miRNA-373在非小細胞型肺癌中的表達及其臨床意義

劉碧翠，　楊　華，　方詩容，　梅永添，　向　薇（湖北民族學院　附屬民大醫(yī)院　呼吸內(nèi)科，湖北　恩施　445000）

miRNA-373在非小細胞型肺癌中的表達及其臨床意義

劉碧翠，楊華，方詩容，梅永添，向薇
（湖北民族學院附屬民大醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北恩施445000）

目的：探討非小細胞型肺癌石蠟包埋組織中miR-373的表達與臨床病理因素之間的關(guān)系，及其在預測非小細胞型肺癌患者預后中的作用.方法：用微陣列芯片法和qRT-PCR檢測非小細胞型肺癌石蠟包埋組織和癌旁組織中的miR-373表達.采用Kaplan-Meier法分析非小細胞型肺癌患者總生存期和無病生存期.結(jié)果：在原發(fā)非小細胞型肺癌中miR-373的表達下調(diào)，并用qRT-PCR進一步驗證.另外，miR-373低表達與病理組織類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、血管浸潤、復發(fā)時間和生存時間（OS）（P＜0.05）顯著性相關(guān).Kaplan-Meier分析結(jié)果表明，miR-373低表達與高表達患者OS和無病生存期（DFS）（P＜0.05）有顯著性差異，miR-373低表達患者預后較差.多因素分析顯示非小細胞型肺癌中miR-373的表達水平是預測OS和DFS（P＜0.05）的獨立危險因素.結(jié)論：miR-373的表達與非小細胞型肺癌患者預后顯著相關(guān)，miR-373可作為預測非小細胞型肺癌患者預后的獨立標志物.

非小細胞型肺癌；微陣列芯片法；實時定量PCR；miRNA-373；預后

肺癌是全世界范圍內(nèi)癌癥死亡的首要原因.全球每年約有130萬人死于肺癌［1］.肺癌按照分化程度和形態(tài)特征主要分為非小細胞型肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占85%和小細胞型肺癌約占15%.盡管各種新興技術(shù)用于腫瘤早期診斷和新開發(fā)的化療/靶向治療可提高療效，但是非小細胞肺癌患者5年生存期仍然較低（15%），復發(fā)率較高［2］.如果非小細胞肺癌在早期局限性階段能檢測到，則5年存活率可達50%，若有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移，而5年存活率急劇下降［3］.因此，倘若發(fā)現(xiàn)可用于預防、診斷和預后的分子生物標記物，在很大程度上，有利于提高非小細胞型肺癌患者的治療效果.

微小RNA（miRNA）是一類小型的非編碼的內(nèi)源性調(diào)控基因表達的單鏈RNA.miRNA通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，對細胞發(fā)育和致癌信號通路發(fā)生著重要的影響.大量的研究表明，miRNA在腫瘤中存在異常表達，并且發(fā)揮著癌基因或者抑癌基因的作用［4－7］.最近有研究表明，miRNA不僅可用于非小細胞型肺癌區(qū)分亞型，一些miRNAs基因表達分析還可以用于預測早期非小細胞型肺癌的預后和復發(fā)［8－11］.因此，非小細胞型肺癌細胞中 miRNA異常表達導致的功能異常的研究，有助于了解疾病的發(fā)病機理，也可以更好地理解miRNA在腫瘤發(fā)生和腫瘤進展中的作用.最近，已有研究表明miRNA-373與腫瘤發(fā)生和進展有關(guān)，如胃癌、乳腺癌等［12－13］.本研究探索miRNA-373在非小細胞型肺癌和癌旁組織石蠟包埋組織中的表達模式，分析miRNA-373的表達與非小細胞型肺癌的臨床病理因素和預后之間的關(guān)系.

1　材料和方法

1.1病例選擇

本研究通過湖北民族學院附屬民大醫(yī)院的倫理委員會批準和研究對象知情同意.122例非小細胞型肺癌的石蠟包埋組織標本和36例癌旁組織石蠟包埋組織標本均來自2006年1月至2008年12月期間在湖北民族學院附屬民大醫(yī)院胸外科行手術(shù)治療的患者.所有患者術(shù)前均未接受放療或化療.所有標本經(jīng)兩位病理科醫(yī)生確認診斷無誤.患者的臨床資料，如年齡、性別、臨床分期、等記錄整理.

