牛皮杜鵑葉乙醇提取物抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究

何曉燕，胡 月，李文欣，劉宏漢

(通化師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 通化 134002)

牛皮杜鵑(RhododendronchrysanthemumsPall.)又名高山茶、牛皮茶，是杜鵑花科、杜鵑屬常綠小灌木，生于海拔1300～2500m之間的林下、林緣、高山苔原帶上富含腐殖質(zhì)的酸性土壤，為國家三級重點(diǎn)保護(hù)植物.該植物除了具有極高的觀賞價(jià)值外，還具有較高的藥用價(jià)值，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景，葉可入藥，具有抗病毒、抗氧化、抑菌、延緩衰老、降低血管脆性等作用，可用作防治高血壓、腦血管破裂及動(dòng)脈硬化的輔助治療劑等[1-3].目前,國內(nèi)外對牛皮杜鵑的研究主要集中在栽培、綠化方面，而對于牛皮杜鵑葉乙醇提取物抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用二甲苯致小鼠耳廓腫脹、甲醛致小鼠足腫脹及冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)方法來觀察牛皮杜鵑葉乙醇提取物的抗炎作用，采用熱板法和醋酸扭體法來研究牛皮杜鵑葉的鎮(zhèn)痛作用，為其藥用價(jià)值的開發(fā)提供一定的理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，雌性，體重(20±2)g,長春高新醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：scxk-(吉) 2008-0001.

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

冰醋酸，批號20120803,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；地塞米松磷酸注射液，批號201301263,河南潤弘制藥股份有限公司生產(chǎn)；95%乙醇，批號2013108,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)；甲醛，批號20120803，沈陽市科諾精細(xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)；二甲苯，批號20100122,遼寧新興試劑有限公司生產(chǎn)；依文思藍(lán)，批號20131208，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；羧甲基纖維素鈉300-800mpa.s，批號 20100123，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；阿司匹林片，批號120707，哈爾濱格拉雷藥業(yè)有限公司；氯化鈉，批號20120716，天津博迪化工股份有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱：型號DGF30，南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；高速萬能粉碎機(jī)：型號FW100，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；智能恒溫電熱套：型號 ZNHW-Ⅱ，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；超聲波清洗器：型號 KQ-500，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：型號 RE-200，上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式真空泵：型號 SHI-D(Ⅲ)，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電子天平：型號ES-C200A,湘儀天平儀器廠；精密電子天平：型號 JA2003，上海恒平科學(xué)儀器有限公司；可見分光光度計(jì)：型號 H723，上海第三分析儀器廠.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 牛皮杜鵑葉乙醇提取物的制備[4-5]

新鮮的牛皮杜鵑葉采于長白山，并經(jīng)鑒定.將新鮮的牛皮杜鵑葉陰干置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中60℃干燥3h,待干燥后用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，以藥液比為1:5的比例在錐形瓶內(nèi)用80%的乙醇浸泡材料1h后用超聲波清洗器超聲40min,然后濾出混合液，再加入5倍的80%乙醇超聲40min濾出混合液，合并兩次濾液.將合并液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中提純，待提純結(jié)束后將提純液放入蒸發(fā)皿中在智能恒溫電熱套上蒸發(fā)萃取，最終得到粉末狀的提取物. 以LD50給藥濃度的1/10作為高劑量組給藥濃度. 用精密儀器稱取乙醇提物粉末1.536g，0.768g，0.384g，加2滴0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，加水定容至100mL，制備濃度為15.36mg/mL，7.68mg/mL，3.84mg/mL的牛皮杜鵑葉乙醇提取物作為高、中、低劑量組的給藥濃度，冷藏備用.

2.2 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)[6]

取小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，即生理鹽水組,牛皮杜鵑葉乙醇提取物高、中、低劑量組和地塞米松組，各組小鼠均按0.2mL/10g給藥, 即牛皮杜鵑葉乙醇提取物高、中、低劑量組的給藥劑量為0.30g/kg、0.15g/kg、0.075g/kg，地塞米松組的給藥劑量為0.01g/kg，每天灌胃給藥一次，生理鹽水組每天灌胃給予等體積生理鹽水，每天稱量體重、記錄飲食量、飲水量1次，連續(xù)灌胃7d.末次給藥后1h，二甲苯涂于小鼠右耳兩面致炎，左耳不涂，致炎后60min頸椎脫臼法處死小鼠.對齊兩只耳朵沿著耳廓對稱剪下小鼠兩耳，用精密電子天平稱量，記錄腫脹度(mg)和抑制率(%).

腫脹度(mg)=右耳片重(mg)-左耳片重(mg);抑制率(%)=(空白對照組腫脹度均值-用藥組腫脹度均值)/空白對照組腫脹度值×100%.

