丹參根部顏色及其與活性成分含量的相關(guān)性研究

尉廣飛　李佳　劉謙等

摘要：采用HPLC法測定丹參根部水溶性（迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B）和脂溶性（二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA）活性成分含量，并用色差儀測根部顏色，探討丹參根部顏色與其活性成分含量間的相關(guān)性，為制定丹參藥材等級標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。結(jié)果表明：不同顏色級別丹參表面色度值存在明顯差異，可據(jù)此對其進(jìn)行等級劃分；多數(shù)活性成分含量存在顯著差異；二氫丹參酮Ⅰ和紫草酸與色度值L*、a*、b* 相關(guān)性不顯著（P>0.05），其他5種成分與色度值L*均呈負(fù)相關(guān)，與a* 、b* 均呈正相關(guān)，其中迷迭香酸、丹酚酸B及丹參酮Ⅰ與色度L*值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），隱丹參酮、丹參酮ⅡA與a*值和b*值呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（P<0.01）。由此可見，丹參根部越紅活性成分含量越高，這為合理評價(jià)丹參藥材質(zhì)量、進(jìn)行丹參藥材分級提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：丹參；顏色；活性成分；相關(guān)性

中圖分類號：S567.5+30.1 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2015）08-0059-04

Abstract The HPLC method was applied to determine the contents of water-soluble ingredients （rosmarinic acid， lithospermic acid， Salvianolic B） and fat-soluble ingredients （DihydrotanshinoneⅠ， cryptotanshinone， tanshinoneⅠ and tanshinone ⅡA）. The color of RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE was measured by colorimeter. The correlation between them was analyzed to provide references for setting grade standard of RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE. The results showed that the chromatic value of RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE surface was different between different grades，so grading could conduct based on this；and the content of each ingredient was obviously different between different colour grades. Except DihydrotanshinoneⅠand lithospermic acid had no significant correlations with the chromatic value L*， a* and b* （P>0.05）， the other ingredients all showed negative correlations with L* but positive correlations with a* and b*. Among them， rosmarinic acid， Salvianolic B and tanshinoneⅠ showed very significantly negative correlations with L* （P<0.01）， while cryptotanshinone and tanshinone ⅡA showed very significantly positive correlations with a* and b* （P<0.01）. Thus， the redder the RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE was，the higher the contents of active ingredients were， which could provide theoretical references for reasonable quality evaluation and grading of RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE.

Key words RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE； Colour； Active ingredients； Correlation

丹參藥材為唇形科多年生草本植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根莖，屬于臨床常用大宗藥材，具有活血祛瘀、調(diào)經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功效[1]。其活性成分主要包括脂溶性的二萜醌類和水溶性的酚酸類，前者有隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮Ⅰ、丹參新酮等，以丹參酮ⅡA為主；后者有丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、咖啡酸、紫草酸及丹酚酸A、B、C、D、E、F等，以丹酚酸B為主[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參具有抗氧化、抗腫瘤、抑制肝細(xì)胞凋亡、抗血栓等活性[3，4]。因采收期[5]、加工方法[6]和產(chǎn)地[7]等不同，丹參藥材質(zhì)量差異很大，外觀性狀主要表現(xiàn)在顏色差異上，傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為“色紅為好”，但缺乏客觀的數(shù)據(jù)量化標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用色差儀測定丹參藥材表面顏色，HPLC測定活性成分含量，探討丹參藥材顏色與活性成分含量間的相關(guān)性，為制定丹參藥材等級標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試丹參根系于2014年12月20日采自山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園二年生丹參植株，原植物經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳琴教授鑒定，確認(rèn)為唇形科鼠尾草屬植物丹參。

將根系刨出后，去凈泥土，截取直徑0.8～1.0 cm的主根根段若干，長度20 cm左右。據(jù)根段表面紅色程度分為4個級別：1級：磚紅色，紅色程度最高；2級：棕紅色，紅色程度較高；3級：淡棕紅色，紅色程度較低；4級：棕褐色，紅色程度最低。保持條件一致，統(tǒng)一曬干。干燥后，以色差儀測定藥材表面顏色，然后粉碎，粉末置于干燥器中保存?zhèn)溆?，以HPLC測定活性成分含量。各顏色級別丹參平行重復(fù)試驗(yàn)3次。endprint

