吉林漢族人群ERAP1基因3′UTR單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)聯(lián)性分析

楊四寶，劉雪巖，李　冰，丁　梅，賀玉泉，楊　萍

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院心內(nèi)科， 吉林 長春 130033)

吉林漢族人群ERAP1基因3′UTR單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)聯(lián)性分析

楊四寶，劉雪巖，李冰，丁梅，賀玉泉，楊萍

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院心內(nèi)科， 吉林 長春 130033)

目的：探討ERAP1基因在高血壓患者外周血中的表達，鑒定ERAP1基因3′UTR區(qū)與原發(fā)性高血壓有關(guān)聯(lián)的候選單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點。方法：在吉林地區(qū)漢族人群中選取高血壓患者300例(高血壓組)及正常對照者233名(對照組)進行病例對照研究，采用ELISA法檢測研究對象的外周血中ERAP1表達水平，混池測序法鑒定ERAP1基因 3′UTR區(qū)SNPs位點，采用PCR測序的方法對研究對象進行測序分型。結(jié)果：高血壓組患者外周血中ERAP1表達水平明顯低于對照組 (P<0.05)；ERAP1基因 3′UTR區(qū)鑒定出2個SNPs位點E20-790G>A和E20-816C>T，E20-816C>T位點的等位基因及基因型頻數(shù)分布在高血壓組和對照組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);排除混雜因素后，Logistic回歸分析，E20-816C>T位點CT基因型頻數(shù)在高血壓組中顯著降低(P<0.05，OR=0.145，95% CI: 0.031-0.675)。結(jié)論：在吉林地區(qū)漢族人群中，ERAP1基因E20-816C>T位點多態(tài)性可能與原發(fā)性高血壓有關(guān)聯(lián)，高血壓中CT基因型頻數(shù)的降低可能與ERAP1表達下調(diào)有關(guān)聯(lián)。

原發(fā)性高血壓;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨基肽酶1;單核苷酸多態(tài)性;分子遺傳學;關(guān)聯(lián)研究

原發(fā)性高血壓是一種遺傳因素和環(huán)境因素相互作用所致的疾病，流行病學研究[1]表明：30%～40%的血壓變化是由基因引起的，因此分子遺傳學研究在高血壓的治療中有望發(fā)揮關(guān)鍵作用。本課題組前期進行了高血壓患者和正常人外周血芯片基因差異表達分析[2]，鑒定出31個表達上調(diào)和18個表達下調(diào)的基因，其中高血壓患者中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨基肽酶1(endoplasmic reticulum aminopeptidase 1，ERAP1)基因表達水平是正常人的0.46倍，其表達水平明顯下調(diào)。ERAP1是鋅金屬肽酶M1家族中的一個多功能酶，能水解多種生物活性肽[3]。ERAP1 和 ERAP2 可通過影響腎素-血管緊張素系統(tǒng)在血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，ERAP1 可有效將血管緊張素Ⅱ 剪切為血管緊張素Ⅲ 和Ⅳ，而ERAP2則可將血管緊張素Ⅲ剪切為 IV[4]，在相同的系統(tǒng)內(nèi)，2種酶均可將激肽轉(zhuǎn)化為緩激肽[5]。ERAP1是具有高度多態(tài)性的基因，其天然存在的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)與很多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)[6-8]。在與原發(fā)性高血壓的關(guān)聯(lián)研究中，Yamamoto等[9]發(fā)現(xiàn)：ERAP1基因Lys528Arg SNP位點與原發(fā)性高血壓有關(guān)聯(lián)，并推測Lys528Arg位點突變型ERAP1酶活性低于野生型。3′非翻譯區(qū)(3′ untranslated region,3′UTR)可通過影響mRNA的穩(wěn)定性和蛋白表達水平在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用，一些基因的3′UTR區(qū)多態(tài)性被證實與原發(fā)性高血壓患病風險有關(guān)聯(lián)[10-12]。因此本課題組首先對高血壓患者和正常血壓對照者進行外周血ERAP1檢測，驗證高血壓患者的ERAP1表達水平是否下調(diào)；同時選擇ERAP1基因3′UTR區(qū)的SNPs位點為研究對象，在中國東北地區(qū)漢族人群中進行病例對照研究，鑒定ERAP1基因是否為原發(fā)性高血壓的易感基因，為高血壓的分子遺傳學研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1一般資料選擇2014年4月于吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院體檢中心進行體檢的吉林地區(qū)漢族人533名，年齡25～69歲，測量身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù) (body mass index,BMI)、心率(heart rate,HR)、收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、快速血糖(fast blood glucose,FBG)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、尿酸(uric acid,UA)和血清肌酐(serum creatinine,SCr)水平。血壓由心臟病專家根據(jù)歐洲高血壓協(xié)會推薦的通用方案進行2次測量[13]，中間間隔5 min。高血壓組納入標準：平均收縮壓(mean systolic pressure,MSP)≥ 140 mmHg 和/或平均舒張壓(mean diastolic pressure,MDP)≥90 mmHg，或自述正在服用抗高血壓藥物。對照組納入標準：MSP<140 mmHg和MDP<90 mmHg，且從未進行過降壓治療。排除標準： 繼發(fā)性高血壓患者;有原發(fā)性腎臟疾病者;有內(nèi)分泌疾病者。最終入選原發(fā)性高血壓患者300例，正常血壓對照者233名。BMI = 體質(zhì)量(kg)/身高2(m2)；每位參與者均進行問卷調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括吸煙及飲酒情況，每年吸煙≥100支或飲酒≥12次定義為吸煙者或飲酒者[14-15]。本研究符合赫爾辛基宣言,獲吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會批準，所有參與者均獲取知情同意，并簽署試驗知情同意書。

