內皮祖細胞條件培養(yǎng)基對間充質干細胞增殖和成骨分化的影響及其機制

馮文磊，張　猛，徐芳潔，印雙紅，王艷杰，陳雪玲， 吳向未

(1. 石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普外科，新疆 石河子 832008；2. 石河子大學醫(yī)學院免疫學教研室，新疆 石河子 832002)

內皮祖細胞條件培養(yǎng)基對間充質干細胞增殖和成骨分化的影響及其機制

馮文磊1，張猛1，徐芳潔2，印雙紅2，王艷杰1，陳雪玲2， 吳向未1

(1. 石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普外科，新疆 石河子 832008；2. 石河子大學醫(yī)學院免疫學教研室，新疆 石河子 832002)

目的: 探討小鼠骨髓來源的內皮祖細胞(EPCs)條件培養(yǎng)基(CM) 對同源間充質干細胞(MSCs)增殖和成骨分化功能的影響，并闡明其作用機制。方法: 小鼠骨髓細胞經差速貼壁法結合專用培養(yǎng)基分別培養(yǎng)擴增MSCs和EPCs,采用流式細胞術(FCM)檢測MSCs和EPCs表面標記物,以成骨、成脂和成軟骨誘導分化對MSCs進行功能鑒定，以成血管對EPCs進行功能鑒定。將MSCs分為0% EPCs-CM組(對照組，采用LG-DMEM培養(yǎng))、50% EPCs-CM組(采用50% EPCs-CM+50% LG-DMEM培養(yǎng))和100% EPCs-CM 組(采用100% EPCs-CM培養(yǎng))。采用MTT比色法檢測各組MSCs的增殖活性；采用茜素紅染色檢測各組MSCs的成骨分化能力。結果: FCM法檢測，第3代MSCs高表達Sca-1、CD29， 低表達CD45、CD11b；經誘導可向成骨、成軟骨和成脂方向分化。第3代EPCs 高表達CD34、CD133和VEGFR2；在鋪有基質膠的96孔培養(yǎng)板中可形成血管樣結構。與對照組比較，50% EPCs-CM組和100% EPCs-CM組MSCs增殖活性明顯增加,且呈濃度依賴性(P<0.05)。茜草色素紅染色法檢測，培養(yǎng)21 d后50%和100% EPCs-CM組MSCs的鈣結節(jié)數量和鈣鹽沉積均高于對照組(P<0.05)。結論:利用差速貼壁法可同時分離MSCs和EPCs，EPCs-CM能促進MSCs 的增殖和成骨分化。

內皮祖細胞；間充質干細胞；條件培養(yǎng)基；細胞增殖；成骨分化

由創(chuàng)傷、感染、畸形矯正和腫瘤等各種因素造成的骨缺損，骨缺損不僅不易愈合，還因固定和制動易導致褥瘡、呼吸系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染及患肢廢用性萎縮等多種并發(fā)癥。傳統(tǒng)治療方法有自體松質骨移植和異體骨移植，但存在供骨區(qū)損傷、術后并發(fā)癥、來源有限和排斥反應等問題。組織工程骨是一種全新的治療方法，包含4個關鍵元素：具有骨傳導性的支架、釋放誘導成骨的生長因子、負載具有成骨潛能的細胞和組織工程骨血管化或充足的血供[1]。骨髓中至少存在3種干/祖細胞系統(tǒng)：間充質干細胞( mesenchymal stem cells，MSCs)系統(tǒng)、內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)系統(tǒng)和造血干細胞系統(tǒng)，并且相互之間存在密切聯(lián)系[2]。MSCs是中胚層來源的具有高度自我更新增殖能力和多向分化潛能的多能干細胞[4]，在特定條件下能分化為骨、軟骨和脂肪等多種組織細胞[4]。EPCs是一類能高度增殖、特異分化為血管內皮細胞、但尚未表達成熟的血管內皮細胞表型的祖細胞[5]。EPCs不僅參與胚胎期血管發(fā)生，也參與成體血管新生和內皮損傷后修復[6]。雖然人們早已認識到血管化在骨形成修復中的重要作用，但是成血管細胞促進骨再生修復的機制尚未完全明了。本研究旨在從細胞水平探討具成血管潛能的EPCs對具成骨潛能的MSCs的增殖和成骨能力的生物學影響，為闡明血管化與骨形成之間的生物耦聯(lián)機制提供依據。

