大黃魚serC基因的克隆、鑒定以及信息學(xué)分析

劉　浩，黃　偉

（1.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山　316022；2.國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山　316022）

綜述

大黃魚serC基因的克隆、鑒定以及信息學(xué)分析

劉浩1，黃偉2

（1.浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山316022；2.國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山316022）

磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶1（serC）是生物L(fēng)-絲氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，能夠直接催化3-磷酸絲氨酸的合成，以影響多種前體物質(zhì)的合成代謝，目前該基因在海洋魚類中的研究未見報(bào)道。本研究通過對(duì)大黃魚全基因組數(shù)據(jù)庫的比對(duì)與分析，鑒定并克隆了大黃魚serC基因，測序驗(yàn)證其全長。該基因cDNA全長1 581 bp，其中開放閱讀框1 263 bp，共編碼420個(gè)氨基酸。將大黃魚的serC基因氨基酸序列與其它物種進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃魚的serC氨基酸序列比較保守。系統(tǒng)發(fā)育樹表明大黃魚serC基因與三刺魚的親緣關(guān)系最為接近。大黃魚serC基因的組織差異表達(dá)分析采用半定量PCR技術(shù)，結(jié)果表明serC基因在大黃魚肝臟組織中表達(dá)量最高，在腦與鰭組織中表達(dá)較高，其余組織中表達(dá)量都比較低。本研究分析了大黃魚serC基因的表達(dá)特征與進(jìn)化地位，為serC基因家族的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)資料。

大黃魚；serC基因；克?。环肿犹卣?；生物信息學(xué)

大黃魚Pseudosciaena crocea肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富，曾是我國東海“四大海產(chǎn)”之一［1］，但自上世紀(jì)70年代，由于過度捕撈和海域環(huán)境破壞導(dǎo)致群體數(shù)量急劇下降，資源幾近枯竭［2］。后人工養(yǎng)殖大黃魚獲得成功，養(yǎng)殖規(guī)模也逐年擴(kuò)大，但在養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)大黃魚性成熟提前、生長率下降等問題。為了解決這些問題，水產(chǎn)研究者從能量代謝、營養(yǎng)調(diào)節(jié)［12］、相關(guān)基因定位［2］等不同角度對(duì)大黃魚生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究。氨基酸合成與代謝是魚類營養(yǎng)吸收與代謝的重要組成部分［12］，為魚類正常生長發(fā)育提供保證。其中L-絲氨酸作為一種中間代謝產(chǎn)物與前體產(chǎn)物對(duì)大黃魚生長速率與性別分化有著重要意義。

L-絲氨酸是一種非必須氨基酸，參與生物體內(nèi)多種重要的代謝通路，包括甘氨酸、L-半胱氨酸、神經(jīng)遞質(zhì)d-絲氨酸等物質(zhì)的生物合成［3-4］，是多種氨基酸合成的原料與前體產(chǎn)物。同時(shí)L-絲氨酸與生物大腦發(fā)育、神經(jīng)功能［5］等有密切聯(lián)系，而且這種聯(lián)系貫穿于生物的出生存活、生長、發(fā)育［7-9］。且L-絲氨酸廣泛應(yīng)用于藥品、食品和化妝品等多種工業(yè)當(dāng)中。在L-絲氨酸合成過程中的產(chǎn)生的中間產(chǎn)物與衍生物對(duì)疾病治療、人體生理技能調(diào)節(jié)［10］等都有積極作用。

在動(dòng)物體內(nèi)，L-絲氨酸是在細(xì)胞質(zhì)中由磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶1（phosphoserine aminotransferase 1，serC）催化合成［3-4］，是磷酸絲氨酸生物合成通路的第二步反應(yīng)［14］，serC基因是L-絲氨酸合成通路中的調(diào)控點(diǎn)和關(guān)鍵酶，對(duì)于探究L-絲氨酸的合成情況有積極作用。serC基因已經(jīng)在多個(gè)物種被鑒定與分離，包括細(xì)菌［15-17］、酵母［18］、植物［19-21］和動(dòng)物［22-23］當(dāng)中，但有關(guān)魚類serC基因的鑒定與分離仍未見報(bào)道。本文以大黃魚為材料，克隆了serC基因cDNA全長、進(jìn)行了基因結(jié)構(gòu)分析、進(jìn)化樹構(gòu)建、組織差異性表達(dá)以及在不同組織中表達(dá)水平的變化分析，為闡明大黃魚氨基酸代謝通路提供了基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1材料