1.2研究對象外周血中ERAP1表達水平測定及基因分型隨機抽取42例高血壓患者和34例對照者的血樣，采用促凝試管收集，離心獲取血清于-80℃保存，根據(jù)人類ERAP1 Elisa檢測試劑盒(IBL公司,Germany)說明書進行外周血ERAP1水平檢測。其余258例高血壓患者和199名正常對照者血樣用EDTA抗凝試管收集并儲存于-20℃，采用AxyPrep (Axygen Scientific公司,USA)全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA，其中隨機選取100個DNA樣本分成5個混池，每個混池20個DNA樣本，分別對ERAP1的3′UTR區(qū)進行PCR擴增及測序分析，測序反應由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司完成。采用DNAStar序列比對軟件分析并識別DNA序列變異，篩選出2個SNPs位點，進一步通過測序的方法對所有樣本PCR純化產(chǎn)物進行基因分型，PCR反應上游引物：5′-AATCATCAGTCTCGGCTCTTCTG-3′ ，下游引物：5′ -TGTAAACAAACCGTGGAACTCTAAG -3′；RCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；4℃保存。

2　結(jié)　果

2.1研究對象的臨床資料和外周血中ERAP1表達水平高血壓組研究對象外周血中ERAP1表達水平明顯低于對照組(P<0.05)；高血壓組和對照組研究對象外周血中ERAP1表達水平及臨床資料見表1。用于ERAP1 3′UTR區(qū)基因分型的457名無血緣關(guān)系的參與者中有258例高血壓患者和199名正常血壓對照者，其中吸煙史和飲酒史的調(diào)查有部分數(shù)據(jù)缺失，吸煙史納入研究對象284名(對照組129名，高血壓組155名)；飲酒史納入研究對象282名(對照組129名，高血壓組153名)，其臨床資料見表2，除血壓水平，用于ERAP1 3′UTR基因分型研究的2組研究對象的性別構(gòu)成、年齡、吸煙史、飲酒史、TG、TC、FBG、BUN和BMI比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1　研究對象臨床資料和外周血中ERAP1表達水平

2.22組研究對象的SNPs通過對ERAP1 3′UTR區(qū)混池測序，鑒定出E20-790G>A和E20-816C>T 2個SNPs位點，其分別與NCBI標簽rs2290678和rs1953298對應，2個多態(tài)性位點的鑒定結(jié)果見圖1和2。E20-790G>A和E20-816C>T只有2種基因型，其最小等位基因頻數(shù)(minor allelic frequency，MAF)分別是0.012 和0.025，高血壓組和對照組研究對象2個SNPs位點等位基因和基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。

2.3SNPs與高血壓的關(guān)聯(lián)分析高血壓組與對照組研究對象E20-816C>T位點的基因型和等位基因頻數(shù)分布比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，突變基因型CT及突變堿基T在高血壓患者中出現(xiàn)的頻率顯著低于對照組；攜帶E20-816C者大多舒張壓較低。2組研究對象E20-790G>A位點的基因型及等位基因頻數(shù)分布比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，攜帶突變基因型GA者對應的SBP及DBP水平均較高。E20-790G>A 和 E20-816C>T 2個多態(tài)性位點的基因型和等位基因頻數(shù)以及不同基因型研究對象的平均SBP和DBP水平見表3和4。

表2　用于ERAP1 3′UTR基因分型研究對象的臨床資料

A: GG;B: GA.

