tài)、整齊和活力好的個體，經(jīng)顯微鏡鑒定，分別為Z1、Z2、Z3、Z4、Z5期幼體，用于毒性實(shí)驗(yàn)。

過濾海水:在光合蟹業(yè)三角洲基地室外幼體培育池中取水，經(jīng)過24 h沉淀，用200目篩絹網(wǎng)過濾后充氣備用。鹽度范圍為19～21，pH為8.6～8.7。

配置水溶性石油烴母液:將0#柴油(采購自中國石油盤錦加油站)和過濾海水按體積比 1∶1混合，加入助溶劑無水乙醇和表面活性劑吐溫-80各1mL，用磁力加熱攪拌器連續(xù)攪拌10 h后，在分液漏斗中靜置4 h，分離的下層液體即為水溶性石油烴母液[5]。用紫外分光光度計法測定母液濃度[10]后，置于冰箱(4 ℃)保存。

1.2 試驗(yàn)方法

采用靜水式急性毒性試驗(yàn)法。試驗(yàn)容器為500 mL的燒杯,試驗(yàn)總水體體積為400 mL，投放試驗(yàn)幼體10只。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將石油烴分散液母液按等對數(shù)間距(以10為底數(shù))稀釋成4.56、6.53、9.33、13.36、19.00和27.36 mg/L 6個質(zhì)量濃度梯度，每個濃度梯度設(shè)置3個平行組，另設(shè)一個空白對照組。每期幼體試驗(yàn)時間為48 h,每24 h更換一次試驗(yàn)液體。試驗(yàn)液體溫度變化范圍是20～23 ℃。在試驗(yàn)開始后第24小時和第48小時觀察死亡情況，并記錄幼體死亡數(shù)。幼體死亡以沉底發(fā)白、對刺激無反應(yīng)為準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)pH值測定采用三信PHB-1型便攜式pH計，溶解氧測定采用YSI-55A型便攜式溶氧儀。整個實(shí)驗(yàn)過程水溫控制在20～23 ℃范圍內(nèi)，pH為8.6～8.7，溶解氧含量為5.5 ～7.5 mg/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 校正死亡率

自然死亡校正采用Abbot[11]的公式，具體計算方法見式(1)。

P=(P′-C)/(1-C)

式(1)

式中，P為校正后的自然死亡率(%)，P′為試驗(yàn)組死亡率(%)，C為對照組死亡率(%)，其中各相應(yīng)數(shù)據(jù)均為3個平行組的算術(shù)平均數(shù)。

1.3.2 半致死濃度、安全濃度計算

利用SPSS 21(IBM，美國)中Probit模塊(概率單位回歸)分析數(shù)據(jù)，得到死亡幾率與濃度對數(shù)的線性回歸方程，并利用卡方檢驗(yàn)確定線性回歸方程的擬合優(yōu)度，同時求出24h和48h的LC50及其95%的置信區(qū)間[12-13]。

安全濃度采用Turubell 氏公式計算[14]，見式(2)。

式(2)

其中SC為安全濃度，24 hLC50為24 h的半致死濃度，48 hLC50為48 h的半致死濃度。

2 結(jié)果分析

2.1 中華絨螯蟹溞狀幼體的中毒癥狀

中華絨螯蟹各期溞狀幼體對不同濃度的水溶性石油烴的中毒反應(yīng)相似。實(shí)驗(yàn)開始6 h內(nèi)，低濃度組(4.56和6.53 mg/L兩組)以及空白對照組的幼體活動狀況無明顯差異，趨光性較強(qiáng)，大多在水體的中下層活動，觸底后腹部收縮，彈跳有力。中濃度和較高濃度組(9.33、13.36和19.12 mg/L)，1小時后幼體活性與對照組相比，明顯下降，3小時后陸續(xù)出現(xiàn)死亡個體。然而27.36 mg/L 濃度組投入幼體后，幼體活動異常，在水體下層打轉(zhuǎn)，不時撞向燒杯壁，突然失去平衡，頭部朝下撞到杯底。有的頭部貼著杯底，腹部伸展，間歇式抽搐；也有少許在杯底匍匐移動，無力彈跳；試驗(yàn)進(jìn)行至15 h后幼體趨光性變差，體色發(fā)白的程度越來越明顯，直至完全發(fā)白而死亡。

2.2 水溶性石油烴對中華絨螯蟹各期溞狀幼體急性毒性

由試驗(yàn)中幼體的中毒癥狀及表1數(shù)據(jù)可看出，隨著水溶性石油烴濃度的增加和作用時間的延長，中華絨螯蟹的各期溞狀幼體的校正死亡率逐漸提高，水溶性石油烴的濃度和作用時間共同影響了中華絨螯蟹溞狀幼體的死亡率。

通過SPSS對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由表2可知，各期幼體24 h的半致死濃度(LC50)順序依次為：Z1

2.3 毒性評估

參照《環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》生物監(jiān)測(水環(huán)境部分)[15]，由表4可知LC50在1～100 mg/L為高毒。而本次研究中24 h和48 h毒性實(shí)驗(yàn)的LC50的值均在1～100 mg/L之間，所以0#柴油的水溶性石油烴對中華絨螯蟹溞狀幼體是高毒物質(zhì)，對其有嚴(yán)重的毒害作用，應(yīng)引起人們的高度關(guān)注。

