香菇多糖的化學修飾研究

梅光明，薛　彬，郝　強，李鐵軍（.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山　360；.北京海燕藥業(yè)有限公司，北京　006）

香菇多糖的化學修飾研究

梅光明1，薛彬1，郝強2，李鐵軍1
（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山316021；2.北京海燕藥業(yè)有限公司，北京102206）

利用硫酸酯化和羧甲基化對一種酸提香菇多糖SP2進行化學改性，并對反應(yīng)產(chǎn)物進行取代度計算，應(yīng)用紅外光譜儀和DSC掃描儀對改性產(chǎn)物進行表征。結(jié)果表明：硫酸酯化后香菇多糖SP2的取代度為0.87，回收率為88.6%；羧甲基化后香菇多糖SP2的取代度為0.47，回收率為83.6%；紅外光譜分析顯示改性產(chǎn)物均出現(xiàn)明顯的新特征吸收峰，表明SP2成功進行了硫酸酯化和羧甲基化改性；DSC掃描結(jié)果表明改性產(chǎn)物與香菇多糖SP2比較，硫酸酯化和羧甲基化改性物熱焓都發(fā)生改變，出現(xiàn)放熱峰，進一步證明硫酸基和羧甲基加到了糖鏈上。

香菇；多糖；化學修飾

多糖作為一類重要的免疫調(diào)節(jié)劑，具有良好的抗腫瘤、抗病毒等重要藥理活性。研究表明，多糖的生物活性與其一級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)、水溶性、粘度等多種因素有關(guān)。

一些多糖的活性與其中所含的某些化學基團有密切關(guān)系，如硫酸基、羥基和乙?；?。含有硫酸基的天然海藻多糖對抗HIV病毒已得到證實，并且抑制HIV的作用同分子中硫酸鹽的含量有關(guān)［1-3］。為了提高多糖的活性，開發(fā)多糖的新用途，對多糖的化學修飾研究已成為當前研究的一個新熱點。在對多糖的化學修飾中，最常見的為多糖的硫酸酯化，此外還包括羧甲基化、磷酸酯化、乙?；?、羥乙基化等。在天然多糖的分子中引入一定量的硫酸基等強極性基團，可改善水溶性，以便于進一步研究其生物活性。對香菇多糖進行硫酸酯化和羧甲基化，并進行紅外光譜、DSC研究［4-6］。

1　材料與方法

1.1主要材料與儀器

香菇多糖SP2、硫酸酯化多糖SP2、羧甲基化多糖SP2，小鼠腫瘤細胞株SP-2（本校分子醫(yī)學實驗室提供），人宮頸癌細胞株HeLa、人肝癌細胞株HepG2（武漢大學醫(yī)學院提供）。

1.2主要儀器

主要實驗儀器如下：AL204分析天平，上海梅特勒公司；pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；恒溫水浴鍋（HH-2），金壇市杰瑞爾電器有限公司；攪拌器，金壇市榮華儀器廠；傅立葉變換紅外光譜儀，Thermo Nicolet Nexus FT-IR，USA；DSC，DCS-Q10型，美國熱電公司。

1.3實驗方法

1.3.1香菇多糖的硫酸酯化

多糖的硫酸酯化的方法有：Wolfrom法、濃硫酸法、三乙胺—三氧化硫法等。本章研究選擇的是Wolfrom法［7］。

1.3.1.1酯化試劑的制備

無水吡啶置于圓底三口燒瓶中，經(jīng)冰鹽浴冷卻后，在攪拌下（無水吡啶：氯磺酸=1：2）將氯磺酸滴加入燒瓶中攪拌40 min。在此期間會出現(xiàn)淡黃色固體，反應(yīng)結(jié)束后，將酯化試劑于-20℃下封存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2硫酸化香菇多糖的制備

［8-11］的方法，取香菇多糖SP2溶于無水甲酰胺中，在室溫下攪拌30 min，再加入酯化試劑，在60℃的水浴中攪拌2 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入預(yù)冷的重蒸水稀釋溶液，再加入NaOH中和溶液，離心，流水透析3 d，再蒸餾水透析1 d，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，加入無水乙醇，置于4℃溫度下醇沉24 h，離心、冷凍干燥得到白色的硫酸酯化香菇多糖。

