紅景天和黨參合劑對(duì)小鼠免疫功能的影響

馬天宇，姜國哲，韓春姬，劉麗萍，俞篤文

(1. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室，吉林 延吉 133002；3. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，吉林 延吉 133002；4. 嘉南藥理大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)系，臺(tái)灣 臺(tái)南 71710；5. 臺(tái)灣豐山生技醫(yī)藥品股份公司，臺(tái)灣 臺(tái)北 10597)

紅景天和黨參合劑對(duì)小鼠免疫功能的影響

馬天宇1，姜國哲2，韓春姬2，劉麗萍3，俞篤文4,5

(1. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室，吉林 延吉 133002；3. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，吉林 延吉 133002；4. 嘉南藥理大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)系，臺(tái)灣 臺(tái)南 71710；5. 臺(tái)灣豐山生技醫(yī)藥品股份公司，臺(tái)灣 臺(tái)北 10597)

目的：應(yīng)用血清藥理學(xué)方法探討紅景天提取物(RSE)與黨參提取物(CPE)合劑對(duì)免疫功能的影響，分析提高免疫功能的最佳配伍劑量。方法：采用3×3析因設(shè)計(jì)，制備9種不同濃度的CPE和RSE混合含藥血清，在體外測(cè)定T、B 淋巴細(xì)胞增殖活性和 NK 細(xì)胞活性，確定CPE和RSE的最佳組合劑量。用該組合劑量縮小2.5、5.0及10.0倍作為RSE+CPE合劑高、中和低劑量組，進(jìn)行小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)T、B 淋巴細(xì)胞的增殖能力和NK 細(xì)胞的殺傷能力。結(jié)果：血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，與空白組比較，RSE 200 mg·kg-1+CPE 790 mg·kg-1劑量組由ConA、LPS誘導(dǎo)的T、B淋巴細(xì)胞增殖能力及NK細(xì)胞活性明顯升高(P<0.05)。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，與環(huán)磷酰胺組比較，RSE+CPE合劑中(RSE 40 mg·kg-1+CPE 158 mg·kg-1)和高劑量(RSE 80 mg·kg-1+ CPE 316 mg·kg-1)組脾臟指數(shù)(SI)明顯升高(P<0.05)；與RSE+合劑低劑量(RSE20 mg·kg-1+CPE 79 mg·kg-1)組比較，合劑中劑量組白細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.05)；與環(huán)磷酰胺組比較，CPE合劑高、中和低3個(gè)劑量組及陽性藥物CVT-200(富含西洋參多糖的免疫增強(qiáng)劑)組ConA、LPS誘導(dǎo)的T、B淋巴細(xì)胞增殖能力及NK細(xì)胞活性均顯著升高(P<0.05)；與CVT-200組、合劑高劑量和低劑量組比較，合劑中劑量組T、B淋巴細(xì)胞增殖能力及NK細(xì)胞活性均顯著升高(P<0.05)。結(jié)論：RSE和CPE合劑有增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用，RES 200 mg·kg-1與CPE 790 mg·kg-1組合的合劑為最佳配伍劑量。

