篩選高表達(dá)CPEΔN的H1299肺癌細(xì)胞株

孫靜 張桂榮 王虹月 申慧

羧肽酶E（carboxypeptidase E, CPE）是一個(gè)金屬離子依賴的肽鏈端解酶，它的生物學(xué)功能非常多元化。按照亞細(xì)胞定位的差異，CPE的功能可以被分為外肽酶功能和非酶功能兩類[1]。第一部分CPE是以分泌形式表達(dá)的，這部分CPE主要分布在內(nèi)分泌及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，他們可以將激素原或神經(jīng)多肽裂解為成熟的激素或神經(jīng)肽，進(jìn)而調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)[2-8]。第二部分CPE是以非分泌性形式存在的，他們或者結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)膜上參與高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)過程[9]；或者定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這部分CPE蛋白的功能是多元的，也是目前最受關(guān)注的。

近年研究者采用信使RNA（messenger RNA, mRNA）芯片技術(shù)分析了CPE在不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示在神經(jīng)內(nèi)分泌起源的腫瘤組織如成神經(jīng)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤中CPE的高表達(dá)預(yù)示腫瘤具有較好的預(yù)后[10-12]，而在一些非內(nèi)分泌的腫瘤如乳腺癌、腎細(xì)胞癌、宮頸癌中[13-17]，CPE的高表達(dá)常常預(yù)示著患者的生存期短、預(yù)后差。在不同起源的腫瘤組織中CPE的功能是矛盾的且不明朗。2011年香港大學(xué)Lee的一項(xiàng)研究給我們帶來了新的啟示，他們?cè)诟渭?xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)一種截短形式的CPE蛋白即CPE△N，他可以作為一個(gè)獨(dú)立性指標(biāo)，預(yù)測(cè)肝癌和嗜鉻細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[18,19]。CPE△N能夠與組蛋白去乙酰化酶1和組蛋白去乙?；?結(jié)合進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白NEDD9的表達(dá)。

2013年周坤等[20,21]在結(jié)直腸癌中也發(fā)現(xiàn)了CPE△N的表達(dá)，并且證實(shí)在腫瘤組織中只有截短形式的CPE△N表達(dá)，CPE△N高表達(dá)的病例復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高于CPE△N低表達(dá)病例。肝細(xì)胞癌、嗜硌細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌是起源不同的三種腫瘤類型，CPE△N高表達(dá)可以預(yù)測(cè)三者的復(fù)發(fā)，提示CPE△N很可能是一個(gè)廣譜的腫瘤預(yù)測(cè)分子。

在本研究室的前期工作中，我們?cè)?個(gè)肺癌細(xì)胞株中檢測(cè)到CPE△N的表達(dá)，并且證實(shí)CPE△N的表達(dá)可以加速肺癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步明確CPE△N促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移的易發(fā)部位，并揭示其可能分子機(jī)制，本研究選取CPE△N蛋白表達(dá)量最少的肺癌細(xì)胞株H1299作為母細(xì)胞，篩選得到了共表達(dá)熒光素酶和CPEΔN的H1299肺癌細(xì)胞株，并證實(shí)CPEΔN高表達(dá)細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株均可以有效分解熒光素酶底物，可以用于后期的小鼠活體成像實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 慢病毒載體pCMV-GFP-LV、pLenti-CMV-MCSHA-3Flag-P2A-LUC-T2A-Puro和慢病毒包裝試劑盒購自上海禾元生物；高保真酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生物；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶來自美國NEB公司；SYBR Premix EX Taq試劑盒購自TaKaRa，感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自TaKaRa；H1299細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青、鏈霉素購自天根生物；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000購自Invitrogen，嘌呤霉素（Puromycin）購自翊圣公司，雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自Promega。

1.2 方法

1.2.1 確定慢病毒載體對(duì)H1299細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率 將 H1299細(xì)胞接種到24孔板中，細(xì)胞數(shù)為1×104/孔。約16 h后，用帶熒光標(biāo)記的慢病毒載體pCMV-GFP-LV轉(zhuǎn)染H1299。病毒量按如下公式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)×感染倍數(shù)（multiple of infection, MOI）值/病毒原液滴度×103=病毒加藥量。本研究的MOI值共設(shè)計(jì)了5個(gè)梯度，分別是MOI 10、MOI 20、MOI 40、MOI 80和MOI 100。完成轉(zhuǎn)染后加入puromycin，使其終濃度為5 μg/mL，20 h后更換為新鮮培養(yǎng)基。72 h后熒光顯微鏡拍照，確定最佳感染條件。