1.3.1.3標準曲線的繪制

取0.3 g明膠溶于100 mL蒸餾水中，再稱取1 g氯化鋇溶于上述明膠液中，4℃溫度保存，備用。

稱取0.1 g的Na2SO4溶于25 mL的蒸餾水中，分別取0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL的4 mg/mL Na2SO4分別與蒸餾水混合總體積為100 μL。分別加入3 mL的上述制備好的明膠液，振蕩后靜止15 min，測360 nm吸光值作出標準曲線。

標準曲線為：y=0.203 2 x-0.009 7，R2=0.999 1。

其中：y是樣品在360 nm處的吸光度，x為待測溶液的濃度（mg/mL）。

1.3.1.4硫酸基取代度的計算

取代度（DS）=（1.62×S%）/（32-1.02×S%）。其中：S%為樣品中S的百分含量。

1.3.1.5硫酸基含量的測定—氯化鋇-明膠比濁法

參考文獻［12-15］的方法，稱取30 mg硫酸酯化香菇多糖樣品，溶于3 mL濃度為1 mol/L HCl中，封管于安瓿瓶中，在100℃水解6 h，冷卻到室溫。取50 μL安瓿瓶中的糖水解液于試管中，再加入100 μL濃度為4 mol/L的三氯乙酸溶液和3 mL的明膠液，振蕩后靜止15 min，測360 nm的吸光值（對照管不加糖水解液，以50 μL的1 mol/L HCl代替）。

1.3.2香菇多糖的羧甲基化

參考文獻［15-17］的方法取香菇多糖SP2溶于2 mol/L NaOH溶液中，劇烈攪拌下加入氯乙酸，于60℃的水浴中攪拌4 h。冷卻到室溫，再加入預(yù)冷的冰醋酸中和pH=7.0，離心，流水透析3 d，再蒸餾水透析1 d，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，加入無水乙醇，置于4℃溫度下醇沉24 h，離心，冷凍干燥得到白色的羧甲基化香菇多糖。

羧甲基的測定 參考文獻［18-24］的方法取羧甲基多糖樣品，在100℃干燥1 h后轉(zhuǎn)入一錐形瓶中，加入3 mL 70%的甲醇，混合后放置3～5 min。在分別加入10 mL水，50 mL 0.5 moL/L的NaOH，混合后振蕩3～5 h，直至樣品溶解。然后用0.1 moL/L，鹽酸滴定，用酚酞顯示終點，計算每克羧甲基多糖所需的鹽酸的毫摩爾數(shù)（A）：

式中，V0：加入的NaOH的體積（mL）；V1：空白測定所消耗HCl的體積（mL）；V2：樣品測定所消耗HCl的體積（mL）；M0：加入的NaOH的濃度（moL/L），本實驗中為0.5 moL/L；M：測定所用HCl的濃度（moL/L），本實驗中為0.1 moL/L；W：測定所用樣品的質(zhì)量（g）。

羧甲基取代度（DS）按下式計算：

DS=0.162 A/1-0.058 A。

1.3.3紅外光譜分析

香菇多糖SP2經(jīng)過KBr壓片，上紅外光譜儀掃描分析，分辨率為4 cm-1，累加32次，掃描前扣除空氣背景，掃描范圍4 000～400 cm-1。

1.3.4DSC熱分析

稱取3～5 mg多糖，放置于鋁制小坩堝中壓緊后，在流速為45 mL/min的氮氣氣氛下，空鋁為參比，以10℃/min的升溫速率，從30～300℃范圍內(nèi)掃描。

2　結(jié)果與分析

2.1硫含量標準曲線

采氯化鋇-明膠比濁法測定硫含量，根據(jù)硫酸基標準曲線（圖1）得到回歸方程為：y=0.203 2 x-0.009 7，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 1。