1.2 儀器與試劑

Aglient1260系列高效液相色譜儀，包括四元泵（G1311C）、自動進(jìn)樣器（G1329B）、柱溫箱（G1316A）、檢測器（G1315D）、Chem Station色譜數(shù)據(jù)工作站，美國安捷倫公司；精密電子天平（CP225D），上海精密科學(xué)儀器有限公司；超聲波提取器（KQ-500DE， 500 W），昆山市超聲儀器有限公司；高速多功能粉碎機(jī)（25 000 r/min），上海樹立儀器儀表有限公司；色差儀（WF30），深圳市威福光電科技有限公司。

迷迭香酸（20120809）、紫草酸（PF0225SA14）、丹酚酸B（PA0418RA13）、二氫丹參酮Ⅰ（KN1113GU14）、丹參酮ⅡA（20130111），購自上海源葉生物科技有限公司；丹參酮Ⅰ（110867-200406）、隱丹參酮（110852-200806），購自中國食品藥品檢定研究院。磷酸、乙腈均為色譜純，甲醇為分析純，娃哈哈純凈水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藥材表面顏色測定 測定條件：光源D65，標(biāo)準(zhǔn)觀察角度10°，波長掃描范圍780～380 nm，照明口徑Ф50 mm，掃描速度600 nm/min，儀器誤差ΔE*ab 0.2以內(nèi)，重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差ΔE*ab 0.05以內(nèi)，數(shù)據(jù)用L*a*b*色空間法表示。其中L*為亮度值，L*值越大亮度越高；a*為紅-綠色軸，a*值越大越紅，a*值越小則越綠；b*為黃-藍(lán)色軸，b*值越大越黃，b*值越小則越藍(lán)。

樣品測量方法：取各顏色級別丹參藥材，將平整處平鋪在色彩色差儀測試口處，測定其表面顏色，隨機(jī)掃描10次，取均值。

1.3.2 活性成分含量測定 色譜條件：①水溶性成分：色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.026%磷酸（A）和乙腈（B）。梯度洗脫流動相比例：0～15 min，A相83%～77%，B相17%～23%；15～30 min，A相77%～75%，B相23%～25%；30～40 min，A相75%～10%，B相25%～90%；40～60 min，A相10%，B相90%。波長286 nm；流速1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按丹酚酸B計(jì)不低于3 000。②脂溶性成分：色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.026%磷酸（A）和乙腈（B）。梯度洗脫流動相比例：0～20 min，A相80%～40%，B相20%～60%；20～60 min，A相40%～20%，B相60%～80%。波長270 nm；流速1.0 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按丹參酮ⅡA不低于3 000計(jì)。

對照品溶液制備：①水溶性成分：分別精密稱取干燥的水溶性對照品紫草酸0.68 mg、迷迭香酸0.40 mg、丹酚酸B 0.33 mg，分別置10、10、5 mL棕色容量瓶中，加75%甲醇溶解，定容至刻度，配制成對照品貯備液，再分別配制成質(zhì)量濃度為8.5、5.0、33.0 μg/mL的溶液。②脂溶性成分：分別精密稱取干燥的脂溶性對照品丹參酮ⅡA 0.42 mg、二氫丹參酮Ⅰ0.84 mg、隱丹參酮0.29 mg、丹參酮Ⅰ0.43 mg，分別置5、10、10、25 mL棕色容量瓶中，加75%甲醇溶解，定容至刻度，配制成對照品貯備液，再分別配制成質(zhì)量濃度為10.5、21.0、7.25、4.3 μg/mL的溶液。

樣品溶液制備：①水溶性成分：精密稱取丹參粉末（過40目篩）0.5 g，置磨口錐形瓶中，加入75%甲醇50 mL，50℃超聲提取40 min，冷卻稱重，并用75%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液備用。②脂溶性成分：精密稱取丹參粉末（過40目篩）0.5 g，置磨口錐形瓶中，加入甲醇50 mL，50℃超聲提取40 min，冷卻后稱重，并用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液備用。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 線性關(guān)系的考察 取上述水溶性和脂溶性對照品溶液各1、5、10、20、30、40 μL，按色譜條件進(jìn)樣，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的回歸方程分別為Y=1332.3X+4.2293、Y=785.80X+8.0610、Y=1390.7X+30.454、Y=3175.0X-6.4643、Y=6431.6X+0.9414、Y=5317.9X-0.4518、Y=9957.1X+0.6733，線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9996、0.9991、0.9995、0.9997、1.0000、1.0000、1.0000，測定范圍分別為0.025～0.200、0.0425～0.2550、0.033～20.640、0.021～0.840、0.00725～0.29000、0.0043～0.1720、0.0105～0.4200 μg。

1.4.2 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn) 經(jīng)測定，其RSD值均小于3%，表明方法穩(wěn)定、可行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同級別藥材表面色度值差異