紅景天；黨參；免疫功能

高山紅景天(Rhodiolasachalinensis,RS)屬景天科(Crasulaceae)紅景天屬多年生草木或亞灌木植物,被譽(yù)為“高原人參”[1]，其主要化學(xué)成分包括黃酮類、皂苷類、氨基酸類、酚類、豆香素類、萜類、礦物質(zhì)、酶類、揮發(fā)油以及其他一些常見的大分子物質(zhì)，如多糖類、果膠、脂類、蛋白質(zhì)和蠟類[2]。以往研究[3]表明：高山紅景天多糖參與體液免疫、細(xì)胞免疫和非特異性免疫,是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑。黨參為桔?？浦参稂h參[Codonopsispilosula(Franch)Nannf,CP]及其同屬多種植物的干燥根，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺之功效，其主要成分有多糖，單糖，黨參炔苷，黨參苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，蒼術(shù)內(nèi)酯類，烯醇類，煙酸，香草酸，阿魏酸及無機(jī)元素等有效成分。黨參具有比較豐富的藥理作用，其中對(duì)免疫功能作用的研究最為深入[4]。復(fù)方中藥制劑的優(yōu)點(diǎn)是既保持了成分多樣化、藥理作用廣泛等特點(diǎn),又有化學(xué)不良反應(yīng)少而輕、無依賴性的特點(diǎn)[5]。不同的中藥復(fù)方可以相互作用，更好地達(dá)到提高免疫作用的效果，實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)免疫調(diào)節(jié)。如黨參與黃芪、枸杞配伍，對(duì)環(huán)磷酰胺處理的免疫低下小鼠具有免疫保護(hù)作用[6]。但關(guān)于黨參與其他中藥配伍的最佳劑量研究報(bào)道甚少，紅景天和黨參配伍增強(qiáng)免疫功能的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，篩選紅景天聯(lián)合黨參提高免疫功能的最佳配伍劑量及其合劑對(duì)小鼠免疫功能的影響，為開發(fā)和利用紅景天和黨參資源提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器YAC-1細(xì)胞(小鼠淋巴瘤細(xì)胞)購自上海博谷生物科技有限公司。RPMI-1640為美國Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、刀豆蛋白(concanavalin，ConA)、硫酸甲酯酚嗪(phenazinemethosulfate，PMS)均為美國Sigma公司產(chǎn)品，MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2h-tetrazolium)為美國Promega公司產(chǎn)品，環(huán)磷酰胺(CTX)為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，CVT-200(富含西洋參多糖的免疫增強(qiáng)劑)由韓國食品研究院提供。MCO-5AC型CO2培養(yǎng)箱為日本SanYo公司制造，DG5033A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀為南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司制造。

1.2紅景天和黨參提取物制備紅景天為吉林省敦化市產(chǎn)的人工種植高山紅景天(Rhodiolarsachalinensis)，粗粉碎后備用。黨參飲片購自同仁堂藥店。稱取紅景天200 g和黨參400 g，分別加入10倍體積雙蒸水浸泡24 h，100℃加熱提取120 min，過濾，藥渣中再分別加入8倍體積雙蒸水，100℃加熱提取60 min，過濾，合并2次濾液。濾液經(jīng)3 000 r·min-1離心20 min，濾紙過濾，提取物進(jìn)行減壓真空濃縮、干燥后得紅景天提取物(Rhodiolarsachalinensis extract，RSE)粉末48.4 g，黨參提取物(Codonopsispilosula extract，CPE)粉末252.0 g。

1.3含藥血清的制備清潔級(jí)SD雌性大鼠9只，體質(zhì)量180～200 g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：2011-0007)。在IVC飼養(yǎng)系統(tǒng)適應(yīng)3 d，自由供給飼料和飲水。按表1的設(shè)計(jì)方案進(jìn)行3×3析因設(shè)計(jì)，制備RSE、CPE及RSE+CPE含藥血清。RSE設(shè)3個(gè)劑量(0、200和400 mg·kg-1)，CPE設(shè)3個(gè)劑量(0、790和1 580 mg·kg-1)，設(shè)計(jì)9個(gè)不同的劑量組合，分別給大鼠連續(xù)灌胃5 d，每天早晚各1次。第5天灌胃給藥1 h后，將大鼠乙醚麻醉，無菌條件下摘眼球取血，靜止2 h后，2 000 r·min-1離心10 min，分離血清，置于56℃水浴30 min，進(jìn)行滅活處理。

表1　RSE和CPE聯(lián)合作用的3×3析因設(shè)計(jì)

1.4細(xì)胞懸液的制備將BALB/c品系清潔級(jí)小鼠(延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)頸椎脫臼處死，無菌取小鼠的脾臟，用眼科剪剪碎，用5 mL一次性注射器芯研磨，制備成脾細(xì)胞懸液。