2013年6月捕獲東極大黃魚養(yǎng)殖基地內(nèi)獲得雄性大黃魚3尾，體重約500 g/尾。各取其腦、性腺、肝臟、脾臟、心臟、胃、肌肉、鰭組織樣品約2 g保存于RNA保存液（上海生工有限公司）中備用，用于提取總RNA。

1.2總RNA的提取與cDNA的合成

將上述樣品轉(zhuǎn)移至Trizol（Invitrogen公司）溶液中，按照SV Total RNA Isolation Kit（Promega公司）試劑盒說明書所述步驟提取各個(gè)樣品總RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。提取的各組織總RNA用Powerscrit reverse transcriptase Kit（Clontech公司）試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA。

1.3RT-PCR

本實(shí)驗(yàn)室測定了大黃魚全基因組，并組建了本地?cái)?shù)據(jù)庫，根據(jù)本地?cái)?shù)據(jù)庫中基因注釋信息，獲得serC基因序列信息設(shè)計(jì)上下游引物serC-F和serC-R，引物信息詳見表1。序列以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，總體系為20 μL。擴(kuò)增調(diào)節(jié)：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，共執(zhí)行28個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束。

表1　PCR引物序列Tab.1　Nucleotide sequences of primers used for PCR

1.4PCR產(chǎn)物的回收與測序

使用2%的瓊脂糖電泳回收PCR產(chǎn)物，連接至克隆載體pMD-18T（Takara公司），轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒（試劑盒購自O(shè)mega公司）后進(jìn)行測序（上海生工有限公司）。

1.5序列分析

利用軟件DNAman對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析，確認(rèn)大黃魚serC基因的全長cDNA序列。在NCBI上利用在線序列保守區(qū)域預(yù)測工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）對(duì)大黃魚serC基因進(jìn)行預(yù)測。利用SMS網(wǎng)站（http：//www.bio-soft.net/sms/index.html）將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列并預(yù)測了蛋白質(zhì)的分子量大小與等電點(diǎn)。使用SignalP 3.0在線服務(wù)器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）檢測蛋白的信號(hào)肽序列。利用亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)服務(wù)器預(yù)測了蛋白的亞細(xì)胞定位（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/TargetP/）與轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)（http：//antheprot-pbil.ibcp.fr/）。利用Clustal X軟件將該氨基酸序列與部分其他物種的serC蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源對(duì)比，系統(tǒng)進(jìn)化樹由MEGA 4.0軟件構(gòu)建，使用的構(gòu)建方法是鄰位法（NJ，Neighbor-Joining）。

1.6半定量PCR

使用半定量PCR的方法粗略檢測serC基因在大黃魚各組織中的表達(dá)情況，根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)引物Semi-F和Semi-R（表1），PCR產(chǎn)物長度為750 bp。PCR擴(kuò)增條件：94℃ 預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；56℃退火45 s；72℃延伸45 s，共執(zhí)行28個(gè)循環(huán)，72℃最終延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束。使用1.5%瓊脂糖凝膠檢測半定量PCR結(jié)果。

2　結(jié)果

圖1　A：大黃魚serC基因編碼區(qū)氨基酸序列全長與cDNA序列全長B：serC基因氨基酸序列保守區(qū)域預(yù)測Fig.1　A：The amino acid and cDNA sequences of serC gene from Pseudosciaena crocea.B：Conserved domain prediction of serC gene determined by NCBI.（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）

2.1大黃魚serC基因cDNA全長與序列分析

對(duì)PCR擴(kuò)增（引物為SerCF、SerC-R）獲得的產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果確認(rèn)長為1 581 bp的片段，包括27 bp的5′非翻譯區(qū)（5′UTR）和291 bp的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）。與大黃魚基因組測序結(jié)果一致。圖1為serC基因全長與保守區(qū)域預(yù)測。

該基因開放閱讀框（ORF）長度為1 263 bp，編碼420個(gè)氨基酸。預(yù)測的其分子量大小為46.61 kD，恰好在40～48 kD之間［11，27］，符合前人的研究結(jié)果，其等電點(diǎn)為6.85。序列保守區(qū)域預(yù)測顯示serC基因包含有一個(gè)磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)是serC基因家族的特征，也證明了從大黃魚中克隆出來的序列屬于天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超家族［28］。利用在線Signal軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）對(duì)其編碼區(qū)氨基酸序列進(jìn)行分析，沒有發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽。說明serC基因編碼的蛋白屬于非分泌型蛋白?？缒さ鞍追治觯╤ttp：//antheprot-pbil.ibcp.fr/）顯示該蛋白在第296到301個(gè)氨基酸之間存在著跨膜結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸分別是半胱氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和異亮氨酸。蛋白亞細(xì)胞定位（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）證明該蛋白在線粒體發(fā)揮作用（Loc：M Reliability class：5）。

