乳巖內消霜外用對大鼠乳腺癌癌前病變組織VEGF、FGF2表達的影響

梁世杰，　張桂娟，　馬　民，　別鳳杰，　廖　銳，　陳瑞雪，顏顯欣，　呂燕紅，　黃茂杰，　周詩敏（暨南大學　.醫(yī)學院　中醫(yī)系；.附屬第一醫(yī)院校門診部，廣東　廣州　5063）

乳巖內消霜外用對大鼠乳腺癌癌前病變組織VEGF、FGF2表達的影響

梁世杰1，張桂娟2，馬民1，別鳳杰1，廖銳1，陳瑞雪1，顏顯欣1，呂燕紅1，黃茂杰1，周詩敏1
（暨南大學1.醫(yī)學院中醫(yī)系；2.附屬第一醫(yī)院校門診部，廣東廣州510632）

目的：觀察乳巖內消霜外用對大鼠乳腺癌癌前病變模型乳腺組織中血管內皮生長因子（VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（FGF2）表達的影響，探尋乳巖內消霜治療乳腺癌癌前病變的機制.方法：36只雌性未孕SD大鼠，隨機分為空白對照組、疾病模型組、三苯氧胺組及乳巖內消霜質量分數分別為4 000、2 000、1 000 mg/g組.采用二甲基苯并瞆（DMBA）聯合雌、孕激素誘導癌前病變大鼠模型，對乳房外用藥物干預，第10周處死動物，進行組織病理學檢測，Western blotting及免疫組化法檢測乳腺組織中VEGF、FGF2的表達.結果：各藥物干預組乳腺組織VEGF、FGF2的表達均明顯低于疾病模型組（P＜0.05）；Western blotting檢測乳巖內消霜質量分數4 000 mg/g組VEGF表達低于乳巖內消霜質量分數2 000和1 000 mg/g組（P＜0.05）；免疫組化檢測乳巖內消霜質量分數4 000 mg/g組FGF2表達低于乳巖內消霜質量分數1 000 mg/g組（P＜0.05）.結論：乳巖內消霜外用能夠有效下調VEGF、FGF2在乳腺癌癌前病變大鼠乳腺組織中的表達，可能通過抑制血管生成因子表達而防治乳腺癌的有效機制，具有量效關系.

乳腺癌癌前病變；乳巖內消霜；血管內皮生長因子；堿性成纖維細胞生長因子

乳腺癌是中老年婦女最常見的惡性腫瘤之一，在中國的發(fā)病率已高出世界平均水平1%～2%，隨著乳腺癌發(fā)病率增加，乳腺癌死亡率也在快速上升［1－2］.乳腺癌遵循多階段發(fā)展模式，癌前病變是乳腺癌發(fā)生的必經階段，原位癌之前可逆，乳腺癌癌前病變階段惡變的概率明顯高于一般增生階段，惡變的概率與非典型增生的程度呈正相關關系［3－4］.在癌前病變階段進行及時、有效的干預，能降低乳腺癌的發(fā)病率和死亡率.腫瘤發(fā)生、生長和轉移依賴血管新生，抑制血管生成，能阻斷腫瘤進展［5］.VEGF、FGF2是作用最強的血管生成因子，在乳腺癌及癌前病變組織中均表達上調，且有協同促血管生成的作用［6－9］.本研究為探討乳巖內消霜對乳腺癌癌前病變組織血管生成的影響，為其防治乳腺癌提供實驗依據.

1　材料與方法

1.1材料

（1）實驗動物SPF級雌性未孕SD大鼠36只，體質量（200±20）g，廣東省實驗動物中心提供，質量許可證號為SCXK（粵）2013－0002，實驗動物使用許可證號為SYXK（粵）2012－0117，實驗動物倫理受理證明號為20140226001.統一室溫，自由進食、飲水常規(guī)飼養(yǎng)1周，脫去第2、3對乳房周圍直徑1 cm處體毛，開始實驗.