Fig.1Identification diagram of sequencing for E20-790G>A SNPs sites

A: CC;B: CT;Arrow: SNP sites.

Fig.2Identification diagram of sequencing for E20-816C>T SNPs sites

表32組研究對象的ERAP1基因E20-790G>A和E20-816C>T位點基因型和等位基因頻數(shù)分布

Tab.3Distribution of genotypic and allelic frequencies at E20-790G>A and E20-816C>T sites of ERAP1 gene of objects in two groups

GroupnGenotypicfrequencyofE20-790G>AGGGAPAllelicfrequencyofE20-790G>AGAPControlHypertension258199195(98.5)250(96.9)3(1.5)8(3.1)0.274393(99.2)508(98.4)3(0.8)8(1.6)0.277GroupnGenotypicfrequencyofE20-816C>TCCCTPAllelicfrequencyofE20-816C>TCTPControlHypertension199258183(92.4)250(96.9)15(7.6)8(3.1)0.030381(96.2)508(98.4)15(3.8)8(1.6)0.033

排除混雜因素(包括年齡、性別、BMI、TC、TG、FBG、吸煙和飲酒習慣等)作用之后進行邏輯回歸分析結(jié)果顯示：E20-816C>T位點的CT基因型頻率在高血壓組中顯著降低(P=0.014，OR=0.145，95% CI: 0.031-0.675)，攜帶T等位基因的人群患高血壓的風險顯著降低，表明T等位基因可能是中國東北漢族人群患高血壓的一個保護因素。E20-790G>A位點未發(fā)現(xiàn)其與高血壓的關(guān)聯(lián)性。見表5。

表4　研究對象血壓與E20-790G>A和E20-816C>T 位點基因型的關(guān)系

表5ERAP1基因E20-790G>A 和 E20-816C>T位點基因型與原發(fā)性高血壓的Logistic回歸分析

Tab.5Logistic regression analysis of association between genotypes of E20-790G>A and E20-816C>T sites and essential hypertension

SiteContrastOR95%CIPE20-790G>AGG∶GA1.8530.335-10.2500.480E20-816C>TCC∶CT0.1450.031-0.6750.014

3　討　論

本研究驗證了在高血壓患者外周血中ERAP1呈低表達，這與本課題組Korkor等[2]的芯片表達及定量驗證研究結(jié)果一致，表明ERAP1表達水平下降與高血壓患病風險增加有關(guān)聯(lián)。本研究通過測序的方法在ERAP1基因的3′UTR區(qū)鑒定出2個SNP位點，并分別對這2個位點進行基因分型；關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示：ERAP1基因的E20-816C>T多態(tài)性位點在中國東北漢族人群中與原發(fā)性高血壓有關(guān)聯(lián)，等位基因T可能是原發(fā)性高血壓的保護因素，可以作為原發(fā)性高血壓風險預測的分子標記。

ERAP1通過降解AngⅡ和生成緩激肽參與血壓調(diào)節(jié)，其外顯子多態(tài)性經(jīng)證實與酶活性有關(guān)聯(lián)。Yamamoto等[9]通過對人類ERAP1基因33個外顯子多態(tài)性位點的篩選，發(fā)現(xiàn)Lys528Arg多態(tài)性位點與原發(fā)性高血壓有關(guān)聯(lián)，并推測Lys528Arg位點突變型ERAP1酶活性比野生型降低。隨后，Hallberg等[16]提出該多態(tài)位點決定了高血壓和左室肥厚患者在抗壓治療過程中左室肥厚的程度。為了驗證這一假說，Goto等[17-19]比較了野生型、Lys528Arg突變型和其他突變型的酶活性，結(jié)果顯示：在檢測的非同義多態(tài)性位點中，僅Lys528Arg突變體酶活性降低，表明其觀察到的關(guān)聯(lián)性確實是由于酶活性降低引起的；進一步分子模擬研究顯示Lys528位于酶底物袋附近，對于形成和保持酶底物袋非常重要。以上研究證實了ERAP1基因在血壓調(diào)節(jié)中的負性作用，而本文作者發(fā)現(xiàn)：原發(fā)性高血壓患者外周血中ERAP1表達水平顯著下調(diào)，與以上研究結(jié)果一致。