2.3 甲醛致小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)[7-8]

取小鼠50只，分組及給藥劑量同2.2.末次給藥后1h,于右足跖皮下注射25%甲醛0.05mL致炎1h后將小鼠頸椎脫臼法處死，沿著踝關(guān)節(jié)處對稱剪下左右兩足，精密電子天平稱量，以左側(cè)足為正常對照，記錄腫脹度(mg)和抑制率(%).

腫脹度(mg)=右足重(mg)-左足重(mg);抑制率(%)=(空白對照組腫脹度均值-用藥組腫脹度均值)/空白對照組腫脹度值×100%.

2.4 冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)[9-10]

取小鼠50只，分組及給藥劑量同2.2.末次給藥1.5h后，尾靜脈注射0.5%依文思藍(lán)生理鹽水溶液0.1mL/10g，10min后用0.7%冰醋酸0.1mL/10mg，20min后脫頸椎處死小鼠，每只小鼠腹腔注射生理鹽水5mL,輕柔腹部3min,從腹腔中收集腹腔洗出液3mL(沖洗液如被血液污染則棄去不用)，1500r/min離心15min，取上清液用分光光度計(jì)，于λ=590nm處測吸光度值.

2.5 熱板法實(shí)驗(yàn)[11-15]

取小鼠放在溫度為(55±0.5)℃的熱板上，記錄小鼠從開始放在熱板上直到第一次出現(xiàn)舔后足時(shí)間，在5～30s內(nèi)舔后足的小鼠為合格小鼠，超出、小于或逃避跳躍者則不用.取合格小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，即生理鹽水組、阿司匹林組、牛皮杜鵑葉乙醇提取物高劑量組、中劑量組、低劑量組.

給藥前先測定出各小鼠的痛反應(yīng)，并記錄小鼠第一次出現(xiàn)舔足的時(shí)間(s)，此為熱板反應(yīng)潛伏期的痛閾指標(biāo)，各組小鼠均按0.2mL/10g給藥, 即牛皮杜鵑葉乙醇提取物高、中、低劑量組的給藥劑量為0.30g/kg、0.15g/kg、0.075g/kg，阿司匹林組的給藥劑量為0.023g/kg，每天灌胃給藥一次，連續(xù)給藥7d，末次給藥lh后測定小鼠的痛閾，并計(jì)算出痛閾的提高百分率，計(jì)算公式如下：

痛閾提高百分率=(給藥后平均痛閾值-給藥前平均痛閾值)/給藥前平均痛閾值×100%.

2.6 扭體法實(shí)驗(yàn)[11-18]

取小鼠50只，分組、給藥劑量同“2.5”，連續(xù)給藥7d，末次給藥后1h，每組每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)0.2mL，在15min之內(nèi)觀察并記錄第一次出現(xiàn)扭體(腹部收縮內(nèi)凹伸展后肢、臀部抬高、蠕行)的時(shí)間以及15min內(nèi)出現(xiàn)的扭體次數(shù)，計(jì)算出抑制率，公式如下：

抑制率=(對照組平均扭體次數(shù)-給藥組平均扭體次數(shù))/對照組平均扭體次數(shù)×100%.

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對小鼠一般特征的影響

與給藥前相比，各組小鼠生活正常，精神狀態(tài)良好，飲食量、飲水量均無明顯的變化，小鼠平均體重呈增長的趨勢.

3.2 牛皮杜鵑葉乙醇提取物對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

與生理鹽水組比較，牛皮杜鵑葉乙醇提取物低、中、高劑量組對二甲苯致小鼠耳廓腫脹均有一定的抑制作用，且較地塞米松組弱；其中高劑量組表現(xiàn)為極顯著性差異(P<0.01)，中劑量組無顯著性差異(P>0.05)，低劑量組無顯著性差異(P>0.05).因此,牛皮杜鵑葉乙醇提取物有一定的抗炎作用，高劑量組作用最強(qiáng)(見表1).

組別給藥劑量(g/kg)腫脹度(mg)抑制率(%)生理鹽水組-18.6±3.43-地塞米松組0.015.2±0.47??0.72低劑量組0.07518.1±3.40.027中劑量組0.1512.7±4.06?0.037高劑量組0.39.7±2.7??0.048

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05,**P<0.01.

3.3 牛皮杜鵑葉乙醇提取物對甲醛致小鼠足腫脹的影響

與生理鹽水組比較，牛皮杜鵑乙醇提取物低、中、高劑量組對甲醛致小鼠足腫脹均有一定的抑制作用，且較地塞米松組弱；其中高劑量組表現(xiàn)為顯著性差異(P<0.05)，中、低劑量組無顯著性差異(P>0.05). 因此,牛皮杜鵑葉乙醇提取物有一定的抗炎作用，高劑量組作用最強(qiáng)(見表2).

組別給藥劑量(g/kg)腫脹度(mg)抑制率(%)生理鹽水組-86.5±10.4-地塞米松組0.0124±2.38??0.723低劑量組0.07583.7±80.032中劑量組0.1581.4±10.60.06高劑量組0.363.4±5.37?0.151

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05,**P<0.01.