（2）主要藥品和試劑DMBA購自東京化成工業(yè)株式會社，0.7 g DMBA溶于100 mL芝麻油，質量濃度7 mg/mL；三苯氧胺購自武漢馳飛化工有限公司；VEGF鼠單克隆抗體購自英國Abcam公司；FGF2鼠單克隆抗體購自美國SantaCruz公司；SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；蘇木素、伊紅等.空白對照藥物基質（乳巖內消霜除去藥物外的成分）：氫氧化鉀7 g溶于適量蒸餾水，硬脂酸140 g水浴熔融加入氫氧化鉀溶液和甘油，總量1 kg.乳巖內消霜：乳巖內消霜有丁香、延胡索、大黃等藥物組成，將中藥按一定制劑工藝制成霜劑，4℃保存.三苯氧胺軟膏：三苯氧胺0.5 g溶于14 mL丙二醇；48.6 g聚乙二醇4000與36.4 g聚乙二醇400水浴熔融混合，攪拌加入丙二醇溶液混勻，4℃保存.

1.2方法

（1）造模方法DMBA按質量分數為70 mg/kg一次性灌胃.第2天起，以5天為1周期，第1～3天，每天按質量分數為0.5 mg/kg于后腿內側肌肉注射苯甲酸雌二醇；第4天，按質量分數為4 mg/kg于后腿內側肌肉注射黃體酮；第5天觀察，連續(xù)12個周期.

（2）分組給藥方法空白對照組：生理鹽水按質量分數為70 mg/kg一次性灌胃.第2天起，以5天為1個周期，第1～4天，于后腿內側肌肉注射生理鹽水，第5天觀察，連續(xù)12個周期；灌胃第2天起，乳腺處涂抹空白對照藥物基質0.2 g/只，1次/d.疾病模型組：造模，灌胃第2天起，乳腺處涂抹空白對照藥物基質0.2 g/只，1次/d.三苯氧胺組：造模，灌胃第2天起，乳腺處涂抹三苯氧胺軟膏0.2 g/只，1次/d.乳巖內消霜質量分數分別為4 000、2 000、1 000 mg/g組：造模，灌胃第2天起，乳腺處分別涂抹質量分數分別為4 000、2 000、1 000 mg/g乳巖內消霜0.2 g/只，1次/d.各組大鼠涂抹藥物后均按摩每只乳房1 min，常規(guī)飼養(yǎng).

（3）觀察指標

1）大鼠乳腺組織病理學觀察各組第2、3對乳房部分組織，體積分數為10%甲醛固定，常規(guī)梯度酒精脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，4 μm厚度，HE染色.大鼠乳腺組織病理學分級標準參照2003年WHO腫瘤分類［10］.

2）Western blotting檢測大鼠乳腺組織VEGF、FGF2蛋白表達選取第2、3對乳房部分組織，勻漿，按BestBio總蛋白提取試劑盒說明提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，按每孔30 μg蛋白量進行SDS-PAGE凝膠電泳，半干式轉印法轉移蛋白至PVDF膜，體積分數為5%BSA的TBST溶液中封閉，分別孵育一抗、二抗，TBST洗膜，ECL化學發(fā)光，X光片顯影，采用ImageJ軟件進行蛋白條帶灰度定量分析.

3）免疫組化法檢測大鼠乳腺組織VEGF、FGF2蛋白表達選取第2、3對乳房部分組織，體積分數為10%甲醛固定，常規(guī)梯度酒精脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，4 μm厚度，按SP試劑盒及DAB試劑盒說明書進行操作.VEGF、FGF2以細胞漿呈現棕黃色顆粒為陽性.200倍顯微鏡下隨機選取5個區(qū)域，使用圖像分析系統測定平均光密度值.

1.3統計學方法

計量資料以（均數±標準差）（珋x±s）表示.采用SPSS 17.0進行統計學分析，完全隨機多樣本比較用多個獨立樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗；兩樣本比較采用兩個獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗.

2　結果

2.1大鼠乳腺組織病理學觀察

經多樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗，2＝213.604，P＝0.000，按 α＝0.05水準，提示各組大鼠乳腺組織增生程度有差，其中疾病模型組增生程度最重（平均秩＝276.27）.經兩個獨立樣本比較的Wilcoxn檢驗，疾病模型組增生程度較空白對照組高（P≤0.01）；三苯氧胺組、乳巖內消霜質量分數為4 000和2 000 mg/g組增生程度較疾病模型組低（P＜0.05表1，圖1）.

表1　大鼠乳腺組織增生程度Table 1　The degree of hyperplasia of mammary glands in rats

圖1　各組大鼠乳腺組織病理學結果（×200）Fig.1　Morphology of rat mammary tissue pathology（×200）

2.2Western blotting檢測VEGF、FGF2在乳腺組織中的表達

VEGF、FGF2在正常乳腺組織中低表達，疾病模型組VEGF、FGF2表達顯著升高（P≤0.01）.藥物干預后，各干預組能下調VEGF蛋白的表達（P＜0.05），乳巖內消霜質量分數4 000 mg/g組下調VEGF表達效果優(yōu)于質量分數為2 000和1 000 mg/g組（P＜0.05）；乳巖內消霜質量分數4 000 mg/g組能夠下調FGF2蛋白表達（P＜0.05，圖2）.

2.3免疫組化法檢測VEGF、FGF2在乳腺組織中的表達

VEGF、FGF2在正常對照組表達量低，誘導乳腺癌癌前病變模型后表達顯著升高（P＜0.05）；經藥物干預后，各干預組能下調乳腺組織中VEGF、FGF2表達（P＜0.05）.乳巖內消霜質量分數4 000 mg/g組下調FGF2表達效果優(yōu)于質量分數1 000 mg/g組（表2，圖3、4）.

圖2　VEGF、FGF2在各組乳腺組織蛋白表達條帶Fig.2　The expression of VEGF and FGF2 analyzed by Westernblotting

表2　大鼠乳腺組織VEGF、FGF2平均光密度結果Table 2　The average optical of VEGF and FGF2　±s）

表2　大鼠乳腺組織VEGF、FGF2平均光密度結果Table 2　The average optical of VEGF and FGF2　±s）

與空白對照組相比較，1）P＜0.05，與疾病模型組相比較，2）P＜0.05，與乳巖內消霜質量分數4 000 mg/g組相比較，3）P＜0.05.

組別　n/例　乳房數　平均光密度VEGF　FGF2空白對照組624　0.058±0.017　0.049±0.016疾病模型組　6　24　0.172±0.0251）　0.132±0.0271）三苯氧胺組　6　24　0.112±0.0332）　0.067±0.0222）乳巖內消霜質量分數4 000 mg/g組　6　24　0.108±0.0192）　0.061±0.0122）乳巖內消霜質量分數2 000 mg/g組　6　24　0.094±0.0152）　0.064±0.0092）乳巖內消霜質量分數1 000 mg/g組　6　24　0.112±0.0152）　0.078±0.0352），3）

圖3　VEGF在各組大鼠乳腺組織中的表達（×200）Fig.3　The expression of VEGF analyzed by IHC（×200）

圖4　FG2F在各組大鼠乳腺組織中的表達（×200）Fig.4　The expression of FGF2 analyzed by IHC（×200）

3　討論

WHO規(guī)定：疾病發(fā)展為癌腫的可能性超過20%，即可認為是癌前病變［11］，但由于乳腺疾病惡變的幾率不能準確把握，臨床上一般將乳腺的非典型增生和原位癌歸為乳腺癌癌前病變.研究證實乳腺增生程度與乳腺血液粘稠度和乳腺微循環(huán)障礙呈正相關［12］.本課題組前期研究表明，乳巖內消霜外用能有效改善大鼠乳房微循環(huán)和腫瘤組織局部的缺氧狀態(tài)，抑制腫瘤細胞的生長，能改善腫瘤高凝、高粘狀態(tài)［13］.本實驗通過對乳腺組織的病理學觀察，疾病模型組大鼠乳腺均出現不同程度的增生，以非典型增生為主，與正常對照組比較有顯著性差異，說明DMBA聯合雌、孕激素能成功復制乳腺癌癌前病變模型.乳巖內消霜外用干預后，與疾病模型組比較，乳腺小葉增生程度、上皮細胞數量，腺泡數目、腺腔內分泌物均不同程度降低，說明乳巖內消霜能夠減緩乳腺組織的增生性病變，能阻斷抑制乳腺癌癌前病變.