1.5脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)用含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的RPMI 1640完全培養(yǎng)基將脾細(xì)胞稀釋成1×106mL-1，移入96孔板中，每孔加45 μL。T淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)孔設(shè)計(jì)：每孔加入含ConA(終濃度為7 mg·L-1)完全培養(yǎng)基45 μL及含藥血清10 μL，刺激T 淋巴細(xì)胞的增殖。B細(xì)胞實(shí)驗(yàn)孔設(shè)計(jì)：每孔加入含LPS(終濃度為10 mg·L-1)完全培養(yǎng)基45 μL及含藥血清10 μL，刺激B淋巴細(xì)胞的增殖。對(duì)照孔設(shè)計(jì)：加入含有10% 胎牛血清的RPMI 1640 45 μL及正常血清10 μL。上述各項(xiàng)均設(shè)置5個(gè)平行孔。將96孔板放置在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。T和B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，每孔加入混合好的MTS-PMS 20 μL，繼續(xù)置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h后，將培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀內(nèi)于492 nm處測(cè)定吸光度(A)值，以A值表示細(xì)胞增殖活性。T淋巴細(xì)胞增殖活性=T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)孔A值-對(duì)照孔A值。B淋巴細(xì)胞增殖活性=B淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)孔A值-對(duì)照孔A值。

1.6NK細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)用含10%胎牛血清的 RPMI 1640完全培養(yǎng)基將脾細(xì)胞和YAC-1細(xì)胞分別稀釋成2×106mL-1和1×105mL-1。靶細(xì)胞實(shí)驗(yàn)孔設(shè)計(jì)：每孔中各加入脾細(xì)胞45 μL和對(duì)數(shù)生長期的YAC-1細(xì)胞45 μL，含藥血清10 μL。效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔：每孔加入脾細(xì)胞和含有10%胎牛血清的RPMI 1640各45 μL，正常血清10 μL；靶細(xì)胞對(duì)照孔設(shè)計(jì)：每孔中均加入YAC-1細(xì)胞和含10%胎牛血清的RPMI 1640各45 μL，正常血清10 μL。上述各項(xiàng)均設(shè)置5個(gè)平行孔。將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，每孔加入混合好的MTS-PMS 20 μL，繼續(xù)置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h 后，將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀內(nèi)，于492 nm處測(cè)定A值。以A值表示細(xì)胞活性。NK細(xì)胞活性=[靶細(xì)胞對(duì)照孔A值-(實(shí)驗(yàn)孔A值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔A值)]/靶細(xì)胞對(duì)照孔A值×100%。

1.7小鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)采用上述篩選的最佳組合劑量縮小10倍進(jìn)行小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，設(shè)6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即空白對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組、陽性藥物(CVT-200，200 mg·kg-1)對(duì)照組、低劑量(RSE 20 mg·kg-1+ CPE 79 mg·kg-1)組、中劑量(RSE 40 mg·kg-1+ CPE 158 mg·kg-1)組、高劑量(RSE 80 mg·kg-1+ CPE 216 mg·kg-1)組。選取7～8周齡雄性清潔級(jí)昆明種小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，自由供給基礎(chǔ)飼料及水，在本實(shí)驗(yàn)室IVC飼養(yǎng)系統(tǒng)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為6組，每組10只。連續(xù)灌胃28 d。每周記錄2次小鼠體質(zhì)量變化情況及飼料攝入量。空白對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組每天灌胃蒸餾水，陽性對(duì)照組每天灌胃CVT-200藥物，實(shí)驗(yàn)組分別以RSE和CPE合劑高、中、低劑量連續(xù)灌胃，共28 d。在實(shí)驗(yàn)第23和24天，空白對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.1 mL·kg-1，其他組腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg·kg-1，連續(xù)2 d，注射后第5天處死小鼠，取出脾臟，按1.4所述方法制備脾細(xì)胞懸液，按1.5和1.6所述方法測(cè)定T、B淋巴細(xì)胞的增殖活性和NK細(xì)胞的活性。

1.8小鼠臟器指數(shù)的測(cè)定小鼠處死前稱體質(zhì)量,處死小鼠，并記錄所有小鼠的脾臟及胸腺質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)(mg/10 g)。脾臟指數(shù)(SI)=脾臟質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量 (g )×10；胸腺指數(shù)(TI)=胸腺質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量 (g) ×10。

1.9小鼠白細(xì)胞數(shù)的測(cè)定將小鼠處死，摘眼球取血，取20 μL血加入到380 μL白細(xì)胞稀釋液中，混勻，顯微鏡下記錄白細(xì)胞數(shù)量。