1　材料與方法

1.1動物、主要試劑和儀器

4～6 周齡 C57B/L6 小鼠購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心,動物合格證號 ：SCXK(新)2011-0001)；胎牛血清、LG-DMEM培養(yǎng)基( Gilbco 公司,美國),PBS、 2.5 g·L-1胰蛋白酶 (HyClone 公司，美國),EGM2-MV培養(yǎng)基( Lonza公司,瑞士),青霉素和鏈霉素(SolarBio公司,中國),人纖連蛋白(BD公司，美國),MTT和DMSO(Sigma公司，美國),多聚甲醛固定液(賽馳生物科技公司，中國),成骨、成軟骨、成脂誘導培養(yǎng)基和茜素紅、阿利新藍、油紅O染料(Cyagen Biosciences公司,美國)，基質膠( BD Biosciences公司,美國),抗小鼠sca-1-FITC、CD29-APC、CD45-PerCP-Cy5.5、CD11b-PE、CD34-FITC、CD133-PE、VEGFR2-APC 和抗小鼠IgG 同型對照(eBioscience公司,美國),氯化十六烷基吡啶(Amresco公司，美國);細胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板(Coning公司,美國)，酶標儀(Bio-Rad公司，美國),熒光倒置相差顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(Leica公司,德國),流式細胞儀(BD公司，美國)。

1.2MSCs和EPCs分離培養(yǎng)

取1只4～6周齡C57B/L6小鼠,肝素化30 min后脫頸處死，75%酒精浸泡5 min，超凈臺中用已滅菌手術器械分離小鼠下肢，取股骨與脛骨并剔除干凈肌肉組織與筋膜，置于PBS中。轉入另一超凈臺，剪去長骨兩端骨骺,以5 mL注射器吸取含10% FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基換1 mL注射器針頭反復沖洗骨髓腔直至發(fā)白,沖出骨髓至60 mm培養(yǎng)皿中，吹打均勻放入37 ℃、體積分數為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng),48 h后輕輕晃動培養(yǎng)皿,換新鮮含10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)MSCs,同時收集離心未貼壁細胞,以EGM-2MV培養(yǎng)基在預先包被人纖連蛋白的60 mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng),2 d后吸除舊培養(yǎng)基和未貼壁細胞換新鮮EGM-2MV培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)來擴增EPCs。MSCs和EPCs培養(yǎng)基均每2 d換液1次。原代培養(yǎng)的MSCs與EPCs至80%～90%融合時皆按1∶2 傳代。

1.3流式細胞術檢測MSCs和EPCs的表面標記物

分別取處于對數生長期的第3代MSCs和EPCs，待細胞80%～90%融合時,2.5 g·L-1胰蛋白酶消化3～5 min，1 000 r·min-1離心5 min,棄上清，PBS清洗2次，PBS重懸細胞，吹打均勻調整細胞密度為1×106mL-1，分裝每管100 μL，分別加入直接熒光標記MSCs 抗小鼠sca-1-FITC、CD29-APC、CD45-PerCP-Cy5.5、CD11b-PE和直接熒光標記EPCs 抗小鼠CD34-FITC、CD133-PE、VEGFR2-APC。分別以IgG-FITC、IgG-APC、IgG-PerCP-Cy5.5和IgG-PE 為同型對照。 4℃ 孵育1 h，每 15 min 輕搖1次。1 000 r·min-1離心3 min，PBS洗去未標記上的抗體，10 g·L-1多聚甲醛固定10 min,流式細胞術檢測MSCs和EPCs的表面標記物表達。MSCs以高表達Sca-1和CD29、低表達CD45和CD11b為滿意結果；EPCs以均高表達CD34、CD133和VEGFR2為滿意結果。實驗重復3次。

1.4MSCs和EPCs的功能鑒定

1.4.1MSCs成骨誘導分化第2代細胞80%～90%融合時，胰酶消化3～5 min，1 000 r·min-1離心5 min，調整細胞密度以3×104cm-2在6孔板用成骨誘導分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3周,茜草色素紅染色后鏡下觀察鈣結節(jié)形成情況。以鈣結節(jié)被茜素紅染為紅色為陽性結果。

1.4.2MSCs成軟骨誘導分化第2代細胞 80%～90%融合時，胰酶消化3～5 min，1 000 r·min-1離心5 min,調整細胞密度以3×104cm-2在6孔板中用成軟骨誘導分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3周,阿利新藍染色后鏡下觀察，以細胞被阿利新藍染為藍色為陽性結果。

1.4.3MSCs成脂誘導分化第2代細胞 80%～90%融合時，胰酶消化3～5 min，1 000 r·min-1離心5 min，調整細胞密度以3×104cm-2在6孔板培養(yǎng)至100%鋪滿，成脂誘導分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d,換成LG-DMEM培養(yǎng)基，24 h換成誘導培養(yǎng)基，循環(huán)3～5次，最后LG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，油紅O染色后鏡下觀察脂滴形成情況，以脂滴被油紅O染為紅色為陽性結果。

1.4.4EPCs的體外成血管能力檢測在96孔板的每孔中鋪50 μL基質膠，消化第3代 EPCs，EGM-2MV培養(yǎng)基制成單細胞懸液，細胞計數，按每孔2×104個細胞接種于基質膠上，輕輕拍打，使細胞接種均勻。倒置顯微鏡觀察血管形成情況，以能形成血管樣結構為陽性結果。

1.5EPCs-CM 的制備

取經過鑒定后的第3～5代EPCs以1×105個細胞密度接種至60 mm培養(yǎng)皿中，待細胞達到80%～90%融合后換液時收集舊培養(yǎng)基,2 000 r·min-1離心 5 min,取上清液加入10% FBS即為 EPCs-CM。重復制備，直至足量。經 0.22 μm 濾膜過濾,貯存于-80 ℃ 冰箱中備用。

1.6MTT比色法檢測EPCs-CM培養(yǎng)MSCs增殖活性

取第2代MSCs，用含10%胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)基制備細胞懸液，以 5×104mL-1接種于96孔培養(yǎng)板內，每孔加入100 μL，培養(yǎng)12 h后，吸去培養(yǎng)基，加入含10%FBS及不同濃度(0、50%和100%)EPCs-CM的LG-DMEM 培養(yǎng)基100 μL，分別為0% EPCs-CM組(對照組)、50% EPCs-CM組和100% EPCs-CM組,每組設5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL MTT，培養(yǎng)4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩儀低速震蕩10 min,酶標儀檢測492 nm波長處的吸光度(A)值，表示各組MSCs增殖活性。各組設與實驗平行不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔。最后比色以空白孔A值調零。實驗重復3次。

1.7茜草色素紅染色和比色法檢測MSCs成骨能力

第2代細胞培養(yǎng)至80%～90%融合時，胰酶消化3～5 min，1 000 r·min-1離心5 min， 調整細胞密度以 3×104cm-2接種至6孔板中。對照組加2 mL誘導培養(yǎng)基，50% EPCs-CM組加1.5 mL誘導培養(yǎng)基再加0.5 mL EPCs-CM,100% EPCs-CM組加1 mL誘導培養(yǎng)基再加1 mL EPCs-CM,每組設3個復孔。誘導培養(yǎng)3周,茜草色素紅染色，鏡下觀察鈣結節(jié)形成情況并選取5 個視野( 中央和3、6、9、12 點位置)雙盲計數，每孔加入0.1 mol·L-1氯化十六烷基吡啶1 mL室溫反應20 min，震蕩儀低速震蕩10 min,酶標儀檢測570 nm波長處的A值，以A值表示MSCs成骨能力。最后比色以空白孔A值調零。實驗重復3次。

1.8統(tǒng)計學分析

2　結　果

2.1MSCs 和EPCs 的形態(tài)學

MSCs于48 h內貼壁，細胞形態(tài)不均一、異形性大，有成纖維樣細胞，也有大、小圓形細胞和多角形細胞；培養(yǎng)2 d時可見集落形成，沿集落周邊細胞迅速生長；培養(yǎng)約12 d時細胞鋪滿，以紡錘形樣細胞為主,經傳代培養(yǎng)后形態(tài)漸趨均一呈“漩渦”狀。見圖1A和B(插頁一)。48 h后細胞懸液離心，細胞沉淀重懸于纖維連結蛋白預包被的60 mm培養(yǎng)皿中；2 d后2次貼壁的EPCs開始伸展成梭形；約4 d時見細胞集落形成，集落中央為圓形細胞群，周邊有梭形細胞放射性生長；12 d時細胞可達到80%～90%融合，以類圓形和多角形細胞為主，晚期呈“鋪路石”狀。見圖1C和D(插頁一)。

2.2MSCs和EPCs的表面標記物表達陽性率

第3代MSCs高表達Sca-1和CD29,表達陽性率分別為(98.30±0.75)%和(97.47±1.32)%；低表達CD45和CD11b,表達陽性率分別為(1.87±0.15)%和(1.03±0.71)%。見圖2。

第3代EPCs均高表達CD34、CD133和VEGFR2，表達陽性率分別為(88.90±1.18)%，(92.73±2.90)%和(87.63±1.79)%。見圖3。

A-D: Homotype control;E-H: Surface marker;A,E: Sca-1;B,F: CD29;C,G: CD45;D,H: CD11b.

A-C:Homotype control;D-F:Surface marker;A,D:CD34;B,E:CD133;C,F:VEGFR2.

2.3MSCs和EPCs的功能鑒定

第3代MSCs 誘導分化成骨細胞，經成骨誘導后，形態(tài)由梭形變?yōu)椴灰?guī)則形，誘導14 d時可見散在分布小褐色結節(jié)，誘導21 d后結節(jié)中心的細胞逐漸融合失去細胞結構，鈣結節(jié)形成明顯，經茜草色素紅染色呈紅色結節(jié)(圖4A，見插頁一)。

第3代 MSCs 誘導分化成軟骨細胞，經成軟骨誘導后，細胞形態(tài)變化不大，誘導21 d后行阿利新藍染色，鏡下可見誘導分化形成的軟骨細胞胞核被染成深藍色，胞質染成淺藍色(圖4B，見插頁一)。

第3代MSCs誘導分化成脂肪細胞，細胞成脂誘導后，形態(tài)變不規(guī)則,部分細胞中有小脂滴形成，誘導21 d后融合成大脂滴，經油紅O 染色，脂滴被染成鮮紅色(圖4C，見插頁一)。

第3代 EPCs體外形成血管腔樣結構，鏡下觀察，2～5 h后 細胞變形拉長，6～9 h細胞遷移聚集，首尾相接，形成血管腔樣結構，10～12 h達到頂峰(圖4D，見插頁一)。

2.4MSCs的增殖情況

MTT比色法：隨著 EPCs-CM 濃度的增加，MSCs增殖活性逐漸增加。50%EPCs-CM 組和100% EPCs-CM 組MSCs的增殖活性(0.233±0.033和0.324±0.023)均高于對照組(0.157±0.020)(P<0.05或P<0.01)。

2.5MSCs經誘導后鈣離子沉積情況

鈣結節(jié)計數：與對照組(8.33±0.57)比較，50%EPCs-CM組和100%EPCs-CM組MSCs的平均鈣結節(jié)數(13.00±1.00和21.67±2.52)明顯增加(P<0.05或P<0.01 )。A570值檢測：與對照組(0.177±0.017)比較，50%EPCs-CM組和100%EPCs-CM組MSCs的A570值(0.254±0.029和0.33±0.021)明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見圖5(插頁一)。

3　討　論

1976 年Friedenstein 等[7]首次從骨髓中分離出MSCs，1997 年Asahara 等[8]首次從外周血中分離出EPCs,但隨后研究[9]證實EPCs源于骨髓。相較于其他組織來源，骨髓中的MSCs和EPCs更為豐富，且增殖能力更強[10]。本研究利用 MSCs與EPCs 差時貼壁的特性[11]從一份骨髓中一次性將2種細胞分離出來，此方法簡單易行，避免了分選和反復離心造成的細胞損傷和丟失，最大程度保存了MSCs和EPCs 生長所需的微環(huán)境，可使其保持旺盛的增殖能力。本研究結果表明：骨髓中的MSCs 貼壁時間較快,培養(yǎng)2～5 h 即可貼壁,而EPCs 貼壁較慢,實驗在貼壁培養(yǎng)48 h后收集未貼壁細胞，以專用培養(yǎng)基培養(yǎng),可以粗略地將MSCs和EPCs分離。但是差時貼壁的細胞成分仍較復雜,需多次傳代以逐漸提高細胞純度。

由于MSCs和EPCs 形態(tài)相近并且同一種細胞在不同階段形態(tài)并不一致，所以單從形態(tài)學方面不可能對這2種細胞進行鑒定，目前國內外普遍結合細胞表面標志物和細胞分化功能來鑒定。然而目前學術界對于MSCs和EPCs鑒定的表面標志物至今無統(tǒng)一標準，較為公認的MSCs表面標記物是高表達Sca-1、CD29、CD73、CD90、CD105和CD44，同時低表達或不表達CD45、CD11b和CD34等[4，12]。而研究者普遍認為EPCs高表達CD34、CD133和VEGFR2[13]，與此相對應，MSCs功能鑒定的金標準是其向成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞的分化潛能[4,14]；針對EPCs的功能鑒定是其能在基質膠上形成血管腔樣結構[14]。本研究結果顯示：MSCs高表達Sca-1和CD29，低表達CD45和CD11b，EPCs則高表達CD34、CD133和VEGFR2；功能鑒定結果顯示：MSCs可向成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞方向分化，EPCs可在基質膠上形成血管腔樣結構，具有MSCs和EPCs特性。

骨是高度血管化的組織，骨缺損導致血供破壞或中斷，所以不論是自體MSCs 的動員、歸巢還是體內MSCs 移植均有低氧或缺氧期。已有研究[15]顯示：缺氧可抑制或減弱MSCs的成骨分化能力。而EPCs 可分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質細胞衍生因子1 (stromal cell-derived factor,SDF-1)、 胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)[16]、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF )、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)[17]、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)[18]等多種生長因子，這些生長因子 對EPCs 本身的存活、增殖和分化有促進作用。體外培養(yǎng)的EPCs 通過旁分泌作用將細胞因子分泌到培養(yǎng)基中，檢測其旁分泌作用對MSCs的影響,最簡單的方法就是使用含 EPCs分泌物或代謝產物條件培養(yǎng)基作用于MSCs,觀察其對MSCs相關功能的影響。本實驗采用 MTT比色法檢測EPCs-CM 對MSCs 增殖影響的結果顯示：EPCs-CM可以促進MSCs的增殖并隨著EPCs-CM 濃度的增加，其促增殖作用更加明顯，呈現(xiàn)濃度依賴性。茜素紅染色是常規(guī)用于檢測MSCs鈣鹽沉積情況的染色方法，可將鈣鹽染成紅色。 氯化十六烷基吡啶能將鈣鹽結節(jié)溶解使鈣離子析出，從而可在酶標儀上定量檢測鈣鹽沉積情況。本研究采用成骨誘導后，茜素紅染色計數鈣結節(jié)數目，然后加氯化十六烷基吡啶溶解鈣結節(jié)，經酶標儀檢測其吸光度，以觀察EPCs-CM 對MSCs 成骨分化的影響，結果顯示：EPCs-CM可以促進MSCs向成骨方向分化，也呈一定的濃度依賴性。由此可見EPCs-CM含有的某種或某幾種生長因子或者其他的代謝產物促進了MSCs的存活增殖及向成骨方向分化。

