捕捉脅迫對暗紋東方鲀肝臟非特異性免疫指標(biāo)的影響

狄　瑜，徐　奕，李姍敏，聞海波，2（.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種與養(yǎng)殖生物學(xué)重點開放實驗室，江蘇無錫　2408；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫　2408）

捕捉脅迫對暗紋東方鲀肝臟非特異性免疫指標(biāo)的影響

狄瑜1，徐奕1，李姍敏1，聞海波1，2
（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種與養(yǎng)殖生物學(xué)重點開放實驗室，江蘇無錫214081；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫214081）

測定分析了暗紋東方鲀在持續(xù)、定量的捕捉脅迫條件下肝臟中非特異性免疫指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示：暗紋東方鲀肝臟溶菌酶和AKP活力在處理的第1 d顯著高于對照組水平（P＜0.05），在第2 d仍維持較高水平，第3 d酶活力顯著降低，并最終恢復(fù)至對照組水平（P＞0.05）；肝臟中抗氧化酶SOD活性與溶菌酶、AKP變化趨勢相似，而CAT活性在脅迫第1 d和第2 d逐步升高，至第3 d達到高峰并顯著高于前兩天和對照組（P＜0.05），第4 d顯著下降并恢復(fù)至對照組水平（P＞0.05）。研究結(jié)果表明：暗紋東方鲀在適度的捕捉脅迫下，肝臟的非特異性免疫功能在初期雖受到了顯著影響，但在后期能重新建立動態(tài)平衡，這可能是魚體對特定強度操作脅迫一種主動適應(yīng)。本結(jié)果將為暗紋東方鲀的康養(yǎng)殖管理提供一定的科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)。

暗紋東方鲀；捕捉脅迫；非特異性免疫

在現(xiàn)代化、集約型的水產(chǎn)養(yǎng)殖模式下，魚類的生存和生長將不可避免將會受到物理、化學(xué)、生物及管理因子應(yīng)激和脅迫［1］。國外，有關(guān)環(huán)境脅迫對魚類的代謝、免疫及生殖內(nèi)分泌等影響的研究報道較多，其主要涉及溫度［2］、水質(zhì)［3-4］、擁擠［5］等理化及生物因子。但隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化水平的提高，有關(guān)管理因子脅迫方面的研究也越來越受到漁業(yè)科研工作者的普遍關(guān)注。在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，運輸、拉網(wǎng)、捕捉、露空、排污等管理操作有可能使魚類產(chǎn)生脅迫和應(yīng)激反應(yīng)，從而影響其正常的呼吸、代謝、免疫及內(nèi)分泌等生理功能，機體內(nèi)主要表現(xiàn)為皮質(zhì)醇升高，血糖和乳酸升高等指標(biāo)變化；短期行為表現(xiàn)為躁動、狂游、食欲下降等現(xiàn)象，長期將影響魚類的成活和生長。研究表明：隨著魚類受到脅迫頻率的增加對其生長的影響也顯著增大［6］。目前，國內(nèi)已經(jīng)有學(xué)者研究了不同操作脅迫對大黃魚幼魚Pseudosciaena crocea［7］、圓口銅魚Coreius guichenoti［8］、云紋石斑魚Epinehelus moara［9］、刀鱭Coilia ectenes［10］等名優(yōu)養(yǎng)殖品種的生理、免疫功、神經(jīng)及內(nèi)分泌等機能的影響。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和集約化養(yǎng)殖程度不斷提高，定量分析和評估應(yīng)激因子對魚類免疫系統(tǒng)的影響，對魚類健康養(yǎng)殖和篩選減少魚類應(yīng)激反應(yīng)方法、藥物等均具有十分重要的指導(dǎo)意義。