1.2.2 構(gòu)建CPEΔN慢病毒表達(dá)載體 CPEΔN正向引物為CGAGCTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGAGGCG GCGCCGGCG（含同源重組序列、kozak序列、EcoR I酶切位點(diǎn)和目的基因5’端配對(duì)序列）；反向引物為：TCATCCTTGTAGTCGGATCCAAAATTTAAAGT TTCTGACATCAT（含同源重組序列、BamH I 酶切位點(diǎn)，目的基因3’端配對(duì)序列）。擴(kuò)增CPEΔN基因后，用EcoR I和BamH I酶切處理，之后與相同酶切處理的pLenti-CMV-MCS-HA-3Flag-P2A-LUC-T2A-Puro載體進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR篩選陽性克隆，之后酶切鑒定并驗(yàn)證表達(dá)。

1.2.3 篩選H1299-CPEΔN和H1299-control細(xì)胞株 將H1299細(xì)胞接種到24孔板中，細(xì)胞數(shù)為1×104/孔，細(xì)胞匯合度約30%；16 h后分別轉(zhuǎn)染CPEΔN慢病毒表達(dá)載體或慢病毒空載體，MOI值取20，Puromycin終濃度為5 μg/mL，24 h后換液，棄去培養(yǎng)基每孔加入500 μL的新鮮培養(yǎng)基。72 h以后，加入含2 μg/mL puromycin的新鮮培養(yǎng)基。每隔2-3天換液1次，藥物篩選約14 d。獲得高表達(dá)CPEΔN和對(duì)照慢病毒載體的H1299肺癌細(xì)胞系（分別命名為H1299-CPEΔN和H1299-control）。通過Real-time PCR和Western blot分析CPEΔN的表達(dá)，并凍存H1299-CPEΔN和H1299-control細(xì)胞株。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 按照熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明，裂解H1299-CPEΔN和H1299-control細(xì)胞株，檢測(cè)二者分解熒光素酶底物的活性。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體可以高效感染H1299肺癌細(xì)胞 為了分析慢病毒載體對(duì)H1299細(xì)胞的感染效率、優(yōu)化感染條件，本研究選擇了一個(gè)帶綠色熒光蛋白，并且轉(zhuǎn)染效率和pLenti-CMV-MCS-HA-3Flag-P2A-LUC-T2A-Puro相同的慢病毒載體pCMV-GFP-LV作為研究對(duì)象。設(shè)計(jì)了MOI 10、MOI 20、MOI 40、MOI 80、MOI 100共5個(gè)病毒轉(zhuǎn)染梯度，結(jié)果顯示當(dāng)MOI 20、MOI 40、MOI 60、MOI 80、MOI 100時(shí)感染效率都達(dá)到80%以上（圖1）。本著高效、低毒的原則，選擇MOI 20作為后續(xù)病毒感染的最佳條件。

圖1 分析不同MOI條件下，慢病毒載體對(duì)H1299細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率Fig 1 The transfection efficiency of lentiviral vector in H1299 cells at different multiple of infection (MOI)

圖2 CPEΔN表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定。A：左圖：菌落PCR鑒定重組CPEΔN表達(dá)載體。陰性對(duì)照（第1道），陽性對(duì)照（第2道），挑取8個(gè)菌落克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定（3道-10道）；右圖：酶切鑒定重組CPEΔN表達(dá)載體；B：Western blot和Real-time PCR分析CPEΔN蛋白在CPEΔN高過表達(dá)細(xì)胞系和對(duì)照H1299細(xì)胞系中的表達(dá)；C：報(bào)告基因檢測(cè)分析H1299-CPEΔN和H1299-control細(xì)胞株中熒光素酶活性。Fig 2 Construction and identification of human CPEΔN expression vector. A: Left picture, Identification of recombinant CPEΔN expression vectors using colony PCR. Negative control (lane 1), positive control (lane 2), 8 colonies picked for colony-PCR identification (lanes 3-10). Right picture,identification of recombinant CPEΔN expression vectors by restriction enzyme; B: Analysis of CPEΔN expression by Western blot and real-time PCR in H1299-CPEΔN cells and H1299-control cells; C: Luciferase reporter gene assay in H1299-CPEΔN cells and H1299-control cells.