1、2、3、4級的L*值逐漸升高，而a*、b*值逐漸降低（見表1）。其中，a*值越大，顏色越紅，與傳統(tǒng)分類標(biāo)準(zhǔn)相符，因此，可以利用色差儀測定的色度值對丹參藥材進(jìn)行客觀分級。

2.2 活性成分含量測定

2.2.1 水溶性成分 迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 3種水溶性成分的色譜圖見圖1，含量見表2。結(jié)果顯示，丹參藥材水溶性成分，呈現(xiàn)出顏色越紅含量越高的趨勢。迷迭香酸含量在顏色為棕褐色時顯著降低，紫草酸、丹酚酸B含量在棕紅色時就有顯著降低。顏色變化對含量影響最大的是丹酚酸B，各顏色級別之間均有顯著性差異。顏色最紅的1級磚紅色丹參中的迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B及三者總含量分別是4級棕褐色丹參的1.127、1.185、1.561及1.540倍。endprint

2.2.2 脂溶性成分 二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮4種脂溶性成分的色譜圖見圖2，含量見表3。結(jié)果顯示，丹參藥材脂溶性成分仍然顯示出顏色越紅含量越高的趨勢。除二氫丹參酮Ⅰ在磚紅色與棕紅色之間沒有顯著差異外，其它成分在各顏色級別中均存在顯著性差異，提示顏色變化對脂溶性成分含量的影響要比水溶性成分大。顏色最紅的1級磚紅色丹參中的二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮及四者總含量分別是4級棕褐色丹參的2.077、2.625、4.724、3.957及4.086倍。

2.3 藥材表面顏色與活性成分含量間的相關(guān)性分析

由表4可知，丹參藥材中的各種活性成分含量與L*值均為負(fù)相關(guān)，其中迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ含量及水溶性成分總含量與L*值呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）；各活性成分含量與a*、b*值均為正相關(guān)，其中隱丹參酮、丹參酮ⅡA及脂溶性成分總含量與a*、b*值均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；紫草酸和二氫丹參酮Ⅰ含量與各色度值之間的相關(guān)性未達(dá)顯著水平（P>0.05）。可見，丹參水溶性成分含量與L*相關(guān)性更高，而脂溶性成分含量與色度值a*、b*的相關(guān)性更高。

3 結(jié)論與討論

3.1 利用色差儀對丹參藥材顏色進(jìn)行測量，劃定了各顏色級別丹參的L*、a*、b*值范圍，可根據(jù)L*、a*、b*值的大小對丹參藥材進(jìn)行等級劃分。另外，丹參顏色越紅，a*值也越大，與傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)理論相符。

3.2 各顏色級別丹參間多數(shù)活性成分含量存在顯著性差異。除紫草酸和二氫丹參酮 Ⅰ 外，各成分含量與色度值L*、a*、b*之間相關(guān)性均達(dá)到顯著或極顯著水平，其中水溶性成分含量與L*相關(guān)性更高，而脂溶性成分含量與a*、b*的相關(guān)性更高。

3.3 本試驗(yàn)結(jié)果表明，依據(jù)色度值大小判斷藥材質(zhì)量好壞，可作為一種快速、簡便評價(jià)藥材質(zhì)量的新方法。不僅佐證了傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為的丹參藥材“色紅為好”，而且為丹參質(zhì)量評價(jià)提供了量化標(biāo)準(zhǔn)，避免了主觀評價(jià)的主觀性、模糊性及不確定性。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[K].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 趙娜，郭治昕，趙雪，等.丹參的化學(xué)成分與藥理作用[J].國外醫(yī)藥·植物藥分冊，2007，22（4）：155-160.

[3] 孫克勤，李素芝，劉厚東，等.丹參對高原人鼠缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國民間醫(yī)學(xué)雜志，2005，17（1）：10-11.

[4] 鄧惠英.丹參及其有效成分的藥理研究概況[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23（12）：1812-1813.

[5] 姜衛(wèi)衛(wèi)，張永清，李佳.丹參最佳采收期初討[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2008，22（1）：12-14.

[6] 趙志剛，郜舒蕊，侯俊玲，等.不同產(chǎn)地加工方法對山東丹參藥材質(zhì)量的影響[J].中國中藥雜志，2014，39（8）：1396-1400.

[7] 金樟照，祝明，張文婷，等.不同產(chǎn)地丹參水溶性成分和脂溶性成分指紋圖譜測定及相關(guān)性研究[J].中草藥，2004，35（10）：100-103.endprint