3′UTR區(qū)在真核生物轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用。真核生物mRNA降解有2種途徑: 一些mRNA分子的3′UTR的特殊序列有助于特殊蛋白質(zhì)的結(jié)合，增加或降低poly(A)縮短的速度；mRNA降解的另一個途徑始于特殊內(nèi)切酶的作用，可將poly(A)直接從mRNA分子上切除，這種切除也有賴于mRNA分子的3′UTR特殊序列可以被內(nèi)切酶識別。3′UTR還可通過與特定微小RNAs(microRNAs)相互作用，導致其mRNA降解或者翻譯抑制使mRNA及其相應基因無法表達而沉默。此外，一些轉(zhuǎn)錄抑制蛋白能識別特殊mRNA分子的3′UTR，通過干擾3′poly(A)尾與5′端帽的聯(lián)絡而減少翻譯的啟動。本研究結(jié)果顯示：在ERAP1基因3′UTR區(qū)的2個SNPs位點中，E20-816 C>T多態(tài)性位點與原發(fā)性高血壓有關(guān)聯(lián)，推測可能與ERAP1表達水平降低有關(guān)。

本研究首次在中國吉林漢族人群中探討E20-790G>A 和 E20-816C>T多態(tài)性位點與原發(fā)性高血壓的關(guān)聯(lián)性，但尚存在一定的局限性。首先，由于樣本量的限制，790G>A和816C>T多態(tài)性位點與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性不能進行深入的亞組分析；其次，檢測E20-790G>A 和 E20-816C>T位點各基因型間ERAP1基因的表達水平，分析不同基因型ERAP1表達水平的差異，可能幫助解釋ERAP1在高血壓患者中表達水平降低的原因；最后，原發(fā)性高血壓發(fā)病中ERAP1表達水平降低的作用機制需要借助細胞及動物模型深入探討。在后續(xù)的研究中，本課題組將著重研究ERAP1在E20-816C>T多態(tài)性位點不同基因型之間表達的差異，以及ERAP1表達水平降低在原發(fā)性高血壓發(fā)病機制中的作用，為原發(fā)性高血壓的基因診斷及個體化治療提供分子遺傳學依據(jù)。

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Association between single nucleotide polymorphisms in 3′UTR of ERAP1 gene and essential hypertension in Jilin Han population

YANG Sibao,LIU Xueyan,LI Bing,DING Mei,HE Yuquan,YANG Ping

(Department of Cardiology,China-Japan Union Hospital,Jilin University,Changchun 130033,China)

ObjectiveTo explore the expression levels of ERAP1 gene in the peripheral blood of the essential hypertension patients, and to identify the single nucleotide polymorphisms(SNPs) in 3′UTR of ERAP1 gene associated with essential hypertension. Methods300 patients with hypertension (hypertension group) and 233 normal controls (control group) were recruited to conduct a case-control study in Jilin Han population. The expression levels of ERAP1 in the peripheral blood of the objects were detected by ELISA method;the SNPs in 3′ UTR of ERAP1 gene were identified by pool-sequencing method;the genotyping was performed for each participant by PCR sequencing method. Results The expression levels of ERAP1 in the peripheral blood of the patients in hypertension group were significantly lower than those in control group (P<0.05). Two SNPs,E20-790G>A and E20-816C>T,were identified in 3′UTR of ERAP1 gene. The distribution of the genotypic and allelic frequencies of E20-816C>T polymorphism was significantly different between hypertension group and control group (P<0.05). The Logistic regression results showed that adjusting for the confounding factors,the genotypic frequency of CT gene in hypertension group was decreased significantly(P<0.05，OR=0.145，95% CI: 0.031-0.675). Conclusion E20-816C>T polymorphism may be related to essential hypertension in the Jilin Han population,and the decreasing genotypic frequency of CT gene may be related to the down-regulated expression of ERAP1.

essential hypertension;endoplasmic reticulum aminopeptidase 1;single nucleotide polymorphism;molecular genetics;association study

1671-587Ⅹ(2015)02-0383-06

10.13481/j.1671-587x.20150235

2014-09-25

國家自然科學基金資助課題(81270315)；吉林省科技廳重點科技攻關(guān)項目資助課題(20140204016SF)

楊四寶(1987-)，女，河北省滄州市人，在讀醫(yī)學博士，主要從事高血壓及心衰的表觀遺傳學方面的研究。

楊萍，教授，博士研究生導師(Tel：0431-84995091，E-mail：pyang@jlu.edu.cn)

R544.11

A