2.2 分析CPEΔN蛋白的表達(dá)并確定其對(duì)熒光素酶底物的分解活性 通過菌落PCR和酶切鑒定，證實(shí)pLenti-CMVMCS-HA-3Flag-P2A-LUC-T2A-Puro-CPEΔN慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖2A）。加入嘌呤霉素加壓篩選14 d后，獲得了H1299-CPEΔN和H1299-control細(xì)胞株。通過Western blot和Real-time PCR檢測(cè)兩個(gè)細(xì)胞株中CPEΔN的表達(dá)。結(jié)果如圖2B所示，二個(gè)細(xì)胞系中CPEΔN蛋白表達(dá)量約為4:1（凝膠灰度掃描結(jié)果），CPEΔN mRNA的比值約為2:1。

分析兩個(gè)細(xì)胞系對(duì)熒光素酶底物的分解作用，每組取1×104個(gè)細(xì)胞，CPEΔN高表達(dá)細(xì)胞株的luciferase均值為19,891,000，對(duì)照慢病毒載體細(xì)胞株的luciferase均值為18,281,000（圖2C），二者分解熒光素酶底物的能力沒有顯著差異。提示篩選到的H1299-CPEΔN細(xì)胞株在表達(dá)CPEΔN的同時(shí)，能夠有效地分解熒光素酶底物可以用于后續(xù)的活體成像實(shí)驗(yàn)。

3 討論

CPEΔN是2011年被鑒定出來的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白。Lee等[18]證實(shí)在所有肝癌病例只表達(dá)CPE△N。當(dāng)癌和癌旁正常組織CPE△N RNA比值＞2，術(shù)后2年復(fù)發(fā)率高達(dá)92.8%，中位生存時(shí)間為8.6個(gè)月；而癌和癌旁CPE△N RNA比值＜2的病例，術(shù)后2年復(fù)發(fā)率只有25.2%，中位生存時(shí)間超過90個(gè)月，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2013年Zhou等[20]再次證實(shí)CPEΔN的高表達(dá)可以作為獨(dú)立性指標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌的預(yù)后不良。在這些文獻(xiàn)的提示下，本課題組分析了CPEΔN表達(dá)與肺腺癌預(yù)后的相關(guān)性也得到相似結(jié)論結(jié)果將在另外文章發(fā)表。

為了探索CPEΔN過表達(dá)，是否像我們預(yù)測(cè)的那樣可以加速腫瘤細(xì)胞向腦、肝臟或骨組織這些代謝、增殖旺盛的區(qū)域轉(zhuǎn)移，本課題設(shè)計(jì)了小鼠活體成像實(shí)驗(yàn)。為了盡可能地追蹤腫瘤細(xì)胞去向，去除動(dòng)物本底干擾，我們選擇了一個(gè)經(jīng)過改造的慢病毒表達(dá)載體。選擇用這個(gè)表達(dá)載體主要基于3個(gè)考慮：①慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到80%-90%，并且這種基因整合可以隨著細(xì)胞分裂被傳遞到子代；②這個(gè)載體將目的基因和熒光素酶基因偶聯(lián)在同一個(gè)啟動(dòng)子上，可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩種蛋白，不必同時(shí)轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒再用兩種抗生素加壓篩選，方法學(xué)上簡單、易行；③小鼠體內(nèi)不表達(dá)熒光素酶，這樣可以最大程度的去除本底。通過腹腔內(nèi)注入熒光素酶底物，在30 min能夠清晰顯示腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的分布情況。據(jù)報(bào)道通過熒光檢測(cè)技術(shù)可以追蹤到腹腔種植少量的腫瘤細(xì)胞，這個(gè)方法很適合觀察微小轉(zhuǎn)移灶。

在本研究中，我們沒有選取單克隆而是選擇了多克隆CPEΔN高表達(dá)細(xì)胞株。作者認(rèn)為這種方式可以更直接的體現(xiàn)CPEΔN蛋白過表達(dá)賦予細(xì)胞的功能改變，而不是某一株單克隆細(xì)胞系的個(gè)性化行為，并且這種篩選方式可以節(jié)約成本，節(jié)省時(shí)間[22,23]。分析熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果，可以看到H1299-CPEΔN和H1299-control兩個(gè)細(xì)胞株降解熒光素酶底物的能力沒有差異。這個(gè)工作的完成將為進(jìn)一步確證CPEΔN促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移提供動(dòng)物水平佐證。CPEΔN蛋白有希望成為新的肺癌轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)分子，用于腫瘤的個(gè)性化診斷和治療。