2　結(jié)　果

2.1紅景天與黨參最佳配比的體外析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)與空白對(duì)照組比較，所有的RSE和CPE含藥血清組其由ConA、LPS誘導(dǎo)的T和B淋巴細(xì)胞增殖活性及NK細(xì)胞活性均顯著升高(P<0.05)。與RSE 200 mg·kg-1和CPE 790 mg·kg-1含藥血清組比較，RSE 200 mg·kg-1+ CPE 790 mg·kg-1含藥血清組其由ConA、LPS誘導(dǎo)的T和B淋巴細(xì)胞增殖活性及NK細(xì)胞活性均顯著升高(P<0.05)，且RSE 200 mg· kg-1+CPE 790 mg·kg-1含藥血清組由ConA、LPS誘導(dǎo)的T和B淋巴細(xì)胞增殖活性顯著高于RSE 400 mg· kg-1+CPE 1 580 mg·kg-1含藥血清組(P<0.05)。RSE和CPE的最佳組合劑量為200 mg·kg-1RSE 和790 mg· kg-1CPE (表2)。RSE和CPE的交互作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2　紅景天與黨參合劑最佳配比篩選實(shí)驗(yàn)

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsRSE 200 mg·kg-1group；#P<0.05vsCPE 790 mg·kg-1group;▲P<0.05vsRSE 400 mg·kg-1+CPE 1 580 mg·kg-1group.

利用篩選出的最佳組合劑量組成紅景天和黨參合劑(RSE-CPE)，重復(fù)進(jìn)行血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)。與空白對(duì)照組比較，RS+CPE低、中和高劑量組由 ConA、LPS誘導(dǎo)的T和B淋巴細(xì)胞增殖活性明顯升高，中和高劑量組NK細(xì)胞的活性明顯升高(P<0.05)。而且中劑量組ConA和LPS誘導(dǎo)的T和B淋巴細(xì)胞增殖活性及NK細(xì)胞活性顯著高于低和高劑量組(P<0.05)，與析因?qū)嶒?yàn)結(jié)果一致。見表3。

2.2小鼠體質(zhì)量的變化在實(shí)驗(yàn)第23和24天，空白對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.1 mL·kg-1，其他組腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg·kg-1，連續(xù)2 d，記錄各組小鼠體質(zhì)量變化。各組小鼠體質(zhì)量均無明顯差異(P>0.05)。見表4。

2.3小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)臟器指數(shù)及白細(xì)胞計(jì)數(shù)CTX組SI、TI和白細(xì)胞數(shù)均顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)。與環(huán)磷酰胺組比較，RS+CPE合劑中和高劑量組的SI顯著高于CTX組(P<0.05)；CVT-200和RS+CPE合劑低、中和高劑量組白細(xì)胞數(shù)均顯著高于CTX組(P<0.05)。見表5。

表3　紅景天與黨參合劑最佳配比驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vslow dose group；△P<0.05vshigh dose group. RSE-CPE low dose group：RSE 100 mg·kg-1+ CPE 395 mg·kg-1；RSE-CPE middle dose group： RSE 200 mg·kg-1+ CPE 790 mg·kg-1；RSE-CPE high dose group：RSE 400 mg·kg-1+ CPE 1 580 mg·kg-1.

表4各組小鼠體質(zhì)量變化

GroupBodyweight(t/d) 1471013Control25.16±1.1131.41±1.7634.53±2.3136.40±2.4138.54±2.69CTX40mg·kg-125.91±1.2832.60±1.8336.10±2.2338.13±2.4740.08±2.46CVT-200200mg·kg-126.30±1.7732.77±2.4736.12±2.4838.26±2.3940.25±2.44RSE+CPE Lowdose25.59±1.1432.72±1.1436.00±1.8238.42±2.1539.91±2.36 Middledose26.52±1.3132.87±1.5836.36±1.9039.09±2.4540.85±2.69 Highdose25.98±1.5732.11±2.4836.03±3.5738.09±3.5640.22±3.60GroupBodyweight(t/d) 17212528Control40.89±2.8543.02±3.6744.19±4.0345.10±4.18CTX40mg·kg-142.58±2.8444.52±3.0645.54±3.1146.64±3.26CVT-200200mg·kg-143.21±3.0744.39±3.6345.41±4.2745.88±4.35RSE+CPE Lowdose42.96±3.0244.55±3.2045.54±3.3346.20±3.79 Middledose43.89±3.2045.30±3.7546.50±3.8747.68±4.14 Highdose42.94±3.8844.41±3.8145.20±3.9545.61±4.02

表5　各組小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)臟器指數(shù)和白細(xì)胞數(shù)

*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsCTX group；#P<0.05vslow dose group. Low dose of RSE-CPE group:RSE 20 mg·kg-1+ CPE 79 mg·kg-1；Middle dose of RSE-CPE group： RSE 40 mg·kg-1+ CPE 158 mg·kg-1；High dose of RSE-CPE group：RSE 80 mg·kg-1+ CPE 316 mg·kg-1.