表1 水溶性石油烴對中華絨螯蟹各期溞狀幼體的毒性Tab.1 The toxicity of water-soluble petroleum hydrocarbons to zoea (Z1～Z5) of Eriocheir sinensis n=3

表2 水溶性石油烴對中華絨螯蟹各期溞狀幼體的毒性特征的分析Tab.2 The toxicity characteristic analysis of water-soluble petroleum hydrocarbons to zoea (Z1～Z5) of Eriocheir sinensis

表3 水溶性石油烴濃度對數(shù)與中華絨螯蟹各期溞狀幼體死亡幾率的線性回歸關(guān)系Tab.3 The linear regression analysis of the concentration logarithm of water-soluble petroleum hydrocarbons to the mortality rate of zoea (Z1～Z5) of Eriocheir sinensis

注：線性回歸方程中，x為水溶性石油烴濃度對數(shù)值，y為中華絨螯蟹各期溞狀幼體死亡幾率; “***”表示P值在0.001水平上顯著相關(guān)。

表4 化學(xué)物質(zhì)對水生生物的毒性分級Tab.4 Toxicity grades of chemical substances to aquatic organisms mg·L-1

3 討論

海洋生物在幼體階段對石油類污染物均較為敏感，主要由于其神經(jīng)中樞和呼吸器官等重要部位接近體表，而表層皮膜一般較薄，有毒物質(zhì)容易入侵，并且幼體的運(yùn)動能力相對成體較差，遇到污染環(huán)境，不能及時逃離。因此一旦出現(xiàn)石油類污染物泄漏事故，不僅會威脅海洋生物成體，對其幼體的毒害作用更甚[16]。本次研究中根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在石油烴質(zhì)量濃度4.56～27.36 mg/L的范圍內(nèi)進(jìn)行濃度的梯度設(shè)計，而實(shí)驗(yàn)選擇的鹽度19～21為中華絨鰲蟹溞狀幼體生長發(fā)育最適的鹽度范圍。

本實(shí)驗(yàn)過程中幼體出現(xiàn)的沉底、撞壁、活力減弱以及身體發(fā)白等中毒現(xiàn)象與沈和定等[17]的甲醛對中華絨螯蟹各期溞狀幼體及波海紅胞藻(RhodomonasbalticaKarsten, 1898)的急性毒性和盧偉等[18]的新潔爾滅對中華虎頭蟹(Orithyiasinica)幼體的急性毒性試驗(yàn)中的溞狀幼體中毒癥狀是相似的。由于石油烴的成分組成復(fù)雜，不同種類水生生物或同種水生生物的不同發(fā)育階段對同種石油烴的耐受性是不同的。0#柴油分散液對馬糞海膽(Hemicentrotuspulcherrimus)幼蟲24 h和48 h的半數(shù)效應(yīng)濃度為18.2和15.5 mg/L[19]，而對小球藻 (Chlorellavulgaris)的24 h和48 h半數(shù)效應(yīng)濃度為23.53和14.39 mg/L[20]，對菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的24 h半致死濃度為52.6 mg/L[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，0#柴油水溶性石油烴對溞狀幼體的24 h和48 h半致死濃度均低于馬糞海膽幼蟲、小球藻以及菲律賓蛤仔，說明中華絨螯蟹溞狀幼體對石油烴的耐受性低，相比于馬糞海膽幼蟲、小球藻以及菲律賓蛤仔，中華絨螯蟹溞狀幼體對石油烴的敏感性高。由表1中同一濃度組下不同階段幼體的的校正死亡率隨著幼體的發(fā)育呈下降趨勢；同一發(fā)育階段隨著濃度增加校正死亡率上升的規(guī)律，可證明各期溞狀幼體對0#柴油的水溶性石油烴的耐受性是不同的。

本次實(shí)驗(yàn)的局限性在于，沒有測定0#柴油中石油烴的化學(xué)成分以及石油烴對中華絨鰲蟹溞狀幼體抗氧化系統(tǒng)的影響。目前許多學(xué)者在對石油烴的毒性研究中發(fā)現(xiàn)為, 芳烴的含量是決定毒性大小的關(guān)鍵因素[22-23]。多環(huán)芳烴環(huán)氧化物被認(rèn)為是多環(huán)芳烴致癌及致突變的重要活性代謝產(chǎn)物，因其具有親電子特性，可以和生物大分子尤其是分子相互作用,形成多種類型的DNA損傷,如加合物、鏈斷裂以及堿基的非正?；瘜W(xué)修飾或缺失等[24-25]。石油污染物的毒性與其中含有的可溶性芳烴衍生物(如苯、萘、菲及它們的烷基衍生物)的含量呈正比關(guān)系[26]。此外，水生生物對石油烴等污染物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的代謝過程中會產(chǎn)生大量自由基，主要是生物轉(zhuǎn)化酶引起的氧自由基含量增加和污染物中間代謝物的氧化還原循環(huán)，而過量的自由基可對機(jī)體產(chǎn)生廣泛的氧化損傷[27]。張林寶等[28]的研究同樣表明，0#柴油水溶性成分對菲律賓蛤仔的抗氧化系統(tǒng)造成了損傷。因此，在研究石油烴對水生生物的毒性時，不僅要考慮石油烴的成分，還應(yīng)該考慮生物本身代謝的機(jī)理，今后的實(shí)驗(yàn)中將加深這方面的研究。