化痰通絡方對急性腦梗死大鼠rt-PA溶栓后神經細胞自噬途徑中Beclin1與LC3蛋白表達的影響*

張琳琳，周　震，張玉蓮，王雪巖，王　坤，王　凱

化痰通絡方對急性腦梗死大鼠rt-PA溶栓后神經細胞自噬途徑中Beclin1與LC3蛋白表達的影響*

張琳琳1，周震1，張玉蓮1，王雪巖2，王坤2，王凱2

（1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津300150；2.天津中醫(yī)藥大學，天津300193）

［目的］觀察化痰通絡方對急性腦梗死大鼠重組組織纖溶酶原激活劑（rt-PA）溶栓后神經細胞自噬途徑中自噬相關蛋白（Beclin1）及微管相關蛋白輕鏈3（LC3）蛋白表達的影響。［方法］選擇160只健康SD大鼠，隨機分為假手術組、模型組、rt-PA組、化痰通絡方聯(lián)合rt-PA組（簡稱中藥組），每組采用6 h、1 d、3 d和7 d 4個時相。采用自身栓子法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型（MCAO），rt-PA組與中藥組分別給予尾靜脈注入rt-PA（濃度為5.67 mg/kg）及聯(lián)合化痰通絡中藥（濃度為7.2 g/kg）干預，每日2次。于相應時間點采用Western blot檢測各組大鼠大腦皮質梗死區(qū)組織中Beclin1及LC3蛋白的表達。［結果］Western blot結果顯示：與假手術組相比，模型組在4個時相中Beclin1和LC3蛋白的相對豐度值均明顯增高（P＜0.05）；采用rt-PA和rt-PA聯(lián)合化痰通絡法干預后，4個時相內Beclin1與LC3蛋白的相對豐度值均明顯下降（P＜0.05）；且rt-PA聯(lián)合化痰通絡組下降更加顯著，與rt-PA組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。［結論］化痰通絡方可通過降低神經細胞自噬途徑中Beclin1與LC3蛋白的表達，部分抑制神經細胞的過度自噬，進而保護神經細胞損傷，從而更好的防治急性腦梗死溶栓后缺血再灌注的發(fā)生與發(fā)展。

化痰通絡方；大鼠重組組織纖溶酶原激活劑；溶栓；急性腦梗死；自噬途徑；自噬相關蛋白；微管相關蛋白輕鏈3

急性腦梗死是一種需要快速診斷和治療的臨床急癥，超早期溶栓是其最有效的治療方法之一［1-2］。而溶栓后缺血再灌注損傷直接限制了溶栓療法的廣泛開展，影響了急性腦梗死的臨床療效，目前尚無有效干預手段，其機制與腦部梗死區(qū)及周圍半暗帶區(qū)神經細胞的壞死與凋亡有關。針對神經細胞死亡以往大都聚焦于凋亡機制的研究，而近幾年，自噬現(xiàn)象成為該領域中的研究熱點。研究表明腦缺血損傷中存在著自噬過度激活，最終導致神經細胞自噬性死亡［3-4］，而此過程與自噬相關蛋白（Beclin1）以及微管結合蛋白輕鏈3（LC3）密切相關［5-6］。

因此本研究觀察化痰通絡方對急性腦梗死大鼠大腦皮質梗死區(qū)Beclin1以及LC3蛋白表達的影響，以期探討其保護神經細胞損傷的可能作用機制。

1　材料

1.1動物健康SD大鼠160只購自北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部 ［許可證號：SZXK（京）2011-00120］，清潔級，雌雄各半，體質量為200～250 g。

1.2藥物化痰通絡方組成：天麻10g，生半夏10g，丹參30 g，膽南星5 g，地龍10 g，川芎10 g，酒大黃5 g。將上述藥物400 g加入10倍水，共煎煮3次，每次30 min，濃縮至500 mL，生藥濃度為0.8 g/mL，以上由天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院制劑室制備，藥物于4℃保存?zhèn)溆?。注射用重組組織纖溶酶原激活劑（rt-PA），購自德國勃林格殷格翰公司（批號005765201304），血栓誘導劑購自長春國奧藥業(yè)有限公司（批號20081218）。