2.4各組小鼠免疫功能指標(biāo)與空白對(duì)照組比較，CTX組小鼠的T和B淋巴細(xì)胞增殖活性及NK細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。CVT-200組，RS+CPE合劑高、中和低劑量組由ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖活性及NK細(xì)胞活性均顯著高于CTX組(P<0.05)。RS-CPE合劑中劑量組小鼠T和B淋巴細(xì)胞增殖活性及NK細(xì)胞活性顯著高于CVT-200組和RS+CPE合劑高、低劑量組(P<0.05)。RS+CPE合劑高劑量組小鼠NK細(xì)胞活性顯著高于CVT-200組(P<0.05)。

表6　各組小鼠體內(nèi)T和B淋巴細(xì)胞增殖情況及NK細(xì)胞活性

*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vsCTX；#P<0.05vsCVT-200 group；▲P<0.05vslow dose of RSE+CPE group.◆P<0.05vshigh dose of RSE+CPE group.Low dose of RSE+CPE group:RSE 20 mg·kg-1+ CPE 79 mg·kg-1；Middle dose of RSE+CPE group:RSE 40 mg·kg-1+ CPE 158 mg·kg-1；High dose of RSE+CPE group:RSE 80 mg·kg-1+ CPE 316 mg·kg-1.

3　討　論

以往的中藥藥理實(shí)驗(yàn)多采用將中藥粗提物直接進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，但粗提物不能代表在體內(nèi)能真正發(fā)揮作用的有效成分[7]。血清藥理學(xué)的提出排除了通常體外實(shí)驗(yàn)所帶來的弊端。制備含藥血清所需的給藥時(shí)間報(bào)道不一致，有實(shí)驗(yàn)早晚2次給藥，連續(xù)給藥3 d[8]，也有實(shí)驗(yàn)連續(xù)給藥4 d[9]。李秀榮等[10]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):連續(xù)給藥5 d和10 d，其含藥血清的藥理活性相近。

本實(shí)驗(yàn)采用3×3析因設(shè)計(jì)，制備了9種RSE和CPE不同劑量組合的合劑，給大鼠連續(xù)灌胃5 d得到含藥血清，體外進(jìn)行T、B淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及NK細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：RSE 200 mg·kg-1+ CPE 790 mg·kg-1組合的合劑提高免疫功能的作用明顯優(yōu)于單獨(dú)用相應(yīng)劑量的RSE或CPE，且其作用優(yōu)于其他劑量的組合，提示該劑量組合為RSE和CPE增強(qiáng)免疫功能的最佳劑量組合。本研究結(jié)果表明:RSE和CPE間無顯著的交互作用，提示RSE和CPE的聯(lián)合作用僅為2種物質(zhì)的相加作用。

血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中給藥劑量的選擇是血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。給藥量通常選擇整體動(dòng)物的等效劑量或乘以一定的倍數(shù)[11]，目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示:RSE和CPE合劑的血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)劑量為5倍于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)劑量時(shí)效果最佳。

為了進(jìn)一步證明血清藥理學(xué)篩選的最佳劑量組合在體內(nèi)的免疫增強(qiáng)功能，本研究取血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)最佳劑量的1/10、1/5及2/5，檢測(cè)RSE和CPE合劑對(duì)免疫抑制小鼠的免疫增強(qiáng)作用。CTX是較強(qiáng)的烷化劑，對(duì)骨髓細(xì)胞具有毒性，且可殺傷各種免疫細(xì)胞，抑制免疫功能。本實(shí)驗(yàn)中給予CTX的小鼠各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)均明顯低于正常對(duì)照組，表明小鼠免疫功能受損，模型制備成功。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)最佳劑量的1/5(RSE 40 mg·kg-1和CPE 158 mg·kg-1)劑量組合顯著提高免疫抑制小鼠T和B淋巴細(xì)胞增殖能力及NK細(xì)胞活性，而且作用優(yōu)于其他2個(gè)劑量組合，此結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