1.2方法

（1）RNA的提取選用確診為非小細胞型肺癌患者的石蠟包埋組織組織樣本，Trizol法抽提總RNA，然后對RNA進行純化，用Nanodrop 2000測定總RNA濃度.對照樣本取自36例非小細胞型肺癌手術(shù)中收集的癌旁組織.RNA提取、純化均按照試劑盒說明書操作.

（2）miRNA微陣列芯片法檢測和qRT-PCR微陣列芯片法檢測選取4例非小細胞型肺癌標本和4個癌旁組織標本.用Affymetrix公司的miRNA3.0儀器進行檢測，依據(jù)操作說明對總RNA經(jīng)過逐漸加多聚A尾、生物素標記、雜交、洗滌、染色和掃描等.然后用 Expression Console軟件（1.3.1版本，Affy-metrix）分析陣列圖像以獲得原始數(shù)據(jù)，并使RMA標準化.Genesrping軟件（12.5版本，Agilent Tech-nologies）用于后面的數(shù)據(jù)分析.探針至少含有1個所有樣品都有的基團用“P”標識并被用于進一步的數(shù)據(jù)分析.miRNAs的差異表達主要通過變化倍數(shù)和P值比較來確定.基因上調(diào)和下調(diào)的統(tǒng)一標準是變化倍數(shù)≥2.0且P值≤0.05.聚類分析用于顯示樣品miRNAs表達譜之間的差別.

用qRT-PCR檢測非小細胞型肺癌和癌旁組織中miRNA-373的表達.RNU6B用作內(nèi)參.miRNA-373的引物為：5′-GTAGCAGGATGGCCCTAGAC-3′（正向）；5′-CGCCCTCTGAACCTTCTCTT-3′（反向）.RNU6B的引物為：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′（正向）；5′-AACGCTTCACGAATTTGC GT-3′（反向）.所有樣品重復3次，候選miRNAs根據(jù)內(nèi)參基因RNU6校正 miRNA-373的表達量，以公式2（－ΔΔCT）表示，其中ΔCt＝Ct目的基因－Ct參照樣本，ΔΔCt＝ΔCt目的基因－ΔCt對照基因.

1.3隨訪和統(tǒng)計分析

所有受試者每3個月以電話或信件隨訪，隨訪資料同時進行更新.隨訪時間從手術(shù)之日起計算，末次隨訪時間為2014年5月31日.中位隨訪時間為42.8個月（5.6～62.3個月）.

所有統(tǒng)計分析均采用SPSS 16.0軟件進行.miRNA-373的表達與臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)用Mann-Whitney檢驗或秩和檢驗.采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗分析生存活曲線.進行單因素和多因素Cox分析，用風險比（HR）及95%置信區(qū)間（CI）評價不同臨床病理特征與生存期的相關(guān)性.P＜0.05表示統(tǒng)計有顯著性差異.

2　結(jié)果

2.1非小細胞型肺癌的石蠟包埋組織中miRNAs表達譜分析和RT-PCR檢測

為了探索非小細胞型肺癌和癌旁組織石蠟包埋組織中miRNA-373的表達模式，選取4例非小細胞型肺癌和4例癌旁組織的石蠟包埋組織進行miR-NAs微陣列芯片分析.在47個候選miRNAs的表達譜中，可見miRNA-373、miRNA-216a和miRNA-375在非小細胞型肺癌中表達下調(diào)（圖1）.

圖1　miRNAs在非小細胞型肺癌和癌旁組織中差異表譜，紅色表示高表達，綠色表示低表達Fig.1　Differential expression of miRNAs in non-small cell lung cancer and paratumor tissues.Color gradation indicates the relative expression levels of miRNAs from low expression（green）to high expression（red）

為了驗證對微陣列芯片法分析的miRNAs的表達變化，采用qRT-PCR方法檢測了122例非小細胞型肺癌和36個癌旁組織石蠟包埋組織中miRNA-373的表達.結(jié)果顯示miRNA-373在非小細胞型肺癌的相對表達量為（2.61±0.93），癌旁組織為（7.58±1.72），兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）.qRT-PCR檢測的miRNA-373與微陣列芯片法分析 miRNA-373的結(jié)果相一致（P＜0.05，圖2）.

圖2　miRNA-373在非小細胞型肺癌和癌旁組織中Fig.2　A）miRNA-373 relative expression in non-small cell lung cancer and paratumor tissues was analyzed by qRT-PCR.B）Agarose gel electrophoresis of qRT-PCR products of miRNA-373 from paired non-small cell lung cancer tissues and paratumor tissues （NT），RNU6B was used as an internal control

2.2miRNA-373表達與非小細胞型肺癌臨床病理特征的相關(guān)性

比較miRNA-373的表達情況與臨床病理變量的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，miRNA-373的表達與病理組織類型（P＝0.040）、分化程度（P＝0.022）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P ＝0.008）、臨床分期（P＝0.038）、血管浸潤（P＝0.001）、復發(fā)時間（P＝0.018）、和生存時間（P＝0.026）之間存在顯著性相關(guān)（表1）.

表1　miRNA-373表達與非小細胞型肺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 1　The relationship between miRNA-373 expression and non-small cell lung cancer clinico-pathological characteristics

2.3非小細胞型肺癌患者的miRNA-373的表達與DFS和OS的關(guān)系

分析非小細胞型肺癌的石蠟包埋組織中miR-NA-373的表達的預后價值，包括病理組織類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、血管浸潤、復發(fā)時間、生存時間及miRNA-373的表達等影響因素的單因素生存分析（表2）.Log-rank檢驗表明，非小細胞型肺癌組織中miRNA-373高表達的患者OS較miR-NA-373低表達的患者OS更長，差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.035，圖3A）；非小細胞型肺癌組織中miR-NA-373高表達的患者DFS較miRNA-373低表達的患者DFS更長，差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.013，圖3B）.

為確定的miRNA-373的表達與非小細胞型肺癌預后的獨立因素關(guān)系，對OS和DFS進行多因素回歸分析（表3），miRNA-373的表達（P＝0.009）、分化程度（P＝0.012），血管浸潤（P＝0.030），復發(fā)時間（P＝0.016）和生存時間（P＝0.037）與OS顯著性相關(guān).miRNA-373的表達（P＝0.003），分化程度（P＝0.011），臨床分期（P＝0.018），血管浸潤（P ＝0.046），復發(fā)時間（P＝0.029）和生存期（P＝0.041）均與DFS顯著性相關(guān)，結(jié)果提示miRNA-373的表達是預測非小細胞型肺癌預后的獨立因素.

表2　單因素Cox分析非小細胞型肺癌的總生存期和無病生存期Table 2　Univariate Cox regression analysis of OS and DFSin non-small cell lung cancer

圖3　miRNA-373在非小細胞型肺癌中表達的　A）累積生存率和　B）無進展生存率曲線圖Fig.3　Survival curves of 122 patients with non-small cell lung cancer.A）Overall survival；B）Disease-free survival of patients with tumors having low or high expression levels of miRNA-373.

表3　多因素Cox分析非小細胞型肺癌的總生存期和無病生存期Table 3　Multivariate Cox regression analysis of OS and DFS in non-small cell lung cancer

3　討論

在本研究中，首先探討了miRNA-373在非小細胞型肺癌和癌旁組織中的表達情況，用微陣列芯片法檢測到miRNA-373在非小細胞型肺癌中的表達低于癌旁組織，然后用qRT-PCR法再對miRNA-373在非小細胞型肺癌和癌旁組織中表達進行驗證，兩種方法的結(jié)果是相一致的；其次，miRNA-373在非小細胞型肺癌中表達水平降低與病理組織類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、血管浸潤、復發(fā)時間和生存期等具有密切的關(guān)聯(lián)性，而且miRNA-373的表達水平越低腫瘤分化程度越低、臨床分期越高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險越大、血管浸潤可能性越大、復發(fā)時間越短和生存時間越短，結(jié)果表明miRNA-373在非小細胞型肺癌中可能有抑制腫瘤的作用，其可能的內(nèi)在機制是：低表達的miRNA-373通過上調(diào)靶基因促進腫瘤的侵襲性［14－15］；低表達的miRNA-373可以通過作用靶基因提高腫瘤細胞增殖能力［16］；低表達的miRNA-373可以通過作用靶基因促進細胞的生長和加強了其生存能力［17－19］.國內(nèi)有研究表明在宮頸癌中YOD1基因過表達靶向下調(diào)miRNA-373的表達而誘導宮頸癌細胞增殖，與我們的結(jié)論相一致，說明miRNA-373在腫瘤中異常表達與腫瘤細胞的生物學行為，如腫瘤細胞增殖能力等密切相關(guān)［20］.