1.3試劑與儀器Anti-LC3抗體（Millipore公司，批號MABC176），Anti-Beclin 1抗體（Millipore公司，批號MAB15417），β-Actin（SANTACRUZ，批號sc-47778），T辣根酶標記羊抗鼠IgG（Millipore公司，批號AP136P），Trizol試劑盒（武漢博士德生物工程公司，批號F0231A），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號P0012A），BCA蛋白濃度試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號P0009）等。

2　方法

2.1模型制備血栓制備參照李杰等［7］方法，隨后參照張新江、劉健等［8-9］方法建立大鼠大腦中動脈栓塞模型（MCAO）。假手術組手術方法同模型制作，只在注射時以生理鹽水0.3 mL代替栓子溶液。

2.2動物分組及處理采用隨機數(shù)字表法將160只大鼠隨機分為假手術組、模型組、rt-PA組、化痰通絡方聯(lián)合rt-PA組（之后簡稱中藥組），共4組，每組分為6、24、72 h與7 d共4個時相，每組每個時相選取10只大鼠。給藥劑量參照文獻［10］中“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算，為7.2 g/kg。中藥組與rt-PA組于血栓注入后3 h由尾靜脈緩慢一次性注入rt-PA（5.67 mg/kg），中藥組聯(lián)合化痰通絡中藥灌胃治療，每日2次，模型組與rt-PA組給予相同時間點等量生理鹽水灌胃，于不同時相對大鼠進行2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉，取缺血區(qū)腦組織以備檢測。

2.3觀察指標檢測Beclin1與LC3蛋白的表達取大鼠梗死區(qū)大腦皮質，提總蛋白質，測定蛋白質濃度。對蛋白樣品進行SDS—PAGE凝膠電泳，轉膜，封閉，加入一抗孵育，4℃靜置過夜。洗滌后加入二抗，孵育，充分洗滌，利用超敏ECL化學發(fā)光試劑盒，借助熒光成像儀觀察相關蛋白的表達。得到圖像結果后應用image J軟件計算各組相對豐度值。

灰度比（GSR）=（測得目的蛋白強度×面積）/（內參蛋白β-actin強度×面積）

2.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結果均以均數(shù)±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LDS法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3　結果

3.1不同時相大腦梗死組織Beclin1蛋白的表達結果顯示同一組內，和6 h相比，除了假手術組3 d之外，其余各組Beclin1蛋白的相對豐度值均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），但均以1 d時相對豐度值為最高，符合腦梗死發(fā)展規(guī)律。同一時相內，與假手術組相比，模型組在4個時相中Beclin1蛋白的相對豐度值均明顯增高（P＜0.05）；與模型組相比，rt-PA組和rt-PA+化痰通絡組在4個時相Beclin1蛋白的相對豐度值均明顯下降（P＜0.05）；與rt-PA組相比，rt-PA+化痰通絡組在4個時相Beclin1蛋白的相對豐度值均明顯下降（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1　不同時相大腦梗死組織Beclin1蛋白的表達Fig.1　The expression of Beclin1 in brain infarction tissue values at different phases in rats

表1　不同時相大腦梗死組織Beclin1蛋白的相對豐度值Tab.1　The relative expression of Beclin1 in brain infarction tissue values at different phases in rats

表1　不同時相大腦梗死組織Beclin1蛋白的相對豐度值Tab.1　The relative expression of Beclin1 in brain infarction tissue values at different phases in rats

注：同一組內和6 h相比，#P＜0.05；同一時相內，和假手術組相比，*P＜0.05；和模型組相比，△P＜0.05；和rt-PA組相比，▲P＜0.05。

組別　1 d　3 d　7 d假手術組　1.03±0.04#　0.94±0.03　0.84±0.05#模型組　1.82±0.21#*1.53±0.07#*　1.33±0.04#* rt-PA組　1.62±0.07#△1.47±0.03#△　1.14±0.03#△n rt-PA+化痰通絡組　1.19±0.05#△▲1.01±0.04#△▲0.95±0.02#△▲10 10 10 10 6 h 0.98±0.04 1.60±0.03* 1.32±0.04△1.09±0.03△▲