其中：y是樣品在360 nm處的吸光值，x是待測液濃度（mg/mL）。

圖1　硫酸基標準曲線Fig.1　Standard curve of sulphate

2.2硫酸酯化測定

從硫酸基標準曲線查出對應(yīng)的濃度，換算成硫酸基的取代度，經(jīng)計算硫酸酯化后香菇多糖SP2的取代度為0.87，回收率為88.6%。

2.2.1紅外結(jié)果分析

對比圖2為香菇多糖SP2的紅外圖譜，從圖3可以看出，香菇多糖SP2硫酸酯在3 000～2 800 cm-1，1 400～1 200 cm-1范圍內(nèi)均有糖類化合物的特征吸收峰；在1 251.26 cm-1處出現(xiàn)了強的S=O不對稱振動吸收峰；在805.62 cm-1處出現(xiàn)C-O-S拉伸振動峰，證明硫酸基已經(jīng)與香菇多糖結(jié)合成酯。

圖2　香菇多糖SP2的紅外圖譜Fig.2　Infrared spectroscopy of SP2

圖3　Wolfrom法硫酸酯化香菇多糖SP2的紅外圖譜Fig.3　Infrared spectroscopy of sulfated SP2 by Wolfrom method

2.2.2香菇多糖SP2硫酸酯化熱分析

圖4　香菇多糖SP2的DSC圖譜Fig.4　DSC of lentinan SP2

圖5　硫酸酯化香菇多糖SP2的DSC圖譜Fig.5　DSC of sulfated SP2

由圖5顯示可知，硫酸酯化的香菇多糖SP2熱焓變化分成了三個階段，第一階段65.37～136.82℃為吸熱，焓變?yōu)?0.80 J/g；第二階段143.58～208.98℃為吸熱，焓變?yōu)?14.3 J/g；第三階段227.11～249.85℃為放熱，焓變?yōu)?3.68 J/g。和香菇多糖（圖4）相比較硫酸酯化的香菇多糖出現(xiàn)了放熱峰，說明可能有氧化還原反應(yīng)發(fā)生，表明硫酸基已經(jīng)與香菇多糖結(jié)合成酯。

2.3羧甲基化測定

經(jīng)計算羧甲基化后香菇多糖SP2的取代度為0.47，回收率為83.6%。

2.3.1紅外結(jié)果分析

羧甲基化香菇多糖SP2的紅外圖譜如圖6～7所示，與香菇多糖SP2的紅外圖譜如圖6-6相比較，羧甲基化香菇多糖在3431.58 cm-1處有O-H伸縮振動吸收峰；3 180.48 cm-1處有C-H伸縮振動吸收峰；1 400.67 cm-1處有C-H變角振動吸收峰；上述三處均有糖類化合物的特征吸收峰；在1 618.51 cm-1處出現(xiàn)了羧基C=O非對稱伸縮振動吸收峰；在1 331.33 cm-1處出現(xiàn)C=O對稱伸縮振動吸收峰；在1 451.25 cm-1處為甲基的C-H變角振動吸收峰，此四處峰證明香菇多糖中羧甲基已經(jīng)存在。

圖6　香菇多糖SP2的紅外圖譜Fig.6　Infrared spectroscopy of SP2

圖7　羧甲基化香菇多糖SP2的紅外圖譜Fig.7　Infrared spectroscopy of CM-SP2

2.3.2香菇多糖SP2羧甲基化熱分析

從圖9可以看出，羧甲基化的香菇多糖熱焓變化分成了兩個階段，第一階段59.33～193.70℃為吸熱，焓變?yōu)?70.7 J/g；第二階段281.36～306.27℃為放熱，焓變?yōu)?6.78 J/g。香菇多糖和羧甲基化香菇多糖的第一個吸熱峰，為脫去所帶的結(jié)合水。和香菇多糖（圖6-8）相比較羧甲基化的香菇多糖出現(xiàn)的第二個峰為放熱峰，表明香菇多糖結(jié)合上了其它的基團。

