蛋白激酶　D1對心肌梗死大鼠心肌組織　eNOS及Ang1表達的調(diào)控作用

楊　雷，　毛秉豫，　劉　暖（南陽理工學院　醫(yī)學實驗中心，河南　南陽　473004）

蛋白激酶D1對心肌梗死大鼠心肌組織eNOS及Ang1表達的調(diào)控作用

楊雷，毛秉豫，劉暖
（南陽理工學院醫(yī)學實驗中心，河南南陽473004）

目的：探討蛋白激酶D1（PKD1）對大鼠心肌梗死后心肌組織內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）及促血管生成素1（Ang1）表達調(diào)控的影響.方法：采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎造模方法復制大鼠心肌梗死模型，術后存活達2 d以上的心肌梗死大鼠隨機被分為模型組、PKD1處理組與CID755673處理組，每組8只.應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）分析PKD1及其阻斷劑CID755673對大鼠心肌組織中eNOS及Ang1 mRNA表達的影響，應用免疫組化法和免疫印跡法分析eNOS及Ang1的蛋白表達.結(jié)果：和心肌梗死模型組相比較，PKD1處理組大鼠心肌組織中eNOS及Ang1的mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；和PKD1處理組比較，CID755673處理組大鼠心肌組織中eNOS及Ang1的mRNA和蛋白表達水平顯著下降（P＜0.01），接近于模型組水平.結(jié)論：PKD1顯著上調(diào)大鼠心肌梗死后受損心肌組織中eNOS及Ang1的表達.

蛋白激酶D1；心肌梗死；一氧化氮合成酶；促血管生成素1；大鼠

蛋白激酶D1（Protein kinase D1，PKD1）是腫瘤血管形成進程中的關鍵調(diào)控蛋白之一［1－3］，PKD1信號級聯(lián)反應和胰腺癌、肝癌、胃癌、腸癌、乳腺癌、前列腺癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關［2－7］，鑒于此，抗PKD1抑制腫瘤血管的成熟而促進腫瘤細胞凋亡的治療策略引發(fā)了學者們廣泛的興趣［5－7］.PKD1既然是腫瘤血管新生的關鍵調(diào)控蛋白之一，是否也在缺血受損的心肌組織中發(fā)揮著重要的作用？能否成為心肌梗死治療的潛在靶點，本實驗擬探討PKD1對大鼠心肌梗死后心肌組織內(nèi)內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）及促血管生成素1（Angiopoietin-1，Ang1）表達調(diào)控的影響，以“PKD1”為靶點促血管新生療法治療心肌梗死提供實驗依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料

（1）實驗動物SD大鼠，購自河南省實驗動物中心，雄性，清潔級，8周齡，體質(zhì)量約200～240 g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2010－0002，動物質(zhì)量合格證號：1000142.

（2）主要試劑PKD1購自美國Pierce公司，生產(chǎn)批號為OSP00005W；PKD1特異阻斷劑 CID755673購自美國MedChemExpress公司，生產(chǎn)批號為2011756；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Gene公司，生產(chǎn)批號為AORT-0020/AORT-0050；eNOS、Ang1抗體購自天津恒業(yè)生物科技有限公司，生產(chǎn)批號為EL163112；Ang1抗體購自天津賽爾生物技術有限公司，生產(chǎn)批號為SRP00490；羊抗兔IgG、DAB顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司，生產(chǎn)批號為TC1378和DD1660.

1.2方法

（1）心肌梗死模型建立及分組參照本研究小組之前的研究［1］，采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎造模方法復制大鼠心肌梗死模型.術后存活達2 d以上的心肌梗死大鼠隨機被分為模型組、PKD1處理組、CID755673處理組，每組8只.PKD1處理組大鼠按照每天質(zhì)量分數(shù)為10 mg/kg的標準腹腔注射，模型組注射等量的生理鹽水，CID755673處理組大鼠在PKD1處理組的基礎上按照每天質(zhì)量分數(shù)為10 mg/ kg的標準同時腹腔注射CID755673.連續(xù)飼養(yǎng)14 d后處死大鼠.

（2）RT-PCR檢測取出－80℃冰箱的凍存管中每只大鼠梗死區(qū)的100 mg心肌組織，IKA-T25勻漿機制成勻漿，4℃下12 000 g離心5 min，Trizol法提取總RNA后進行eNOS及Ang1 mRNA轉(zhuǎn)錄表達的變化檢測.根據(jù)Genbank序列，分別設計eNOS及Ang1上、下游引物，eNOS：5′-CTGCTGCCCCAGATATCT-TC-3′，5′-TCCTCCCTGACGTCATGGAC-3′，產(chǎn)物長度為230 bp；Ang1：5′-TTTTGTGTGGGTCTGGT-3′，5′-TTGTTCCCGTCGTAGTTC-3′，產(chǎn)物長度為202 bp；β-actin：5′-CGTTCACATCCGTAAAGACCTC-3′，5′-TCTAATGACGGGACCGAGGAT-3′，產(chǎn)物長度為118 bp.每組細胞取2 μg總RNA，根據(jù)說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再取2 μg逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行普通PCR，94 ℃ 5 min，95℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃延伸5 min.取反應產(chǎn)物10 μg產(chǎn)物在質(zhì)量分數(shù)為1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后Al-phaView SA軟件攝圖，并分析eNOS或Ang1與β-ac-tin的相對灰度比值.

（3）免疫組化檢測參照本研究小組之前的研究［1］制作免疫組化染色切片，在 400倍鏡視野下選取心肌梗死區(qū)內(nèi)10個無重疊視野，利用Nikon NIS-Elements Software BR分析系統(tǒng)計算出平均吸光度，從而對目標蛋白表達含量進行半定量分析.

（4）免疫印跡檢測組織勻漿后Bradford法測定蛋白濃度，取其中20 μg蛋白進行12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，質(zhì)量分數(shù)為5%的脫脂奶粉封閉2 h后洗膜，標記1∶1 000稀釋的eNOS或者Ang1一抗，4℃過夜，洗膜，與辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀釋）孵育1 h后TBST洗膜，沖洗后暗室曝光顯影.同時以β-actin蛋白表達水平作為內(nèi)參對照.膠片經(jīng)成像分析系統(tǒng)掃描，并應用AlphaView SA軟件分析各樣本與β-actin蛋白灰度的相對比值，記錄蛋白相對含量.

1.3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件系統(tǒng)，計量資料以（珋x ±s）表示，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異.

2　結(jié)果

2.1PKD1對大鼠心肌組織 eNOS和Ang1 mRNA 表達的影響

和模型組比較，PKD1處理組大鼠心肌組織eNOS和Ang1 mRNA表達水平均顯著增加（P＜0.01），加入CID755673處理之后，大鼠心肌組織eNOS和Ang1mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.01），表明PKD1可以明顯上調(diào)心肌梗死后大鼠心肌組織中eNOS和Ang1的mRNA表達（圖1）.

2.2PKD1對大鼠心肌組織中eNOS和Ang1蛋白

表達的影響

免疫組化染色處理后，eNOS或Ang1表達陽性細胞在心肌細胞胞漿內(nèi)可見黃色或棕黃色顆粒.模型組大鼠心肌組織胞漿中eNOS或Ang1表達陽性的細胞較少；和模型組相比，PKD1處理組心肌組織中呈現(xiàn)大片的胞漿eNOS和Ang1蛋白表達陽性細胞（P＜0.01）；加入CID755673處理之后，大鼠心肌組織中eNOS和Ang1蛋白表達陽性細胞顯著減少（P＜0.01）.免疫印跡法檢測取得一致的結(jié)果，表明PKD1可以顯著明顯上調(diào)心肌梗死后大鼠心肌組織中eNOS和Ang1的蛋白表達（圖2、圖3）.

圖1　PKD1對大鼠心肌組織eNOS和Ang1 mRNA表達的影響Fig.1　Effect of PKD1 on mRNA expression of eNOS and Ang1 in myocardium of rats with myocardial infarction

圖2　PKD1對大鼠心肌組織中　eNOS和　Ang1蛋白表達的影響（免疫組化法）Fig.2　Effect of PKD1 on protein expression of eNOS and Ang1 in myocardium of rats with myocardial infarction（immunohistochemistry）.

圖3　PKD1對大鼠心肌組織中　eNOS和　Ang1蛋白表達的影響（免疫印跡法）Fig.3　Effect of PKD1 on protein expression of eNOS and Ang1 in myocardium of rats with myocardial infarction（immu-noblotting）.

3　討論

本研究證實PKD1可以顯著上調(diào)心肌梗死后大鼠受損心肌組織中eNOS和Ang1的mRNA及蛋白表達水平.eNOS和其產(chǎn)物NO在血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)維持中扮演著重要的角色，不僅調(diào)控著血壓水平、血管的緊張度，而且發(fā)揮著重要的抗炎、抗氧化、抗血栓形成效應［8－13］.eNOS的激活是通過1179的絲氨酸激活位點，Akt、CaMKII、AMPK、PKD1均可以通過這一位點而激活eNOS［12－13］.PKD1通過作用于絲氨酸1179激活位點而磷酸化激活eNOS，而且很可能PKD1以一種不依賴Akt的方式參與到VEGF介導的eNOS激活，參與內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管新生［14］；采用PKD1阻斷劑或者基因沉默PKD1均可以阻斷依賴eNOS的動脈內(nèi)皮細胞的遷移以及受損傷口的愈合［15］.此外，Hsp90也可能通過VEGF參與介導PKD1和eNOS之間的作用［15］.也有學者認為，eNOS屬于新發(fā)現(xiàn)的PKD的底物，因為eNOS被各種各樣氨基酸識別結(jié)合激活的位點恰恰均存在于現(xiàn)有報道的PKD底物之內(nèi)［14－15］.本研究證實的PKD1存在著對eNOS調(diào)控作用與上述報導高度吻合.

Ang-l在新生血管系統(tǒng)的塑形、成熟和毛細血管的穩(wěn)定中起重要作用［16－20］，Ang-l與受體Tie-2結(jié)合后，促進血管萌芽和分支，募集內(nèi)皮周圍支持細胞，促進血管重塑和成熟，形成完整的血管壁，并通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞和血管周圍間質(zhì)細胞的相互作用而維持血管管腔的完整性和穩(wěn)定性［16－20］.結(jié)合報道和本研究結(jié)果，推測PKD1可能通過結(jié)合eNOS，在VEGF的介導下，進而上調(diào)Ang1的表達水平，從而在心肌梗死后受損心肌組織的血管新生中發(fā)揮著重要的作用.提示PKD1在心血管系統(tǒng)的功能活動中發(fā)揮著十分重要的作用，特別是在調(diào)控血管新生進程中內(nèi)皮細胞的遷移、增殖以及管腔形成作用，可成為心肌梗死等心血管系統(tǒng)疾病治療的新的靶點.

［1］楊雷，毛秉豫，徐國昌，等.黃芪提取物對大鼠心肌梗死后心肌組織PKD1蛋白表達的影響［J］.中國藥理學通報，2013，29（4）：512－519.

［2］WILLE C，SEUFFERLEIN T，EISELER T.Protein ki-nase D family kinases：roads start to segregate［J］.Bio-architecture，2014，4（3）：111－115.

［3］EVANS I M，ZACHARY I C.Protein kinase D in vascu-lar biology and angiogenesis［J］.IUBMB Life，2011，63 （4）：258－263.

［4］CHANG H H，Zheng G J.Protein kinase D1，a new mo-lecular player in VEGF signaling and angiogenesis［J］.Mol Cells，2009，28（1）：1－5.

［5］EVANS I M，BAGHERZADEH A，CHARLES M，et al.Characterization of the biological effects of a novel protein kinase D inhibitor in endothelial cells［J］.Biochem，2010，429（3）：565－572.

［6］STORZ P，DOPLER H，JOHANNES F J，et al.Tyrosine phosphorylation of protein kinase D in the pleckstrin ho-mology domain leads to activation［J］.J Biol Chem，2003，278（20）：17969－17976.

［7］DI BLASIO L，DROETTO S，NORMAN J，et al.Protein kinase D1 regulates VEGF-A-induced alphavbeta3 inte-grin trafficking and endothelial cell migration［J］.Traf-fic，2010，11（8）：1107－1118.

［8］FORSTERMANN，SESSA.Nitric oxide synthases：regu-lation and function［J］.Eur Heart J，2012，33（7）：829 －837.

［9］王寶玉，邢飛躍，劉娜，等.siRNA干擾p38α上調(diào)人血管eNOS基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性［J］.暨南大學學報（自然科學與醫(yī)學版），2010，31（6）：539－543.

［10］劉娜，邢飛躍.P38α對人血管內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響［J］.暨南大學學報（自然科學與醫(yī)學版），2009，30（6）：610－613.

［11］楊云華，樊振華，邢飛躍.氯化鈷對人的eNOS基因啟動子SP1結(jié)構(gòu)體轉(zhuǎn)錄活性的影響［J］.暨南大學學報（自然科學與醫(yī)學版），2014，35（2）：124－129.

［12］HESS C N，KOU R，JOHNSON R P，et al.ADP signa-ling in vascular endothelial cells：ADP-dependent activa-tion of the endothelial isoform of nitric-oxide synthase re-quires the expression but not the kinase activity of AMP-activated protein kinase［J］.J Biol Chem，2009，284 （47）：32209－32224.

［13］CHING L C，KOU Y R，SHYUE S K，et al.Molecular mechanisms of activation of endothelial nitric oxide syn-thase mediated by transient receptor potentialvanilloid type 1［J］.Cardiovasc Res，2011，91（3）：492－501.

［14］HAO Q，WANG L，ZHAO Z J，et al.Identification of protein kinase D2 as a pivotal regulator of endothelial cell proliferation，migration，and angiogenesis［J］.J Biol Chem，2009，284（2）：799－806.

［15］AICART R C，SANCHEZ R L，GOMEZ P M，et al.Pro-tein kinase D activity controls endothelial nitric oxide syn- thesis［J］.J Cell Sci，2014，127（Pt 15）：3360－3372.

［16］TAO Z，CHEN B，TAN X，et al.Coexpression of VEGF and angiopoietin-1 promotes angiogenesis and cardiomyo-cyte proliferation reduces apoptosis in porcine myocardial infarction（MI）heart［J］.Proc Natl Acad Sci，2011，108（5）：2064－2069.

［17］LORIER G，TOURINO C，KALIL R A.Coronary angio-genesis as an endogenous response to myocardial ischemia in adults［J］.Arq Bras Cardiol，2011，97（6）：e140－e148.

［18］CHONG A Y，CAINE G J，LIP G Y.Angiopoietin/tie-2 as mediators of angiogenesis：a role in congestive heart failure［J］.Eur J Clin Invest，2011，34（1）：9－13.

［19］RODRIHUES S F，GRANGER D N.Blood cells and en-dothelial barrier function［J］.Tissue Barriers，2015，3 （1/2）：e978720.

［20］KAPPOU D，SIFAKIS S，KONSTANTINIDOU A，et al.Role of the angiopoietin/Tie system in pregnancy［J］.Exp Ther Med，2015，9（4）：1091－1096.

［責任編輯：朱穎?］

Regulation of protein kinase D1 on the expression of eNOS and Ang1 in myocardium of rats with myocardial infarction

YANG Lei，MAO Bingyu，LIU Nuan
（Medical Experimental Center，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，China）

Aim：To explore the regulation of protein kinase D1（PKD1）on the expression of endothe-lial nitric oxide synthase（eNOS）and angiopoietin-1（Ang1）in myocardium of the rats with myocardial infarction.Methods：A myocardial infarction model of SD rats was made by ligation of the left anterior descending branch of the coronary artery.At the time of 2 days after the model of myocardial infarction was made，the rats were randomly divided into：model group，PKD1 treatment group，and CID755673 treatment group，with 8 rats in each group.Theeffects of PKD1 and CID755673 on the mRNA expres-sions of eNOS and Ang1 in myocardium of the rats with myocardial infarction were measured by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.The protein expressions of eNOS and Ang1 were ana-lyzed by immunohistochemical and western blot.Results：Compared with those in the myocardial infarc-tion group，the mRNA and protein expressions of eNOS and Ang1 in myocardial tissue of the rats in the PKD1 treatment group were increased significantly（P＜0.01）.While compared with the PKD1 group，the CID755673group exhibited significant decrease in expressions of mRNA and protein of eNOS and Ang1in the myocardial tissues（P＜0.01），close to the level of the model group.Conclusion：PKD1 significantly upregulated the expression of eNOS and Ang1 in myocardium of the rats with myocardial infarction.

Protein kinase D1；myocardial infarction；endothelial nitric oxide synthase；angio-poietin-1；rat

R322.11；R322.12；R329.2

A

1000－9965（2015）06－0467－05

10.11778/j.jdxb.2015.06.005

2015－05－19

國家自然科學基金項目（81473438；81202791；81173372），河南省中醫(yī)內(nèi)科學重點學科支撐課題項目（豫教高［2012］186號）

楊雷（1977－），男，博士，副教授，研究方向：心血管疾病發(fā)病機制研究

毛秉豫（1958－），男，博士，教授，Tel：0377－62071305；E-mail：maobingyu2005＠126.com