萊菔承氣湯對重癥急性胰腺炎大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響*

宋寶驥，付金鵬，李家瑞（.天津市天津醫(yī)院普通外科，天津300；.天津市天津醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，天津300）

萊菔承氣湯對重癥急性胰腺炎大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響*

宋寶驥1，付金鵬1，李家瑞2
（1.天津市天津醫(yī)院普通外科，天津300211；2.天津市天津醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，天津300211）

［目的］探討中藥萊菔承氣湯對重癥急性胰腺炎（SAP）大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及凋亡基因Bax和Bcl-2表達(dá)的影響。［方法］健康Wistar大鼠72只，隨機(jī)分為空白對照組（24只）、SAP模型組（24只）和萊菔承氣湯治療組（24只）。3組大鼠均于術(shù)后6 h，12 h，24 h心臟采血，檢測血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）。Annexin V-FITC/PI雙染后流式細(xì)胞術(shù)檢測腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)，RT-PCR檢測腎臟組織Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)。［結(jié)果］與對照組相比較，隨著時間變化，SAP模型組大鼠血肌酐、血尿素氮水平明顯升高（P＜0.01），腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)趨于升高，Bax mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.01）。與SAP模型組相比較，萊菔承氣湯治療組大鼠血肌酐、血尿素氮水平明顯下降（P＜0.01），腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)下降，Bax mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.01），Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。［結(jié)論］中藥萊菔承氣湯可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因，減少腎臟細(xì)胞凋亡以減輕腎臟病理損傷，從而改善SAP時并發(fā)的急性腎功能障礙。

重癥急性胰腺炎；萊菔承氣湯；細(xì)胞凋亡；Bax；Bcl-2

重癥急性胰腺炎（SAP）是一種外科常見危急重癥，發(fā)病急，進(jìn)展快，常在短時間內(nèi)出現(xiàn)多臟器功能障礙，腎臟受累僅次于肺。腎臟功能障礙一旦進(jìn)展為急性腎功能衰竭，患者病死率明顯升高［1］。既往研究表明，應(yīng)用中藥萊菔承氣湯治療重癥胰腺炎可明顯減輕腎臟病理損害［2］，但其作用機(jī)制尚未闡明。本文通過建立SAP模型，探討萊菔承氣湯對SAP大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及凋亡基因的影響，從而為臨床治療SAP提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料萊菔承氣湯購于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中藥房，方劑組成：大黃20 g（后下），芒硝15 g，厚樸15 g，枳殼10 g，萊菔子15 g，木香10 g，牛膝10 g，加水煎制成200 mL藥液；?；悄懰徕c由北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司提供；健康Wistar大鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；IV型膠原酶由Gibco公司提供；引物設(shè)計(jì)和合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供；Trizol購于美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒由美國Fermentas公司提供。

1.2方法

1.2.1動物和模型健康Wistar大鼠72只，體質(zhì)量230～300 g，雌雄各半，將大鼠隨機(jī)分為空白對照組（24只）、SAP模型組（24只）和萊菔承氣湯治療組（24只）。采用5%牛黃膽酸鈉膽胰管內(nèi)逆行注入的方法誘導(dǎo)SAP大鼠模型［2］。對照組開腹后翻動胰腺數(shù)次；SAP模型組和萊菔承氣湯治療組，使用連接微量注射泵的一次性靜脈留置套管針于膽胰管開口處的十二指腸對系膜緣的腸壁穿刺，將套管經(jīng)膽胰管開口處逆行插入膽胰管約1.0 cm，以0.1 mL/min的速度勻速注入5%牛磺膽酸鈉（1 mL/kg）。注畢5 min后拔管，回納十二指腸后關(guān)腹。萊菔承氣湯治療組按3 mL中藥/100 g大鼠體質(zhì)量，于造模后2 h灌胃；空白對照組和SAP模型組于造模后2 h給予等量生理鹽水灌胃。