3.4 牛皮杜鵑葉乙醇提取物對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

與生理鹽水組比較，牛皮杜鵑葉乙醇提取物低、中、高劑量組對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的增加均有一定的抑制作用，且較地塞米松組弱；其中高、中劑量組表現(xiàn)為極顯著性差異(P<0.01)，低劑量組無顯著性差異(P>0.05).因此,牛皮杜鵑葉乙醇提取物有一定的抗炎作用，高劑量組作用最強(qiáng)(見表3).

表3 牛皮杜鵑葉乙醇提取物對冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

注：與生理鹽水組比較，**P<0.01.

3.5 對小鼠熱板致痛反應(yīng)的影響

牛皮杜鵑葉三個(gè)劑量組均能延長小鼠熱板反應(yīng)潛伏期，給藥前后比較，三個(gè)劑量組均能提高小鼠痛閾值和痛閾百分率，尤其中、高劑量組均較阿司匹林組弱；其中高劑量組差異極為顯著(p<0.01)，中劑量組差異顯著(p<0.05),低劑量組無顯著性的變化(p>0.05)；與生理鹽水組比較，高劑量組與中劑量組能提高小鼠痛閾值和痛閾百分率，其中高劑量組能明顯提高痛閾百分率，差異性極為顯著(p<0.01)，中劑量組差異性顯著(p<0.05)，低劑量組無顯著性差異(p>0.05)(見表4).

組別給藥劑量(g/kg)給藥前痛閾(s)給藥后痛閾(s) 痛閾提高率(%)生理鹽水組-13.29±2.0315.08±0.8313.47±0.9阿司匹林組0.02312.85±1.7127.69±2.74?#115.49±7.4低劑量組0.07512.88±1.2518.32±1.0542.23±2.7中劑量組0.1519.57±1.6738.86±3.74?#98.56±9.6高劑量組0.319.02±2.3552.54±6.76??##176.23±10.7

注：與給藥前比較，*P<0.05,**P<0.01;與生理鹽水組比較，#P<0.05，##P<0.01.

3.6 對小鼠醋酸扭體反應(yīng)的影響

組別給藥劑量(g/kg)扭體反應(yīng)潛伏期(min)扭體次數(shù)(次)抑制率(%)生理鹽水組- 5.54±0.7655.89±5.69-阿司匹林組0.0238.62±1.6731.33±8.54??43.94低劑量組0.0754.08±0.4352.11±5.436.76中劑量組0.154.69±0.5240.56±4.1227.43高劑量組0.35.13±1.1838.56±7.50?31.00

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05,**P<0.01.

牛皮杜鵑葉乙醇提取物三個(gè)劑量組與生理鹽水組比較，均能減少小鼠的扭體次數(shù)并能提高抑制率，均較阿司匹林組弱；其中高劑量組差異顯著(p<0.05)，低劑量組和中劑量組無顯著性變化(p>0.05)(見表5).

4 討論

本文通過耳腫脹實(shí)驗(yàn)、足腫脹實(shí)驗(yàn)、腹腔毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)研究牛皮杜鵑葉乙醇提取物對炎癥早期的抗性，結(jié)果表明，牛皮杜鵑葉乙醇提取物對二甲苯致小鼠耳廓腫脹、甲醛致小鼠足腫脹及冰醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)均有一定的抑制作用，且與給藥劑量呈正相關(guān)關(guān)系，即高劑量組的抗炎作用最明顯(P<0.01).

疼痛是由于痛覺感受器受到刺激而產(chǎn)生興奮,沖動(dòng)經(jīng)傳入神經(jīng)纖維到達(dá)大腦某些神經(jīng)細(xì)胞,或中樞通路的某一水平受損時(shí)所產(chǎn)生的一種不舒適的感覺.疼痛會(huì)給患者帶來生理和心理的折磨.同時(shí)會(huì)打亂機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的正常運(yùn)行,使胃腸功能紊亂,降低人們的生活質(zhì)量[19].因此緩解和減輕疼痛成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究者廣泛關(guān)注的問題. 熱板法可制備經(jīng)典的快痛實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，而醋酸扭體法可以制備慢性持續(xù)疼痛模型，本文采用這兩種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯εＦざ霹N葉乙醇提取物的鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，牛皮杜鵑葉乙醇提取物對小鼠熱板致痛產(chǎn)生的快痛具有抑制作用，同時(shí)對小鼠慢性持續(xù)性疼痛也有抑制作用，在鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)中顯示鎮(zhèn)痛作用隨給藥劑量的增加而增強(qiáng).

因此,牛皮杜鵑葉乙醇提取物有一定的抗炎鎮(zhèn)痛效果，但是其抗炎鎮(zhèn)痛作用機(jī)理及有效成分的分析鑒定還有待于進(jìn)一步的研究， 以期為牛皮杜鵑的進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù).