鹽酸小檗堿通過P13K/AKT信號通路抑制MMP2和MMP9的表達(dá)影響膀胱癌T24細(xì)胞侵襲性

高瑞林，　陳祥榮，　李毅寧，　張建育，　陳俊毅，　郭一泓，　章　峰（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，福建　泉州　362000）

鹽酸小檗堿通過P13K/AKT信號通路抑制MMP2和MMP9的表達(dá)影響膀胱癌T24細(xì)胞侵襲性

高瑞林，陳祥榮，李毅寧，張建育，陳俊毅，郭一泓，章峰
（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿外科，福建泉州362000）

目的：探討鹽酸小檗堿（Berberine hydrochloride）對膀胱癌T24細(xì)胞侵襲能力的影響及機(jī)制.方法：采用利用CCK8法檢測膀胱癌T24細(xì)胞的生存率；transwell侵襲試驗(yàn)檢測鹽酸小檗堿對T24細(xì)胞侵襲能力的影響；West-ern-blotting分析鹽酸小檗堿對P13K/AKT通路相關(guān)因子（PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT），細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2、MMP9）蛋白表達(dá)的改變.結(jié)果：CCK8顯示鹽酸小檗堿對T24細(xì)胞的增殖抑制呈濃度和時間依賴性（P＜0.05）；與對照組比較，經(jīng)鹽酸小檗堿處理后膀胱癌T24細(xì)胞侵襲能力明顯降低.P13K抑制劑LY294002可通過抑制P13K/AKT通路活化，抑制MMP2和MMP9的表達(dá)，相對應(yīng)的鹽酸小檗堿處理后膀胱癌T24細(xì)胞p-PI3K、p-AKT、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）.結(jié)論：鹽酸小檗堿可有效抑制膀胱癌T24細(xì)胞侵襲能力，其機(jī)制可能是通過調(diào)控P13K/AKT通路抑制MMP2和MMP9的表達(dá).

鹽酸小檗堿；膀胱癌；侵襲性；MMP2；MMP9；P13K/AKT信號通路

膀胱癌是中國常見泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，臨床上多采用保留膀胱的經(jīng)尿道電切術(shù)進(jìn)行治療.由于膀胱癌細(xì)胞高度侵襲性，保留膀胱的各種手術(shù)治療術(shù)后常復(fù)發(fā).故常用膀胱內(nèi)藥物灌注治療以預(yù)防其復(fù)發(fā)［1］.鹽酸小檗堿（Berberine hydrochloride）又名黃連素（apigenin），對多種腫瘤具有抑制作用，還可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物和放射治療敏感性和耐受性，提高腫瘤治療療效［1－3］.但鹽酸小檗堿對膀胱癌特別是瘤細(xì)胞侵襲性的抑制作用及機(jī)制目前尚清楚.本實(shí)驗(yàn)擬采用不同濃度的鹽酸小檗堿干預(yù)膀胱癌T24細(xì)胞，檢測T24細(xì)胞侵襲能力，P13K/AKT信號通路及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix melaIIopmLeinases，MMPs）家族中MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)情況，探討鹽酸小檗堿對膀胱癌細(xì)胞侵襲的抑制作用及機(jī)制.

1　材料與方法

1.1材料

T24人移形細(xì)胞膀胱癌細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所（Shanghai Institute of Cell Biology，Chinese Aeademyof Seienees）并保持于福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室.鹽酸小檗堿購自中國藥品生物制品檢定所，批號：111901－201102；transwell小室購自美國BD公司.CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，MMP2、MMP9、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT抗體購自美國CST公司.P13K特異性抑制劑LY29400購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：S1737；鹽酸小檗堿應(yīng)用DMSO溶解成濃度為1 mmol/L作為儲存液供實(shí)驗(yàn)用，實(shí)驗(yàn)前用適量的培養(yǎng)液稀釋到所需相應(yīng)濃度.

1.2方法

（1）細(xì)胞培養(yǎng)和處理T24細(xì)胞培養(yǎng)使用的是含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%小牛血清、質(zhì)量濃度均為100 μg/mL青霉素及鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度、37℃孵箱中培養(yǎng)，更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長至貼滿培養(yǎng)瓶壁時，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰酶消化傳代.取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn).鹽酸小檗堿實(shí)驗(yàn)干預(yù)：棄含體積分?jǐn)?shù)為5% FBS無雙抗的DMEM，各組加入配置好培養(yǎng)液5 mL，其中含有不同濃度的鹽酸小檗堿，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng).P13K特異性抑制劑LY29400濃度按文獻(xiàn)［4］取20 μmol/L用于實(shí)驗(yàn)干預(yù).

（2）CCK8測定細(xì)胞增殖收集對數(shù)生長期T24膀胱癌細(xì)胞制備成密度為1.0×106的細(xì)胞懸液，接種于96孔板（100 μL/孔），置于37℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2）培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h.然后加入終濃度分別為0、25、50、75、100 μmol/L鹽酸小檗堿，每組細(xì)胞設(shè)5個復(fù)孔），分別培養(yǎng)24、48、72 h.吸除培養(yǎng)基，并用PBS洗滌細(xì)胞兩次后加入新的培養(yǎng)基，然后加入10 μL CCK8溶液.置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定OD值.加入相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照.細(xì)胞增殖率（%）＝［A（加藥）－A（空白）］/［A（加藥）－A（空白）］×100.

（3）Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)Transwell小室（包被matigel基質(zhì)膠）檢測T24細(xì)胞侵襲能力.取200 μL細(xì)胞懸液（2.0×105/mL）加入Trasnwell上室.下室小心加入600 μL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%血清DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h.取出小室，棄上室內(nèi)培養(yǎng)基，體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛固定10 min，應(yīng)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%結(jié)晶紫染色液染色約3 min，棉簽輕輕擦去小室膜上表面尚未穿過的細(xì)胞.倒置顯微鏡下照相隨機(jī)選取5個高倍鏡視野，計(jì)數(shù)穿過底膜的細(xì)胞數(shù)，各組之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

（4）Western blotting檢測PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、MMP2、MMP9的蛋白表達(dá)收集對數(shù)期細(xì)胞制備成密度1.0×106個/mL的細(xì)胞懸液，接種于24孔板（100 μL/孔），加入濃度分別為 0、25、50、75、100 μmol/L鹽酸小檗堿共孵育48 h，再各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入蛋白裂解液（RIPA含PMSF）后，4℃離心收集.進(jìn)行組織蛋白定量，煮沸8 min使蛋白變性，10 000/min，4℃離心5 min，取上清液，－20℃保存?zhèn)溆?取蛋白50 μg進(jìn)行SDS聚丙烯胺凝膠電泳后，電壓120 V，電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約0.5 cm；然后將蛋白印跡到硝酸纖維素膜上，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗MMP-2（1∶200）、MMP-9（1∶400）、PI3K（1∶200）、p-PI3K（1∶200）、AKT （1∶200）、p-AKT（1∶200），4℃孵育過夜，TBST洗膜10 min 3次；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記對應(yīng)二抗室溫孵育60 min，用 TBST洗10 min 3次；再用TBS洗膜10 min.ECL浸泡后X片曝光，分析結(jié)果.所用內(nèi)參為β-actin.

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，多個樣本的組間比較采用ONE-WAY ANOVA，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2　結(jié)果

2.1鹽酸小檗堿對T24細(xì)胞增殖的抑制作用

通過CCK-8檢測不同濃度0、25、50、75、100 μmol/L鹽酸小檗堿、不同時間0～72 h對T24細(xì)胞增殖抑制作用，結(jié)果顯示鹽酸小檗堿對T24細(xì)胞的增殖抑制呈濃度和時間依賴性.與對照組相比，濃度50μmol/L以上鹽酸小檗堿可明顯抑制T24細(xì)胞增殖（P＜0.05）；鹽酸小檗堿濃度低于25 μmol/L時對細(xì)胞抑制作用不明顯，與對照組無明顯差異（P＞0.05，圖1）.

圖1　鹽酸小檗堿對T24細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1　Berberine hydrochloride inhibits proliferation of bladder cancer cell T24

2.2鹽酸小檗堿抑制T24細(xì)胞侵襲能力

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明，鹽酸小檗堿處理組T24細(xì)胞透過上室Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)明顯少于正常對照組（P＜0.05或0.01）.即使?jié)舛葹?5 μmol/L鹽酸小檗堿都能有效抑制T24細(xì)胞侵襲能力.相對于DMSO對照組細(xì)胞，在24 h時，濃度分別為25、50、75 μmol/L鹽酸小檗堿抑制 T24細(xì)胞侵襲能力有效率分別達(dá)32.14%、58.92%、76.78%（表1）.

表1　鹽酸小檗堿對膀胱癌　T24細(xì)胞侵襲性的影響Table 1　Berberine hydrochloride inhibits T24 cells invasion

2.3鹽酸小檗堿對膀胱癌T24細(xì)胞MMP2、MMP9、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)的影響

Western blotting檢測顯示，與對照組相比，鹽酸小檗堿作用24h后對T24細(xì)胞p-PI3K、p-AKT、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)有明顯抑制作用（P＜0.05），特別是在濃度50μmol/L下抑制作用更為明顯（P＜0.01），但對PI3K、AKT表達(dá)影響?。≒＞0.05，圖2、表2）.LY294002（P13K抑制劑）可通過抑制P13K/AKT通路抑制MMP2和MMP9的表達(dá)，提示鹽酸小檗堿或許是通過抑制P13K/AKT通路活化，減少M(fèi)MP2和MMP9的表達(dá)，影響T24細(xì)胞侵襲性.

圖2　Western blotting檢測　MMP2、MMP9、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)Fig.2　Expression of MMP2、MMP9、PI3K、p-PI3K、AKT and p-AKT in T24 cells after treatment with Berberine hydro-chloride

表2　Western blotting檢測MMP2、MMP9、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)Table 2　Expression of MMP2、MMP9、PI3K、p-PI3K、AKT and p-AKT in T24 cells after treatment with Berberine hydro-chloride?。?）

3　討論

鹽酸小檗堿是一種生物堿，主要存在于小檗屬與黃連屬植物中.具有抗菌、止瀉、消炎等效果，臨床長期用于清熱解毒，抗腸道細(xì)菌感染［5］.對結(jié)腸癌［6］、乳腺癌［7］、前列腺癌［8］、肝癌［9］和肺腺癌［10］等腫瘤具有抑制作用.本研究結(jié)果也顯示一定濃度的鹽酸小檗堿可明顯抑制膀胱癌T24細(xì)胞增殖，且抑制呈濃度和時間依賴性.

膀胱癌細(xì)胞高侵襲性是膀胱癌患者術(shù)后高復(fù)發(fā)、高致死率的重要原因，腫瘤侵襲性也是膀胱癌發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中重要的生物學(xué)標(biāo)志.有效抑制腫瘤細(xì)胞侵襲性，對于控制膀胱癌發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程具有重要意義［1，11］.在本研究中，利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明鹽酸小檗堿能有效抑制T24細(xì)胞侵襲能力，與Yan［1］等試驗(yàn)結(jié)果一致，為鹽酸小檗堿臨床應(yīng)用于膀胱癌防治提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是金屬離子Zn依賴的蛋白水解酶超家族，其主要功能為降解多種細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellularmatrix，ECM）成分，而ECM中基底膜的降解是腫瘤侵襲的關(guān)鍵.MMP2和MMP9 是MMPs家族中重要的兩個因子，能夠特異性地降解ECM基底膜中的V、Vll、X型膠原、明膠和彈性纖維（構(gòu)成基底膜的主要成分），與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切有關(guān)［12－13］.本實(shí)驗(yàn)采用Western blotting方法顯示鹽酸小檗堿處理后，膀胱癌T24細(xì)胞MMP2、MMP9蛋白表達(dá)減少，相對應(yīng)的腫瘤細(xì)胞侵襲能力也明顯下降.