1.2.2標(biāo)本采集和保存3組大鼠均于術(shù)后6h，12h，24 h麻醉后心臟采血，室溫放置待自然凝固后，離心獲得血清，凍存于-20℃?zhèn)錅y血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）。取血后剖腹，切取雙腎組織，左腎用于腎臟細(xì)胞凋亡檢測，右腎用于總RNA及蛋白提取。

1.2.3血清Cr、BUN測定由自動生化分析儀檢測。

1.2.4腎臟細(xì)胞凋亡檢測采用膠原酶消化法分離大鼠腎臟細(xì)胞［3］。取腎后將腎組織剪成碎塊，然后加入足量的膠原酶消化液，37℃水浴振蕩，充分消化5 min，用吸管反復(fù)吹打，吸取上清液，存于4℃冰箱內(nèi)。剩余組織塊繼續(xù)加入膠原酶消化液，重復(fù)上述步驟，直至組織碎塊完全消化。將所有上清液在4℃、800 r/min離心5 min得沉淀。向沉淀中加入細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，再以500 r/min離心2 min，棄上清液，所得沉淀即為大鼠腎細(xì)胞。按照AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒說明，用4℃PBS洗滌細(xì)胞兩次，用結(jié)合緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×105/ mL～10×105/mL，取95 μL細(xì)胞懸液置于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/FITC和10 μL 20 μg/mL的碘化丙錠溶液，充分混勻，在室溫避光條件下孵育15min，然后在反應(yīng)管中加入400 μL PBS，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6RT-PCR檢測腎臟組織中Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)Trizol一步法提取腎臟組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)為cDNA（日本寶生物試劑盒），熒光定量PCR反應(yīng)條件（美國Bio-Rad公司熒光定量PCR儀）：95℃5min，95℃45s，57℃45s，72℃60s，35個循環(huán)；末循環(huán)72℃10min。大鼠Bax和Bcl-2引物序列如下：Bax：上游：5’-CCG CTG TGC ACC GGG ACA TG-3’，下游：5’-CTC GCG GTG AAG GGC GTC AG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度：196 bp。Bcl-2：上游：5’-GGC ATC TTC TCC TTC CAG-3’，下游：5’-ATC CCA GCC TCC GTT AT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度：441 bp。β-actin：上游：5’-TGACG GGGTC ACCCA CACTG TGCCC ATCTA-3’，下游：5’-CTAGA AGCAT TGCGG TGGAC GATGG AGGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度：666 bp。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料資料經(jīng)分析均呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較時，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.13組大鼠血Cr變化與對照組相比，SAP模型組血Cr明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與SAP模型組相比，萊菔承氣湯治療組血Cr明顯降低，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。3組大鼠血Cr水平見表1。

2.23組大鼠血BUN變化與對照組相比，SAP模型組血BUN明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與SAP模型組相比，萊菔承氣湯治療組血BUN明顯降低，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。3組大鼠血BUN水平見表2。

表1　3組大鼠血Cr水平（±s）Tab.1　The Cr level of blood in three groups（±s）μmol/L

表1　3組大鼠血Cr水平（±s）Tab.1　The Cr level of blood in three groups（±s）μmol/L

注：*P＜0.01，*與對照組相比較，#與SAP模型組相比較。

分別12 h24 h對照組036.40±03.04037.79±04.52 SAP模型組188.59±12.76a264.03±16.97*萊菔承氣湯治療組102.12±10.85b151.64±11.66#F值26.928*30.856* n 24 24 24 24 6 h 038.49±04.28 110.71±13.63a086.09±9.37b12.572*

表2　3組大鼠血BUN水平（±s）Tab.2　The BUN level of blood in three groups（±s）μmol/L

表2　3組大鼠血BUN水平（±s）Tab.2　The BUN level of blood in three groups（±s）μmol/L

注：*P＜0.01，*與對照組相比較，#與SAP模型組相比較。

組別12 h24 h對照組08.40±2.048.79±1.52 SAP模型組24.59±3.76a30.03±4.97*萊菔承氣湯治療組15.12±2.85b18.64±3.66#F值18.318*22.952* n 24 24 24 24 6 h 08.49±2.28 18.71±3.63a12.09±2.37b10.142*

2.33組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡檢測與對照組相比，SAP模型組腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與SAP模型組相比，萊菔承氣湯治療組腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低，差別統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。3組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)水平見表3。

表3　3組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)水平（±s）Tab.3　The kidney cell apoptosis index in three groups（±s）%

表3　3組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)水平（±s）Tab.3　The kidney cell apoptosis index in three groups（±s）%

注：*P＜0.01，a與對照組相比較，b與SAP模型組相比較。

組別12 h24 h對照組1.02±0.261.08±0.24 SAP模型組16.17±2.68a21.03±3.36a萊菔承氣湯治療組10.82±1.54b14.62±2.32bF值19.322*23.258* n 24 24 24 24 6 h 0.98±0.28 10.26±1.36a6.84±1.04b14.116*

2.43組大鼠腎臟組織（Bax mRNA）的表達(dá)與對照組相比，SAP模型組腎臟組織Bax mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與SAP模型組相比，萊菔承氣湯治療組腎臟組織Bax mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。3組大鼠腎臟組織Bax mRNA的表達(dá)變化見表4。

2.53組大鼠腎臟組織（Bcl-2 mRNA）的表達(dá)與對照組相比，SAP模型組腎臟組織Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與SAP模型組相比，萊菔承氣湯治療組腎臟組織Bcl-2mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。3組大鼠腎臟組織Bcl-2mRNA的表達(dá)變化，見表5。

表4　腎臟組織Bax mRNA的表達(dá)變化（±s）Tab.4　The expression of Bax mRNA in kidney tissue（±s）h

表4　腎臟組織Bax mRNA的表達(dá)變化（±s）Tab.4　The expression of Bax mRNA in kidney tissue（±s）h

注：*P＜0.01，a與對照組相比較，b與SAP模型組相比較。

組別12 h24 h對照組0.67±0.060.66±0.04 SAP模型組2.83±0.49a3.70±0.57a萊菔承氣湯治療組1.52±0.36b1.96±0.42bF值16.276*20.662* n 24 24 24 24 6 h 0.65±0.05 1.98±0.32a0.94±0.28b11.474*

表5　腎臟組織Bcl-2 mRNA的表達(dá)變化（±s）Tab.5　The expression of Bcl-2 mRNA in kidney tissue（±s）h

表5　腎臟組織Bcl-2 mRNA的表達(dá)變化（±s）Tab.5　The expression of Bcl-2 mRNA in kidney tissue（±s）h

注：*P＜0.01，a與對照組相比較，b與SAP模型組相比較。

組別1224對照組1.92±0.351.98±0.39 SAP模型組0.64±0.18a0.58±0.12a萊菔承氣湯治療組1.28±0.16b1.44±0.18bF值14.578*18.766* n 6 24 24 24 24 1.94±0.42 0.72±0.21a1.12±0.15b10.124*

3　討論

近年來，應(yīng)用中西醫(yī)結(jié)合早期治療SAP取得了良好的臨床效果，SAP晚期的并發(fā)癥和病死率顯著下降。SAP初期以非感染性（MODS）為主要表現(xiàn)，中醫(yī)辯證多為少陽陽明合證或陽明腹實(shí)證，嚴(yán)重患者可表現(xiàn)為結(jié)胸里實(shí)證。中醫(yī)藥治療以通里攻下為主。萊菔承氣湯是中醫(yī)下法中的代表方劑，早期應(yīng)用可消除腹脹，早期恢復(fù)腸蠕動，減少腸源性內(nèi)毒素吸收及腸道細(xì)菌移位，防止胰腺及胰周壞死組織感染，可使病人不經(jīng)過進(jìn)展期直接由初期進(jìn)入恢復(fù)期，減少并發(fā)癥的發(fā)生，降低病死率［4］。動物實(shí)驗(yàn)也表明，萊菔承氣湯可降低SAP大鼠血清白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子（TNF）等細(xì)胞因子濃度，同時減輕SAP時合并的多個臟器病理損害［2］。