3.2不同時相大腦梗死組織LC3蛋白的表達結果顯示同一組內，和6 h相比，模型組1 d、3 d和7 d，rt-PA組3 d和7 d時LC3蛋白的相對豐度值均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），但均以1 d時相對豐度值為最高，符合腦梗死發(fā)展規(guī)律。同一時相內，與假手術組相比，模型組在4個時相中LC3蛋白的相對豐度值均明顯增高（P＜0.05）；與模型組相比，rt-PA組和rt-PA+化痰通絡組在4個時相LC3蛋白的相對豐度值均明顯下降（P＜0.05）；與rt-PA組相比，rt-PA+化痰通絡組在6 h和1 d兩個時相LC3蛋白的相對豐度值均明顯下降（P＜0.05），見圖2、表2。

圖2　不同時相大腦梗死組織LC3蛋白的表達Fig.2　The expression of LC3 in brain infarction tissue values at different phases in rats

4　討論

自噬是凋亡之外的第2種程序性細胞死亡方式，是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程。研究顯示自噬可加重腦損傷，在成年大鼠腦缺血模型中，缺血損傷后大量自噬體和自噬溶酶體產生，應用自噬抑制劑可顯著減小梗死體積，促進神經功能恢復［11］。此外，觀察新生12 d的SD大鼠局灶性腦缺血模型時發(fā)現(xiàn)，再灌注起始3 h后注射自噬抑制劑可減小梗死體積37%～46%，而廣譜胱天蛋白酶抑制劑卻無此作用［12］。故認為腦缺血損傷后主要是通過抑制自噬達到神經保護作用的，在此過程中，LC3與Beclin-1蛋白起關鍵作用［13］。

表2　不同時相大腦梗死組織LC3蛋白的相對豐度值）Tab.2　The relative expression of LC3 in brain infarction tissue values at different phases in rats

表2　不同時相大腦梗死組織LC3蛋白的相對豐度值）Tab.2　The relative expression of LC3 in brain infarction tissue values at different phases in rats

注：同一組內和6 h相比，#P＜0.05；同一時相內，和假手術組相比，*P＜0.05；和模型組相比，△P＜0.05；和rt-PA組相比，▲P＜0.05。

組別　1 d　3 d　7 d假手術組　1.11±0.14　1.00±0.10　1.05±0.04模型組　2.32±0.08#*1.86±0.04#*1.60±0.19#* rt-PA組　1.83±0.12△　1.49±0.06#△1.42±0.07#△rt-PA+化痰通絡組　1.38±0.12△▲1.28±0.10△▲1.39±0.09△n 10 10 10 10 6 h 1.08±0.03 2.16±0.09* 1.79±0.11△1.37±0.16△▲

LC3是酵母Atg8在哺乳動中第一個被鑒別出的類似物，是自噬體形成及胞漿到空泡靶向囊泡必需的蛋白。其定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是細胞自噬泡膜的通用標記物。由于LC3局限在自噬體膜（內膜及外膜）上且LC3的量與自噬體的量呈正相關，現(xiàn)在被廣泛地用作監(jiān)測哺乳動物中的自噬活性和檢測自噬體形成的關鍵分子［14-15］。

Beclin-1是酵母Apg6/Vps30基因的同源物，Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶（PI3K）可與Beclin-1形成復合物參與自噬體的形成［16］。研究指出，Beclin-1-/-小鼠自噬缺陷，細胞凋亡正常，說明Beclin-1是自噬的調控基因［17］。因此，通過免疫印記檢測Beclin-1的表達水平，結合其他生化指標，可對細胞的自噬活性進行動態(tài)監(jiān)測和判斷。

腦梗死屬中醫(yī)學“中風病”范疇。急性缺血性中風主要病機包括痰瘀互結、釀生濁毒，阻閉脈絡、蘊熱擾神。其中風、火、痰、瘀、虛是最常見的證候要素，臨床上常常以兩、三種證候要素相組合為多，急性期則以風、火、痰、瘀為主。國家“十五”科技攻關課題“中風病急性期綜合治療方案研究”（2001BA701A12a）等結果顯示，風痰瘀阻證在缺血性中風急性期中占絕對多數(shù)［18-19］。根據(jù)“急則治其標”的治療原則，早期投用化痰瀉濁、祛瘀通絡方藥切中病機。筆者在臨床對于超早期急性腦梗死風痰瘀阻證患者，采用化痰通絡法聯(lián)合溶栓治療也取得了滿意的療效，但中藥聯(lián)合溶栓治療起效的作用機制是什么，是否和抑制自噬過度激活有關，目前尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)大鼠大腦中動脈栓塞模型梗死組織中LC3和Beclin-1蛋白表達明顯增多，驗證了腦缺血時存在神經細胞的過度自噬，且1 h時達到峰值，這與腦梗死的發(fā)病規(guī)律一致。而采用rt-PA和rt-PA聯(lián)合化痰通絡法干預后，4個時相內Beclin1與LC3蛋白的相對豐度值均明顯下降，且rt-PA聯(lián)合化痰通絡組下降更加顯著，與rt-PA組差異顯著。提示化痰通路法聯(lián)合溶栓療法可有效治療超早期急性腦梗死患者，可能與降低大腦梗死區(qū)Beclin1與LC3蛋白，抑制神經細胞的過度自噬有關。

自噬是一把雙刃劍：一方面過度的自噬可誘導自噬性細胞死亡，并與凋亡信號存在交互作用；另一方面自噬作為自體修復的重要過程，適度激活可能在受損細胞中幫助清除受損的細胞器和異常蛋白、防止蛋白聚集，從而對細胞損傷起保護作用［20］，如何運用好這把雙刃劍，使其更好地為臨床服務，是今后的工作重點。

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（本文編輯：馬英，高杉）

Effects of Huatan Tongluo formulae on expression of Beclin1 and LC3 on gene neuronal autophagy pathway in rat cortex accepted thrombolysis therapy after acute cerebral infarction

ZHANG Lin-lin1，ZHOU Zhen1，ZHANG Yu-lian1，WANG Xue-yan2，WANG Kun2，WANG Kai2
（1.The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300150，China；2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe the effects of Huatan Tongluo formulae on expression of Beclin1 and LC3 on gene neuronal autophagy pathway in rat cortex accepted thrombolysis therapy after the acute cerebral infarction.［Methods］The 160 healthy male SD rats were randomly divided into sham group，model group，rt-PA group，rt-PA-Huatan Tongluo group（Chinese medicine group for short），each group was divided into four time phases:6 hours，1 day，3 days and 7 days.In the corresponding time points prepares the MCAO rat model，the rats in rt-PA group were injected rt-PA（concentration of 5.67 g/kg），and those of Chinese medicine group were given rt-PA and Chinese medicine Huatan Tongluo，2 times a day.Then respectively observe the protein expression of Beclin1 and LC3 by Western Blot.［Results］The results of Western Blot showed:compared with sham group，the expression of Beclin1 and LC3 in model group increased significantly（P＜0.05），compared with model group in the same time phases，the expression of Beclin1 and LC3 decreased in rt-PA group and Chinese medicine group（P＜0.05），especially in Chinese medicine group.［Conclusion］Huatan Tongluo formulae can inhibit the activation of Beclin1 and LC3 on gene neuronal autophagy pathway，and inhibit the nerve cells excessive autophagy at a certain extent，to better prevention and treatment of reperfusion injury after acute cerebra accepted thrombolysis.

Huatan Tongluo formulae；rt-PA；thrombolysis；acute cerebral infarction；autophagy pathway；Beclin1；LC3

R743.33

A

1672-1519（2015）06-0352-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.06.09

國家自然科學基金項目（81273942）；天津市應用基礎及前沿技術研究計劃（12JZDJC25300）；天津市教委“十二五”創(chuàng)新團隊培養(yǎng)計劃資助項目（TD12-5035）。

張琳琳（1984-），女，碩士，醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結合治療腦血管病的臨床與基礎研究。

周震，E-mail：zhouzhen7681@126.com。

（2014-12-28）