圖2　SerC基因的結(jié)構(gòu)組成分析Fig.2　Structure comparison and analysis of serC gene

在對(duì)研究了多個(gè)物種的serC基因結(jié)構(gòu)后，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示大多數(shù)物種的serC基因尤其是硬骨魚類，其CDS都是由8個(gè)外顯子組成，而且其中三個(gè)外顯子都是位于基因組序列的4～7 kb之間，且具有相似的長度與幾乎相同的排列結(jié)構(gòu)，這說明了serC基因家族在進(jìn)化歷程中相當(dāng)保守。筆者還發(fā)現(xiàn)磷酸吡哆醛連接位點(diǎn)作用于底物的特定氨基酸殘基、NCBI預(yù)測的保守區(qū)域都是普遍定位于此三個(gè)外顯子序列中。這證明了這三個(gè)外顯子擁有較高的酶活，是serC基因的催化位點(diǎn)和關(guān)鍵區(qū)域。

圖3　serC基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3　Phylogenetic tree analysis of serC gene

在NCBI上將編碼區(qū)氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與斑馬宮麗魚Maylandia zebra的serC序列有91%的一致性，與人Homo sapiens的序列一致性僅為73%。從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中選取具有代表性的各類物種27種，包括細(xì)菌、植物、無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物，將細(xì)菌M.tuberculosis設(shè)為外群，用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用的是NJ（Neighbor-Joining）法，設(shè)置重復(fù)次數(shù)10 000次（bootstrap test 10 000 replications），結(jié)果見圖3。從進(jìn)化樹的結(jié)果來看，大黃魚在進(jìn)化關(guān)系上與三刺魚G.aculeatus最為接近，聚為一支。而且鱸形目的三種硬骨魚類自行聚成了一支，分別是大黃魚P.crocea、羅非魚O.niloticus和斑馬宮麗魚。同樣鲀形目也自行聚成了一支，分別是紅鰭東方鲀T.rubripes和斑點(diǎn)綠河豚T.nigroviridis。進(jìn)化樹結(jié)果能夠?qū)⑽锓N以脊椎動(dòng)物、非脊椎動(dòng)物、植物、細(xì)菌與真菌分成5類，與經(jīng)典分類學(xué)有相似的結(jié)構(gòu)，其可信度較高。

2.2serC基因在大黃魚不同組織中的表達(dá)差異分析

半定量PCR的結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示serC基因在大黃魚的肝臟（第三組）中有較強(qiáng)的表達(dá)，在心臟（第五組）和肌肉（第七組）中沒有表達(dá)，在大腦（第一組）和鰭（第八組）組織中表達(dá)量比較高。serC基因在肝臟中的高表達(dá)可能與肝臟中豐富的轉(zhuǎn)氨酶系和氨基酸合成通路有關(guān)。

圖4　半定量檢測serC基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.4　Relative expression of serC gene in various tissues in P.crocea by semi-RT PCR