3　結(jié)論

1）經(jīng)過硫酸酯化后香菇多糖SP2的取代度為0.87，回收率為88.6%；羧甲基化后香菇多糖SP2的取代度為0.47，回收率為83.6%。

2）硫酸酯化后香菇多糖SP2經(jīng)過紅外光譜儀掃描，在1 251.26 cm-1處出現(xiàn)了強的S=O不對稱振動吸收峰；在805.62 cm-1處出現(xiàn)C-O-S拉伸振動峰，證明硫酸基已經(jīng)與香菇多糖SP2結(jié)合成酯。羧甲基化后香菇多糖SP2經(jīng)過紅外光譜儀掃描，在1 618.51 cm-1處出現(xiàn)了羧基C=O非對稱伸縮振動吸收峰；在1 331.33 cm-1處出現(xiàn)C=O對稱伸縮振動吸收峰；在1 451.25 cm-1處為甲基的C-H變角振動吸收峰，并且還存在糖鏈特征峰在3 431.58 cm-1處有O-H伸縮振動吸收峰；3 180.48 cm-1處有C-H伸縮振動吸收峰；1 400.67 cm-1處有C-H變角振動吸收峰；上述三處均為糖類化合物的特征吸收峰；證明香菇多糖SP2中羧甲基已經(jīng)存在。

圖8　香菇多糖SP2的DSC圖譜Fig.8　DSC of lentinan SP2

圖9　羧甲基化香菇多糖SP2的DSC圖譜Fig.9　DSC of CM-lentinan SP2

3）經(jīng)過DSC對硫酸酯化香菇多糖SP2和羧甲基化香菇多糖SP2的測定后，所出的結(jié)果和香菇多糖SP2相比較，硫酸酯化香菇多糖SP2和羧甲基化香菇多糖SP2都熱焓都發(fā)生了改變，并且都出現(xiàn)了放熱峰，可進一步證明硫酸基和羧甲基加到了糖鏈上。

參考文獻：

［1］MCCLURE M O，MOORE J P，BLANC D F，et al.Investigations into the mechanism by which sulfated polysaccharides inhibit HIV infection in vitro［J］.AIDS research and human retroviruses，1992，8（1）：19-26.

［2］INA K，KATAOKA T，ANDO T.The use of lentinan for treating gastric cancer［J］.Anti-cancer Agents in Medicinal Chemistry，2013，13（5）：681-688.

［3］ATTIA S M，HARISA G I，ABD-ALLAH A R，et al.The influence of lentinan on the capacity of repair of DNA damage and apoptosis induced by paclitaxel in mouse bone marrow cells［J］.Journal of Biochemical and Molecular Toxicology，2013，27（7）：370-377.

［4］ISODA N，EGUCHI Y，NUKAYA H，et al.Clinical efficacy of superfine dispersed lentinan（beta-1，3-glucan）in patients with hepatocellular carcinoma［J］.Hepatogastroenterology，2009，56（90）：437-441.

［5］BISEN P S，BAGHEL R K，SANODIYA B S，et al.Lentinus edodes：a macrofungus with pharmacological activities［J］.Current Medicinal Chemistry，2010，17（22）：2 419-2 430.

［6］CHIHARA G，MAEDA Y Y，HAMURO J，et al.Inhibition of mouse sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus edodes［J］. Nature，1969，222（5194）：687-688.

［7］UENO Y，CHINO K，WATANABE M，et al.Homolytic carbocyclization by use of a heterogeneous supported organotin catalyst. A new synthetic route to 2-alkoxytetrahydrofurans and gamma-butyrolactones［J］.J Am Chem Soc，1982，104（20）：5 564-5 566.

［8］申進文，馮雅嵐，莊慶利，等.香菇子實體多糖提取工藝優(yōu)化研究［J］.河南農(nóng)業(yè)科學，2010，41（3）：90-92.

［9］方積年.多糖的分離純化及其純度鑒別與分子量測定［J］.藥學通報，1984，19（10）：46-49.

［10］王順春，方積年.香菇多糖硫酸化衍生物的制備及生U結(jié)構(gòu)分析［J］.生物化學與生物物理學報，1999，31（5）：594-596.