另有研究表明，特定miRNA的表達水平異?？赡芘c非小細胞型肺癌腫瘤的進展有關(guān)，因此檢測miRNA可以預測腫瘤的預后.本研究中，非小細胞型肺癌患者 miRNA-373的表達水平越低其預后也越差，單因素和多因素Cox回歸分析表明miRNA-373的表達水平低是非小細胞型肺癌患者的不良總生存期和無進展生存期密切相關(guān)的預后因素.本研究的結(jié)果顯示miRNA-373可以作為非小細胞型肺癌獨立預測預后的標志物.miRNA-373的表達異?？赡苁欠伟┘毎衜iRNA-373因組蛋白修飾而沉默，發(fā)揮抑癌基因的作用，并通過作用下游IRAK2 和LAMP1靶基因來負性調(diào)節(jié)間充質(zhì)表型，miRNA-373低表達時提示促進腫瘤細胞生長，預示導致患者的預后較差［21］.

綜上，miRNA-373在非小細胞型肺癌中的表達具有重要的臨床意義，在腫瘤發(fā)展可能發(fā)揮抑癌基因的作用，可作為一個潛在的獨立預測預后的因素.miRNA-373的生物學功能及其對腫瘤的抑制作用，仍有待深入研究.

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［責任編輯：朱穎?］

miRNA-373 expression in non-small cell lung cancer and its clinical significance

LIU Bicui，YANG Hua，F(xiàn)ANG Shirong，MEI Yongtian，XIANG Wei
（Department of Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of Hubei Institute for Nationalities，Enshi，445000，China）

Aim：To investigate the relationship between miRNA-373 expression and clinico-pathologi-cal factors in non-small cell lung cancer（NSCLC）tissue，and to evaluate the roles of miRNA-373 in predicting the prognosis of non-small cell lung cancer patients.Methods：The expression levels of miR-NA-373 were analyzed in non-small cell lung cancer and paratumor tissues by microarray and quantitative real-time RT-PCR（qRT-PCR）.Survival analysis by the Kaplan-Meier method was performed to assess the prognostic significance.Results：Downregulation of miRNA-373 was detected in most primary non-small cell lung cancer，which was confirmed by qRT-PCR analysis.Additionally，downregulation of miR-NA-373 was significantly associated with the pathological histology，differentiation，lymphatic metastasis，clinical staging，vascular infiltration，time to recurrence and the poor overall survival（OS）（P＜0.05）.Using Kaplan-Meier analysis，comparison of survival curves between low and high expressions of miRNA-373 revealed a highly significant difference between OS and disease-free survival（DFS）（P＜0.05），which suggested that low expression of miRNA-373 is associated with poor prognosis.Multivariate analy-sis showed that miRNA-373 expression was an independent risk factor for predicting OS and DFS in non-small cell lung cancer.Conclusion：These findings indicated that the expression of miRNA-373 is signifi-cantly correlated with prognosis in non-small cell lung cancer patients，suggesting that miRNA-373 may serve as an independent prognostic marker.

non-small cell lung cancer（NSCLC）；microarray；qRT-PCR；miRNA-373；prognosis

R734.2

A

1000－9965（2015）06－0477－07

10.11778/j.jdxb.2015.06.007

2015－06－30

湖北省衛(wèi)生廳基金項目（JX6B1076）

劉碧翠（1978－），男，主治醫(yī)師，研究方向：肺癌的基礎(chǔ)和臨床研究；Tel：0718－8301384；E-mail：liubicuihin＠126.com