3　討論

目前對(duì)于serC基因的研究多見于哺乳動(dòng)物和昆蟲等，在魚類方面對(duì)此基因知之甚少。serC是L-絲氨酸合成的關(guān)鍵酶，serC基因活性是生物體內(nèi)氨基酸合成通路的一個(gè)重要作用因子。serC基因編碼的蛋白質(zhì)是由兩個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基都是由一個(gè)大的磷酸吡哆醛連接區(qū)域和一個(gè)比較小的區(qū)域包括碳端的末尾部分和氮端的一小部分［14］。本研究通過分子克隆技術(shù)得到了大黃魚serC基因全長cDNA序列，其開放閱讀框所推導(dǎo)的氨基酸序列與脊椎動(dòng)物有75%～91%的序列一致性；與無脊椎動(dòng)物有61%～72%的序列一致性；和植物有大約53%的序列一致性；與細(xì)菌有48%的序列一致性；與真菌只有45%的序列一致性，這說明了serC基因家族編碼的蛋白有比較高的相似度，即該基因在漫長的進(jìn)化歷史中是比較保守的，這也顯示了serC基因和氨基酸代謝對(duì)于生物存活的重要性。對(duì)其功能結(jié)構(gòu)位點(diǎn)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)（圖5）在序列極端保守區(qū)域存在著磷酸吡哆醛結(jié)合區(qū)域（雙下劃線部分）。這種基序是serC基因家族的保守區(qū)域和重要功能作用位點(diǎn)，是其活性所必須的多肽位點(diǎn)［29］。這也說明了本次克隆得到的序列確是屬于天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超家族。有研究［29-31］表明，第195號(hào)賴氨酸是吡哆醛磷酸化的關(guān)鍵結(jié)合氨基酸，可以結(jié)合底物催化反應(yīng)進(jìn)行。195號(hào)賴氨酸所處的區(qū)域也是serC基因最保守的區(qū)域之一。多重序列比對(duì)中值得注意的是大黃魚serC基因在碳端比其他物種的serC基因多了55個(gè)氨基酸（圖5左上方框），而且在serC基因一處比較保守處（圖5右上方框），大黃魚卻缺失了這一段氨基酸序列。推測可能在大黃魚演化過程中經(jīng)歷過獨(dú)特進(jìn)化事件，尚待進(jìn)一步研究。

圖5　大黃魚serC基因的氨基酸序列與相關(guān)物種的serC基因多重比對(duì)Fig.5　SerC amino acid multiple alignment between P.crocea and other species

L-絲氨酸因參與多種神經(jīng)、大腦發(fā)育分化調(diào)控，生長速率調(diào)節(jié)，逐漸引起研究者的興趣，在催化合成L-絲氨酸的過程中，serC基因催化3-磷酸羥基丙酮酸至L-磷酸絲氨酸的可逆反應(yīng)，是催化L-絲氨酸合成初始步驟的關(guān)鍵酶。對(duì)魚類的許多生理過程特別是生長速率具有重要調(diào)節(jié)作用。在本研究中發(fā)現(xiàn)serC基因在肝臟中表達(dá)量較高，在其他組織中表達(dá)量比較低，說明serC基因的主要生理功能就是在肝臟中催化各類轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)（包括絲氨酸轉(zhuǎn)氨基），證明了肝臟是主要的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的發(fā)生器官。

本研究成功獲得了大黃魚serC基因的全長cDNA序列，通過分析其在各組織中的表達(dá)水平、基因結(jié)構(gòu)、來探究該基因的表達(dá)模式。構(gòu)建了serC基因的進(jìn)化樹，分析了其在進(jìn)化中的特點(diǎn)和地位，為以后深入研究此家族基因打下了一定基礎(chǔ)。

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Identification and Characterization of A Phosphoserine Aminotransferase 1 cDNA in Pseudosciaena crocea

LIU Hao1，HUANG Wei2
（1.Marine Science and Technology School of Zhejiang Ocean University Zhoushan316022；2.China National Engineering Research Center for Marine Aquaculture，Zhoushan316022，China）

Phosphoserine aminotransferase 1 is a key enzyme in synthesing L-serine.This enzyme has great influence on metabolism of many precussor substances by catalyze 3-phosphoserine，which has not been reported in marine teleost.In this study，a phosphoserine aminotransferase 1（serC）gene from large yellow croaker（Pseudosciaena crocea）was isolated and characterized by searching and aligning the whole genome database of P.crocea.The overall cDNA length is 1 581 bp，containing an open reading frame of 1 263 bp，encoding 420 amino acids.According to the multiple alignment analysis，the amino acids sequence of serC was relatively conserved.Phylogenetic tree is built to show the genetic distance of serC with other species.The result showed serC from P.crocea is most genetically closed to Gasterosteus aculeatus with a 91.46% similarity.RT-PCR was conducted to check serC in tissue expression.The result showed the most abundant serC expression is in liver，and brain and fin tissue have high expression.In this study serC gene of P.croceawas identified and characterized，which might contribute to the further research on the serC family genes.

Pseudosciaena crocea；phosphoserine aminotransferase 1；gene clone；chracterization；bioinformatics

S917.4

A

1008-830X（2015）03-0209-07

2015-02-20

科技部國際科技合作港澳臺(tái)項(xiàng)目（2014DFT30120）

劉浩（1989-），男，浙江舟山人，碩士研究生，研究方向：魚類功能基因.E-mail：lh_zccnmjb@163.com

黃偉（1978-），男，湖北武漢人.E-mail：huangwei@zjou.edu.com