［11］燕航，鐘耀廣，王淑琴，等.硫酸酯化香菇多糖衍生物制備的研究［J］.化學與生物工程，2006（3）：44-45.

［12］顏邦干，李衛(wèi)旗，吳學謙.香菇多糖的分子結(jié)構(gòu)及其硫酸酯化改性的研究［J］.中國食品學報，2006，6（5）：11-16.

［13］郭振環(huán)，胡元亮，馬霞.硫酸化香菇多糖對新城疫疫苗免疫效果的影響［J］.南京農(nóng)業(yè)大學學報，2010，33（1）：76-80.

［14］張惠芬，樊建，束嘉秀，等.硫酸—蒽酮分光光度法測定SPS的方法研究［J］.昆明理工大學學報，2002，27（3）：74-83.

［15］周林，郭祀遠，蔡妙顏，等.粘度法測定水溶液中裂褶多糖分子量［J］.功能高分子學報，2005，18（4）：692-695.

［16］張昕，張強，梁彥龍.香菇多糖的抗腫瘤和降糖作用機制的研究進展［J］.中國藥事，2008，22（2）：149-154.

［17］栗衍華，譚成玉，王秀武，等.硫酸化多糖的制備及其生物活性的研究進展［J］.精細與專用化學品，2006，14（16）：6-9.

［18］盧成英，李國章，黃早成，等.香菇多糖提取純化研究［J］.中國林副特產(chǎn)，2006（4）：24-27.

［19］田光輝.香菇多糖提取工藝的優(yōu)化［J］.延安大學學報：自然科學版，2002，21（1）：46-47.

［20］劉成梅，付桂明，游海，等.百合多糖的純化與化學結(jié)構(gòu)鑒定研究［J］.食品科學，2002，23（5）：114-117.

［21］高石花，黎國慶，覃江克，等.油茶枯多糖的水提工藝及純化研究［J］.食品科技，2013（4）：191-195.

［22］YANG W，PEI F，SHI Y，et al.Purification，characterization and anti-proliferation activity of polysaccharides from Flammulina velutipes［J］.Carbohydrate Polymers，2012，88（2）：474-480.

［23］BLUHM T L，SARKO A.The triple helical structure of lentinan，a linear β-（1→3）-D-glucan［J］.Canadian Journal of Chemistry，1977，55（2）：293-299.

［24］XU W T，ZHANG F F，LUO Y B，et al.Antioxidant activity of a water-soluble polysaccharide purified from Pteridium aquilinum［J］.Carbohydrate Research，2009，344（2）：217-222.

Chemical Modification and Biological Activity of Polysaccharide from Lentinus edodes

MEI Guang-ming1，XUE Bin1，HAO Qiang2，et al
（1.Marine Fishery Research Institute of Zhejiang Province，Zhoushan316100；
2.Beijing HaiYan Pharmaceutical CO Ltd，Beijing102206，China）

Sulfated derivative and carboxy methylation was used for chemical modification of Polysaccharide from Lentinus edodes（SP2）and the degree of substitution of its reaction products was calculated，furthermore modified product characterization was present by infrared spectrometer and DSC scanner.The results indicated that degree of substitution of the SP2 developed by Sulfated derivative was 0.87 and its the recovery rate reached 88.6%；meanwhile the two values by carboxy methylation were respectively 0.47 and 83.6%；infrared spectrometer showed a novel characteristic absorption peak of corresponding reaction products which means that sulfated derivative and carboxy methylation？has been successfully developed；comparison modified products with SP2 by DSC scanner，their enthalpies of modified products Sulfated derivative and carboxy methylation have been changed that represent either sulfate group or carboxymethyl has been joint in oligosaccharide chain.

Lentinus edodes；polysaccharides；chemical modification

R285

A

1008-830X（2015）04-0335-05

2014-12-20

浙江省省屬科研院所扶持專項（2012F20026）；浙海漁計［2011］123號

梅光明（1984-），男，湖北黃岡人，工程師，碩士，研究方向：食品加工與質(zhì)量安全控制.E-mail：meigm123@163.com