暗紋東方鲀Takifugu obscurus俗稱河豚，隸屬于硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鱸形總目、鲀形目、鲀科、東方鲀屬，主要分布于渤海、東海、黃海及通海的江河中下游［11］，為江海洄游性魚類，是我國著名的“長江三鮮”之一。自2000年突破其人工繁育技術(shù)以來，暗紋東方鲀已成為我國重要名優(yōu)人工養(yǎng)殖品種之一。目前，關(guān)于其人工繁育、營養(yǎng)成分、生理等方面有較多研究報道，而有關(guān)捕捉操作脅迫對暗紋東方鲀非特異性免疫的影響研究尚未見報道。肝臟是暗紋東方鲀能量儲存、排毒和性腺發(fā)育相關(guān)重要器官，還是營養(yǎng)價值豐富的食用部位［12］。本文測定了捕捉脅迫下暗紋東方鲀肝臟組織中溶菌酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活力變化，探討持續(xù)、定量的捕捉脅迫對肝臟非特異性免疫指標(biāo)的影響，研究結(jié)果將為暗紋東方鲀的健康養(yǎng)殖管理提供相關(guān)依據(jù)和指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1實驗魚養(yǎng)殖

本研究所用暗紋東方鲀購自江蘇中洋基團河豚養(yǎng)殖廠，實驗前在10 t的水泥池中暫養(yǎng)1個月，投喂顆粒復(fù)合飼料。選擇健康、無傷的個體用于實驗。實驗暗紋東方鲀的規(guī)格為體重（38.12±5.23）g、全長（14.32±1.85）cm。

1.2實驗方法

實驗在3 t的PVE缸中進行，實驗用水為一級過濾海水。實驗期間水溫為22.3±0.5℃，每2日換水1次。每個缸隨機選取河豚60尾，脅迫實驗持續(xù)5 d。處理組每日定時用手抄網(wǎng)捕捉實驗魚并曝露在空氣中15 s，每組設(shè)置3個重復(fù)，將不進行驚擾處理的河豚作為對照組。

1.3非特異性免疫指標(biāo)的測定

分別在實驗第0、1、2、3、4和5 d進行取樣和酶活力，每個缸隨機取6尾，用丁香酚進行快速麻醉，解剖后取肝臟進行溶菌酶、AKP、SOD和CAT活力測定，試劑盒購自南京建成生物研究所，按照說明書所示方法進行操作。

1.4數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（M±SE）表示。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan法比較組間差異，當(dāng)P＜0.05時被認(rèn)為差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1捕捉脅迫對暗紋東方鲀?nèi)芫富盍Φ挠绊?/p>

在整個實驗過程中，各組均未有死亡現(xiàn)象。脅迫處理對暗紋東方鲀肝臟中溶菌酶活力影響顯著（圖1）。脅迫組暗紋東方鲀肝臟中的溶菌酶活力迅速增加，在處理的第1和第2 d顯著高于對照組水平（P＜0.05）；從第3 d起，溶菌酶活力開始降低并最終保持與對照組相似的水平。

2.2捕捉脅迫對暗紋東方鲀堿性磷酸酶活力的影響

脅迫處理對暗紋東方鲀肝臟中AKP活力的影響如圖2所示。處理后，肝臟中AKP活力也隨著處理時間的增加而迅速增高，在處理后第1和第2 d活力顯著高于對照組（P＜0.05）；第3 d AKP活力逐漸降低，第4 d后活力與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

2.3捕捉脅迫對暗紋東方鲀超氧化物歧化酶活力的影響

脅迫處理后暗紋東方鲀的SOD活力變化如圖3所示。結(jié)果表明，與AKP酶活力變化趨勢相似，在處理初期暗紋東方鲀肝臟SOD活力呈現(xiàn)增高的趨勢；并在處理后第1和第2 d顯著高于對照組（P＜0.05），之后，逐漸降低并恢復(fù)至對照組水平。

2.4捕捉脅迫對暗紋東方鲀過氧化氫酶活力的影響

脅迫后暗紋東方鲀CAT活力的變化如圖4所示。在脅迫處理組中，肝臟中CAT活力隨著處理時間的增長而逐漸增高，并在處理后第3 d達到最高峰，其酶活力顯著高于對照組（P＜0.05）；第4 d酶活力迅速下降并保持與對照組相似的水平（P＞0.05）。

圖1　捕捉脅迫下暗紋東方鲀的溶菌酶活力變化Fig.1　Variation of lysozyme activity in T.obscures by handling stress treatment

圖2　捕捉脅迫下暗紋東方鲀的堿性磷酸酶活力變化Fig.2　Variation of AKP activity in T. obscures by handling stress treatment