研究[12]表明：給予老年大鼠喂飼添加紅景天苷的飼料，增加其總T細(xì)胞(CD3+)和輔助T細(xì)胞(CD4+)，可以通過增強(qiáng)大鼠單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的功能從而提高機(jī)體的防御能力。李立等[13]給小鼠連續(xù)灌胃紅景天提取物30 d，紅景天提取物可明顯提高小鼠NK細(xì)胞活性及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

唐清秀等[14]觀察發(fā)現(xiàn)：甘肅產(chǎn)黨參精和黨參多糖能提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，并增加免疫器官質(zhì)量。曹麗等[15]和李艷等[16]分別探討了黨參多糖和新疆黨參多糖對(duì)正常脾淋巴細(xì)胞增殖的作用，均發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)作用,且前者作用明顯。俞星等[17]發(fā)現(xiàn)黨參皂苷D在一定劑量范圍內(nèi)能較好的抑制肝癌細(xì)胞的增殖及擴(kuò)散。馬方勵(lì)等[18]研究發(fā)現(xiàn)黨參多糖具有促進(jìn)小鼠小腸推動(dòng)、促進(jìn)大鼠消化及生長的作用。

胸腺和脾臟是重要的免疫器官。脾臟可以從血液中收集抗原，經(jīng)過T、B淋巴細(xì)胞的成熟和抗原的刺激，形成淋巴細(xì)胞分化的主要場(chǎng)所。胸腺和脾臟質(zhì)量和指數(shù)變化是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫狀況的重要指標(biāo)[19]，常用于免疫增強(qiáng)功能的初篩實(shí)驗(yàn)。白細(xì)胞數(shù)量的變化可以影響機(jī)體的免疫力。本實(shí)驗(yàn)在預(yù)先給予RSE和CPE合劑的同時(shí)腹腔注射CTX后，SI和白細(xì)胞數(shù)顯著升高，表明RSE和CPE合劑對(duì)CTX所致的脾臟萎縮和白細(xì)胞減少的不良反應(yīng)具有顯著的拮抗作用。上述結(jié)果提示RSE和CPE合劑有望作為臨床癌癥化療的輔助治療劑，減少化療藥物免疫抑制的不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中RSE和CPE合劑對(duì)CTX所致的免疫抑制小鼠TI雖然有一定的升高作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)其原因可能是實(shí)驗(yàn)周期較短，胸腺尚未得到恢復(fù)。

T淋巴細(xì)胞是重要的免疫活性細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞在受到抗原刺激后變成致敏細(xì)胞，攻擊具有抗原性的異物，其經(jīng)有絲分裂原ConA激活后轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化增殖程度可反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能。B淋巴細(xì)胞在受到抗原刺激后變成漿細(xì)胞，產(chǎn)生并分泌多種免疫球蛋白，使抗體與抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，對(duì)抗原進(jìn)行攻擊，消除對(duì)抗體的損害作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：高、中、低劑量RSE和CPE合劑可顯著提高免疫抑制小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖能力及B淋巴細(xì)胞增殖能力，且中劑量組的作用最強(qiáng)，說明RSE和CPE合劑在一定劑量范圍內(nèi)可以上調(diào)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，從而提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠特異性體液免疫和細(xì)胞免疫功能，且存在最佳作用劑量范圍。RSE和CPE合劑中劑量組增強(qiáng)免疫功能的作用顯著高于陽性對(duì)照藥物CVT-200組，表明本研究所用的RSE和CPE合劑增強(qiáng)免疫功能的作用達(dá)到或超過市售的免疫調(diào)節(jié)劑，具有可開發(fā)利用的價(jià)值。