骨缺損的修復再生是復雜而精細的體內過程。本研究采用含有生長因子和其他代謝產物的EPCs-CM探討其對MSCs 的增殖與成骨分化的影響。本文作者后續(xù)實驗將探討是何種細胞因子促增殖、促成骨能力最強或相互之間有無協(xié)同作用,如何組合協(xié)同作用更明顯；EPCs密度確定情況下分泌的細胞因子的量及用抗體阻斷后對MSCs增殖和成骨能力的影響；通過何種信號通路來調控增殖分化作用，信號通路之間有無連接點。本文作者期望未來將2種細胞聯(lián)合移植至組織工程骨中更好地促進骨的形成和血管化，使組織工程骨在骨缺損的臨床治療中發(fā)揮更大作用。

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Effects of endothelial progenitor cells conditioned medium on proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and their mechanisms

FENG Wenlei1， ZHANG Meng1， XU Fangjie2，YIN Shuanghong2，WANG Yanjie1，CHEN Xueling2， WU Xiangwei1

(1. Department of General Surgery，F(xiàn)irst Affiliated Hospital， College of Medical Sciences, Shihezi University，Shihezi 832008，China；2. Department of Immunology，College of Medical Sciences,Shihezi University，Shihezi 832002，China )

ObjectiveTo investigate the effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cells(EPCs) conditioned medium(EPCs-CM) on the proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells(MSCs),and to clarify the mechanisms.MethodsThe EPCs and MSCs were isolated from bone marrow of the mice using differential adhesion method.The surface markers of EPCs and MSCs were identified by flow cytometry (FCM).The osteogenic,chondrogenic,and adipogenic induction differentiation abilities of the MSCs were identified.The function of EPCs was identified by tube formation experiment.The MSCs were divided into 0% EPCs-CM group(control group,cultured with LG-DMEM),50% EPCs-CM group(cultured with 50% EPGs-CM and 50% LG-DMEM),and 100% EPCs-CM group(cultured with 100% EPCs-CM).The proliferation activities of the MSCs in various groups were detected by MTT method;the osteogenic differentiation abilities of the MSCs in various groups were detected by Alizarin red staining. ResultsThe FCM results showed that the third passage MSCs were strongly positive for Sca-1,CD29 and negative for CD45,CD11b and could be induced to complete differentiation process into osteoblasts and adipocytes and chondrocytes.The third passage EPCs cultured on Matrigel showed tube-like structures and highly expressed CD34,CD133 and VEGFR2.Compared with control group,the proliferation activities of the MSCs in 50% EPCs-CM group and 100% EPCs-CM group were increased(P<0.05),which presented a dose-dependent manner.The Alizarin red staining results showed the number of mineralized nodules and calcium deposition of the MSCs in 50% EPCs-CM group and 100% EPCs-CM group were higher than those in control group after cultured for 21 d(P<0.05).ConclusionThe method of differential adhesion can simultaneously isolate the MSCs and EPCs.EPCs-CM can promote the proliferation and osteogenic differentiation of the MSCs.

mesenchymal stem cells;endothelial progenitor cells;conditioned medium;cell proliferation;osteogenic differentiation

1671-587Ⅹ(2015)02-0218-07

10.13481/j.1671-587x.20150203

2014-08-19

國家自然科學基金資助課題(31271458)；人力資源和社會保障部留學回國人員科技活動項目資助課題(RSLX201201)；兵團科技援疆項目資助課題(2011AB034，2014AB047)

馮文磊(1987-)，男，河南省商丘市人，在讀醫(yī)學碩士,主要從事干細胞與再生醫(yī)學基礎方面的研究。

吳向未，教授，博士研究生導師(Tel:0993-2859449， E-mail：wxwshz@126.com)

R683

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