圖3　捕捉脅迫下暗紋東方鲀的SOD活力變化Fig.3　Variation of SOD activity in T. obscures by handling stress treatment

圖4　捕捉脅迫下暗紋東方鲀的CAT活力變化Fig.4　Variation of CAT activity in T.obscures by handling stress treatment

3　討論

3.1捕捉脅迫對暗紋東方鲀?nèi)芫负蛪A性磷酸酶活性的影響

溶菌酶是魚體非特異性免疫的第一道防線，也是研究的最多的體液免疫因子之一，它主要由嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，在粘液、血液和一些淋巴組織中廣泛分布。堿性磷酸酶（AKP）是一種多功能水解酶，直接參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移和鈣代謝，在骨生成及滲透調(diào)節(jié)中具有重要作用［13-14］，它也是動物溶酶體的重要組成部分，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用［15］。

已有的研究表明：擁擠和操作脅迫能使魚體免疫器官受損，抑制其細(xì)胞免疫和體液免疫功能，進而導(dǎo)致使機體抗病力下降；但魚體對穩(wěn)定的慢性脅迫環(huán)境有一定適應(yīng)能力［16］。草魚在慢性脅迫處理后溶菌酶活性先出現(xiàn)升高，達到峰值后逐漸下降，呈倒“U”型曲線，其血清殺菌活性隨放養(yǎng)密度增加而大幅下降［17］；圓口銅魚的血液和頭腎AKP活性在操作應(yīng)激前后各組間差異不顯著［8］；而鯽魚在長期擁擠脅迫條件下，高密度組的血液噬菌細(xì)胞活性一直維持在較低水平，且攻毒試驗的死亡率顯著下降［18］。本研究發(fā)現(xiàn)在捕捉脅迫處理后暗紋東方鲀肝臟中溶菌酶和堿性磷酸酶的活力逐漸增加，分別在第1 d就達到最高峰，之后逐漸降低，并最終恢復(fù)至對照組水平。推測暗紋東方鲀在受到該強度的捕捉脅迫后，機體處于急性應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致魚體耗氧率升高、對能量的需求增加、代謝加速，在脅迫后短期內(nèi)溶菌酶和堿性磷酸酶活性的升高將有助于提高魚體代謝和能量供給，增加魚體免疫力。

此外，邊平江等［19］研究表明：低于12的鹽度脅迫使暗紋東方鲀脾臟的溶菌酶和堿性磷酸酶顯著升高，而后逐步降低恢復(fù)至對照組水平，對魚體生長和存活無顯著影響；在鹽度高于18脅迫條件下，2種酶在第5 d達到最高，后降低并顯著低于對照組水平，魚體生長和存活也顯著下降。這也表明無論是何種脅迫和應(yīng)激，脅迫的程度高低對暗紋東方鲀的影響大小均存在較大的差異。本研究僅測定了部分免疫指標(biāo)在捕捉脅迫下的變化，而對魚體后期生長和存活未進行跟蹤測定，該指標(biāo)對暗紋東方鲀的健康科學(xué)養(yǎng)殖管理具有指導(dǎo)價值。

3.2捕捉脅迫對暗紋東方鲀肝臟抗氧化酶的影響

魚類進行正常的新陳代謝活動時會產(chǎn)生自由基，是正常代謝活動的副產(chǎn)物，在通常情況下，機體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和抗氧化過程處于動態(tài)平衡中。當(dāng)魚體受到過度的應(yīng)激和脅迫時，體內(nèi)自由基會迅速增加并積累，而又大大超過機體清除能力，就會對體內(nèi)的脂類、蛋白質(zhì)和DNA造成損傷［20］，從而導(dǎo)致魚體生長發(fā)育遲緩、抗病力下降等影響。魚體抗氧化能力主要涉及SOD、CAT等酶類，其中SOD是超氧陰離子自由基（O2-）的清除劑，CAT能將過氧化氫（H2O2）轉(zhuǎn)變?yōu)樗?1］，它們能有效清除自由基體內(nèi)的活性氧使細(xì)胞免受氧化損傷，在機體抗氧化及抵御應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

不同類型的應(yīng)激因子對不同魚類、不同組織及不同抗氧化酶種類的影響均存在顯著差異。尹飛等［22］研究表明：低鹽度脅迫對銀鯧幼魚肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）活力表現(xiàn)出先升后顯著下降，在處理120 h 后CAT活力酶活力均顯著低于對照組；李茜［8］對圓口銅魚頭腎和血液中抗氧化酶活性在操作脅迫后變化分析發(fā)現(xiàn)，CAT在頭腎組織和血液中變化明顯，而頭腎、血液AKP活性對操作脅迫反應(yīng)不敏感。本研究結(jié)果表明：暗紋東方鲀在應(yīng)激初期，肝臟中兩種抗氧化酶均顯著高于未脅迫組，但隨著魚體對捕捉操作的逐步適應(yīng)，SOD和CAT分別在脅迫處理的第3 d、第4 d恢復(fù)至對照組水平，表明其抗氧化系統(tǒng)重新建立了平衡，這與孫鵬等［9］對云紋石斑魚在操作脅迫后肝臟SOD和CAT的影響結(jié)果一致。邊江平等［19］研究表明：同等規(guī)格的暗紋東方鲀在鹽度高于18的化學(xué)因子脅迫下，SOD和CAT活力也呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，并最終保持與對照組相似的水平，但魚體成活和生長顯著低于對照組。MCCORMICK等［6］研究表明大西洋鮭在反復(fù)捕捉刺激下，生長率顯著低于對照組。翁朝紅等［7］對大黃魚幼魚的研究表明：長期的劇烈操作脅迫嚴(yán)重影響魚體肝脾臟功能和機體免疫機能，肝臟的合成代謝也受到抑制，并顯著抑制生長。本捕捉操作脅迫強度下雖然暗紋東方鲀的抗氧化能力得到重新恢復(fù)，但是否會對后期的生長發(fā)育及抗病產(chǎn)生影響仍需做進一步的研究。

在現(xiàn)代化、集約型的水產(chǎn)養(yǎng)殖模式下，養(yǎng)殖魚類將不可避免會受到物理、化學(xué)、生物及管理因子應(yīng)激。適度的應(yīng)激和脅迫對增加魚類的抗應(yīng)激能力和抗病力具有積極作用，而過度的應(yīng)激將導(dǎo)致生長發(fā)育遲緩、抵抗力下降，甚至死亡。因此，需要我們在漁業(yè)生產(chǎn)的每個環(huán)節(jié)制定合理的生產(chǎn)計劃與操作規(guī)范，將操作應(yīng)激控制在魚類能承受的合理范圍內(nèi)是現(xiàn)代漁業(yè)健康養(yǎng)殖管理中值得深入研究的課題之一。

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Effects of Capture Stress on Non-specific Immune Parameters in Liver of Obscure Puffer Takifugu obscures

DI Yu，XU Yi，LI Shan-min，et al
（Key Laboratory of Genetic Breeding and Aquaculture Biology of Freshwater Fishes，Ministry of Agriculture，F(xiàn)reshwater Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuxi214081，China）

In the present study，enzyme activities of lysozyme，alkline phosphatase（AKP），superoxide dismutase（SOD）and catalase（CAT）were analyzed to evaluate the effects of handling stress on non-specific immune parameters in liver of Obscure puffer Takifugu obscures.After capture stress，activities of lysozyme，AKP and SOD increased rapidly and peaked at the first two days，and then dropped to the level of control groups （P＜0.05）.CAT activities in treated groups also increased and peaked at the third day after treatment，then，its levels dropped to the levels of control groups（P＞0.05）.The results indicate that stress treatment would damage fish body by oxidate response，and non-specific immune system plays important role in stress response.The present study provides scientific information to healthy aquaculture and control of water quality in this species.

Takifugu obscures；capture stress；non-specific immunity

S917

A

1008-830X（2015）04-0314-04

2015-03-10

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項（2013JBFR07）

狄瑜（1984-），女，江蘇溧陽人，助理研究員，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖.E-mail：diy@ffrc.cn通訊作者：聞海波.E-mail：wenhb@ffrc.cn