乳腺癌是血管依賴性腫瘤，在實體腫瘤發(fā)生前的非典型增生階段，已有血管生成開關開啟，在中、重度非典型增生及原位癌階段，血管生成明顯增多［14－15］.VEGF、FGF2是促血管生成作用較強、特異性較高的血管生成因子，在乳腺癌癌前病變階段均表達上調，病變細胞通過分泌VEGF、FGF2刺激病變區(qū)域血管內皮細胞增殖、遷移，增加血管通透性，誘導血管新生，有利于腫瘤生長和轉移；抑制VEGF、FGF2的表達，能阻斷腫瘤血管生成，防止乳腺癌癌前病變轉變成乳腺癌［16］.有研究表明，通過抑制VEGF、FGF2的表達能夠減少乳腺癌前病變大鼠乳腺組織血管生成，從而有效對抗大鼠乳腺癌癌前病變［17］.本實驗用乳巖內消霜干預癌前病變大鼠模型VEGF、FGF2的表達，結果表明VEGF、FGF2在正常乳腺組織中低表達，誘導癌前病變模型后，兩者表達顯著增高；經藥物干預能下調VEGF、FGF2在大鼠乳腺組織中的表達；乳巖內消霜質量分數4 000 mg/g組下調VEGF表達效果優(yōu)于乳巖內消霜質量分數為2 000和1 000 mg/g組，下調FGF2表達效果優(yōu)于質量分數1 000 mg/g組，說明乳巖內消霜外用具有一定的量效關系.

綜上，乳巖內消霜能改善乳腺癌癌前病變大鼠乳腺組織增生，下調乳腺組織中VEGF、FGF2蛋白的表達，可能是通過抑制血管生成因子表達，阻斷血管生成，防治乳腺癌的有效機制.

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［責任編輯：朱穎?］

Effect of topical Ruyanneixiao cream for VEGF and FGF2 expression in rat breast with mammary precancerous lesions

LIANG Shijie1，ZHANG Guijuan2，MA Min1，BIE Fengjie1，LIAO Rui1，CHEN Ruixue1，YAN Xianxin1，Lü Yanhong1，HUANG Maojie1，ZHOU Shimin1
（1.Department of Traditional Chinese Medicine，Medical College；2.Department of School Clinic，the First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Aim：To explore the Ruyanneixiao cream mechanism of prevention and treatment on pre-cancerous lesions of breast cancer by measuring the expression of VEGF and FGF2.Methods：Totally 36 female SD rats were randomly divided into 6 groups：normal control group，disease group，TAM group and the high，middle and low dose group of Ruyanneixiao cream，6 rats in each group.To establish the model of precancerous lesions of breast cancer in rats by using DMBA combined with estrogen and proges-terone.The rats were intervened by drugs for 10 weeks.Finally，to observe the pathological changes ofrat mammary tissue，and the expression of VEGF and FGF2 measured by Western blotting and immuno-histochemistry（IHC）.Results：The expression of VEGF and FGF2 of drug intervention group was signif-icantly lower than the disease group（P＜0.05）.The expression of VEGF of high group were significantly lower than the middle and low group measured by Western blotting（P＜0.05）.The expression of VEGF of high group were significantly lower than the low group measured by IHC（P＜0.05）.Conclusion：The Ruyanneixiao cream can intervene the progression of the model of precancerous lesions of breast cancer by decreased the expression of VEGF and FGF2，which could be the effective mechanism to inhibits angio-genesis and prevent the breast cancer.The Ruyanneixiao cream has a certain dose-effect relationship.

mammary precancerous disease；Ruyanneixiao cream；VEGF；FGF2

R285.5

A

1000－9965（2015）06－0484－06

10.11778/j.jdxb.2015.06.008

2015－05－12

國家自然科學基金項目（81473688；81173265）；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目（NCET－13－0827）；廣東省中醫(yī)藥局項目（20141070）；廣州市科技支撐計劃項目（2014J4100104）；廣東省科技計劃項目（2014A020212672）；2015年暨南大學科研培育與創(chuàng)新基金（21615464）；暨南大學2015年度國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201510559046）

梁世杰（1987－），男，研究方向：中西醫(yī)結合臨床研究

馬民（1973－），男，教授，醫(yī)學博士，博士生導師，Tel：020－85228091；E-mali：1019312292＠qq.com