骨髓抑制、白細(xì)胞數(shù)減少、NK細(xì)胞活性降低及機(jī)體免疫功能降低是癌癥化療過程中常出現(xiàn)的不良反應(yīng)[20]。NK 細(xì)胞在脾臟中占3%～4%，是與 T、B 細(xì)胞并列的第三類群淋巴細(xì)胞。NK細(xì)胞在抑制和清除惡性腫瘤細(xì)胞中起著非常重要的作用[21]，其殺傷能力的增強(qiáng)也反映了免疫功能的增強(qiáng)。王著敏等[22]研究顯示：RSE可提高慢性疲勞模型動(dòng)物NK細(xì)胞的殺傷活性，其作用優(yōu)于歸脾丸。很多研究結(jié)果表明：具有增強(qiáng)免疫功能的成分相互配伍后，其增強(qiáng)免疫功能作用顯著放大[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：RSE和CPE聯(lián)合應(yīng)用顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，且其作用優(yōu)于單獨(dú)使用RSE或CPE，提示RSE和CPE配伍有利于提高增強(qiáng)免疫功能。

綜上所述，RSE和CPE組成的合劑增強(qiáng)了免疫抑制小鼠T和B淋巴細(xì)胞增殖能力及NK細(xì)胞活性，其作用優(yōu)于2種提取物單一使用時(shí)的效果。有關(guān)RSE和CPE合劑增強(qiáng)免疫功能的作用機(jī)制有待于今后進(jìn)一步研究。

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Influence of Rhodiolasachalinensis and Codonopsispilosula mixture in immune function of mice

MA Tianyu1,JIANG Guozhe2,HAN Chunji2,LIU Liping3,YU Duwen4,5

(1. Department of Preventive Medicine，College of Medical Sciences,Yanbian University,Yanji 133002,China; 2. Department of Immunology and Pathogenic Biology，College of Medical Sciences,Yanbian University,Yanji 133002,China; 3. Department of Physiology,College of Medical Sciences,Yanbian University，Yanji 133002，China; 4.Department of Pharmacy,College of Pharmacy,Chia Nan University，Tainan 71710，Taiwan; 5.Fun Sun Medical and Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.,Taipei 10597，Taiwan)

ObjectiveUsing serum pharmacology method to assess the optimal dose of Rhodiolasachalinensis extract(RSE)and Codonopsispilosula extract(CPE)combination as well as the effects of the combination on the immune function of mice.MethodsUsing the 3×3 facterial design,nine medicated serum of CPE and RSE mixture were made to assess the optimum combinational dose of CPE and RSE by detecting the T,B lymphocyte proliferation abilities and NK cell activityinvitro.Using the optimum combinational dose and reducing 2.5,5 and 10 times as high,middle and low doses of RSE+CPE groups,and the T,B lymphocyte proliferation abilities and the activity of NK cells in the mice were detectedinvivo.ResultsThe result of serum pharmacology indicates that compared with control group,the proliferation abilities of T,B lymphocytes and the activity of NK cells inducing by ConA and LPS in 200 mg·kg-1RSE +790 mg·kg-1CPE group were increased (P<0.05).The result ofinvivoexperiment indicated that compared with cyclophosphamide group,the spleen indexes(SI) in middle and high doses of RSE+CPE groups were significantly increased (P<0.05); compared with low dose of RSE+CPE group,the WBC number in middle dose of RSE+CPEgroup was significantly increased (P<0.05).Compared with cyclophosphamide group,the T and B cell proliferation abilities induced with ConA and LPS and killing activities of NK cells in low,middle and high doses of RSE+CPE groups and positive drug CVT-200 group were significantly increased (P<0.05).Compared with CVT-200 group,low and high doses of RSE+CPE groups,the T and B cell proliferation abilities induced with ConA and LPS and the activity of NK cells in middle dose of RSE+CPE group were significantly increased(P<0.05).ConclusionRSE and CPE mixture can enhance the immune function of mice； RES 200 mg·kg-1and CPE 790 mg·kg-1are the optimal doses.

Rhodiolasachalinensis；Codonopsispilosula;serum pharmacology; immune function

1671-587Ⅹ(2015)06-1163-08

10.13481/j.1671-587x.20150613

2015-06-17

科技部國際合作專項(xiàng)基金資助課題(2011DFA33470)；吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助課題(200905208)

馬天宇(1990-)，女，吉林省延吉市人，在讀醫(yī)學(xué)碩士，主要從事分子毒理學(xué)及保健食品研發(fā)方面的研究。

韓春姬，教授，博士研究生導(dǎo)師(Tel:0433-2435076，E-mail：cjhan@ybu.edu.cn)；

俞篤文，助理教授，碩士研究生導(dǎo)師(Tel：886-2-27682713，E-mail:vincent@fungsun.com)

R285

A