磷脂酰肌醇3激酶（Phosphoinositide3-kinase，P13K）是胞內(nèi)具有催化活性的信號蛋白，可磷酸化胞內(nèi)3，4二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）使其轉(zhuǎn)化為3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），通過激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞存活、細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移［14］.研究表明MMPs的表達(dá)呈P13K依賴的特點(diǎn)，活化的P13K通路（磷酸化）能使MMP2和MTl-MMP（MMPl4）的活性和表達(dá)水平上調(diào)［15－16］.p-PI3K、p-AKT是PI3K、AKT活化狀態(tài)，是PI3K信號通路活化的標(biāo)志.本實(shí)驗(yàn)證實(shí)P13K抑制劑LY294002降低PI3K、AKT磷酸化水平抑制PI3K通路激活，進(jìn)而使MMP2、MMP9的表達(dá)水平則下調(diào).Western blotting進(jìn)一步顯示鹽酸小檗堿處理后，膀胱癌T24細(xì)胞p-PI3K、p-AKT、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)均明顯下降，提示鹽酸小檗堿有可能通過下調(diào)P13K/AKT信號通路抑制MMP2、MMP9的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制T24細(xì)胞侵襲性.

綜上，本研究證實(shí)鹽酸小檗堿能有效抑制膀胱癌T24細(xì)胞侵襲能力，其機(jī)制可能與鹽酸小檗堿通過下調(diào)P13K/AKT信號通路，抑制MMP2和MMP9的表達(dá)，進(jìn)而影響膀胱癌T24細(xì)胞侵襲性，為鹽酸小檗堿在膀胱癌臨床治療中的應(yīng)用提供的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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［責(zé)任編輯：朱穎?］

Berberine hydrochloride inhibits bladder cancer cell T24 invasion through inhibiting the expression of MMP2 and MMP9 via P13K/AKT signaling pathway

GAO Ruilin，CHEN Xiangrong，LI Yining，ZHANG Jianyu，CHEN Junyi，GUO Yihong，ZHANG Feng
（Department of Urology，the Second Affiliated Hospital，Medical University of Fujian，Quanzhou，362000，China）

Aim：To investigate whether Berberine hydrochloride can inhibit the invasion of bladder cancer cell line T24 and the underlying mechanisms.Methods：T24 cells were cultured with different concentrations of Berberine hydrochloride，and CCK8 assay was used to evaluate the cell inhibition rates.Cell invasion capabilities were evaluated by means of transwell matrix penetration assays.Activities and expressions of P13K/AKT signaling pathway-related factors（PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT）and invasion-related proteins matrix-metallopeptidase 2（MMP-2）and MMP-9，were analyzed by Western blotting.Re-sults：Berberine hydrochloride caused concentration-and time-dependent inhibition of proliferation of T24 cells.T24 cells treated with Berberine hydrochloride showed significantly decreased invasion capabil-ities（P＜0.05）.Western blotting demonstrated that P13K inhibitors（LY294002）can inhibit the ex-pression of MMP2 and MMP9.Moreover，expressions of p-PI3K，p-AKT，MMP2 and MMP9 were sup-pressed by Berberine hydrochloride in T24 cells（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：Berberine hydro-chloride may play a role to inhibit bladder cancer cell line T24 invasion through suppressing the expres-sions of MMP2 and MMP9 via P13K/AKT signaling pathway.

Berberine hydrochloride；Bladder cancer；Invasion；MMP-2；MMP-9；P13K/AKT signaling pathway

R737.14

A

1000－9965（2015）06－0472－05

10.11778/j.jdxb.2015.06.006

2014－10－09

福建省衛(wèi)生廳青年課題項(xiàng)目（2013－2－49）；泉州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Z20150035）

高瑞林（1975－），男，碩士，研究方向：膀胱癌基礎(chǔ)和臨床研究

李毅寧，主任醫(yī)師，Mobile：13808549738；E-mail：13808549738＠qq.com