重癥急性胰腺炎常合并有急性肺損傷和急性腎功能障礙，后者進(jìn)一步發(fā)展為急性腎衰竭，導(dǎo)致患者病死率大幅上升［5］。SAP合并腎損傷是一個多因素參與的復(fù)雜的病理生理過程。既往實(shí)驗(yàn)研究表明，細(xì)胞凋亡參與了SAP時急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展過程。奉鐳等［6］研究發(fā)現(xiàn)，SAP大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高。抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡，對大鼠缺血-再灌注所致的腎損傷有保護(hù)性的作用［7］；誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，可進(jìn)一步加重本身存在的腎損傷［8］。Takase等［9］研究發(fā)現(xiàn)，SAP小鼠造模后6 h，并發(fā)急性腎功能衰竭的小鼠腎臟細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。莊永敬等［10］研究也表明，SAP時大鼠腎臟細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加，凋亡指數(shù)增高，凋亡發(fā)生的部位病理改變明顯，凋亡指數(shù)與腎功能損害呈正相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，隨著時間變化，SAP模型組大鼠血Cr、BUN明顯升高，表明SAP大鼠同時合并有急性腎功能障礙。同時也發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，SAP模型組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高。與SAP模型組相比較，萊菔承氣湯治療組大鼠血Cr、BUN明顯下降，腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低。

細(xì)胞凋亡是受眾多凋亡相關(guān)基因控制的程序性細(xì)胞死亡。Bax是線粒體途徑重要的促凋亡因子，Bax可形成Bax/Bax同源二聚體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bcl-2亞家族對細(xì)胞凋亡起抑制作用，其中Bcl-2控制著凋亡的一些共同通路。Bcl-2可競爭性地與Bax結(jié)合，形成更穩(wěn)定的Bax/Bcl-2異源二聚體，“中和”Bax/Bax誘導(dǎo)凋亡的作用，從而減少細(xì)胞凋亡。下調(diào)Bax的表達(dá)和上調(diào)Bcl-2的表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡［11］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比較，SAP模型組大鼠腎臟Bax mRNA表達(dá)明顯升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯降低。與SAP模型組相比較，萊菔承氣湯治療組大鼠腎臟Bax mRNA表達(dá)明顯下降，Bcl-2mRNA表達(dá)明顯升高。

以上提示，SAP時，腎臟細(xì)胞凋亡增加可能是并發(fā)急性腎功能障礙的原因之一，腎臟細(xì)胞凋亡的增加可能與Bax的過表達(dá)和Bcl-2的低表達(dá)有關(guān)。中藥萊菔承氣湯可能通過下調(diào)Bax mRNA的表達(dá)和上調(diào)Bcl-2mRNA的表達(dá)，減少腎臟細(xì)胞凋亡以減輕腎臟病理損傷，從而改善SAP時并發(fā)的急性腎功能障礙。當(dāng)然，這仍需要更多的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)。

［1］Lin HY，Lai JI，Lai YC，et al.Acute renal failure in severe pancreatitis:A population-based study［J］.Ups J Med Sci，2011，116（2）:155-159.

［2］付金鵬，尤勝義.IL-18與SAP免疫和臟器損害及中藥調(diào)控作用的研究［D］.天津醫(yī)科大學(xué)，2008.

［3］Mückter H，Islambouli S，Doklea E，et al.Isolated rat kidney tubules as a screening system for arsenic antidotes［J］.Toxicol Appl Pharmacol，1993，121（1）:118-128.

［4］吳咸中.腹部外科實(shí)踐［M］.天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2004：1257.

［5］Pupelis G.Renal failure in acute pancreatitis.Timing of dialysis and surgery［J］.Przeql Lek，2000，57（Suppl 5）:29-31.

［6］奉鐳，穆小松，劉翼，等.川芎嗪對重癥胰腺炎大鼠腎細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2013，22（1）：36-39.

［7］Gong L，Yu H，ZhuGe Y，et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalinprotectsrenaltubularepithelialcellinischemic/ reperfusion injury rats via apoptosis-regulating proteins［J］.Ren Fail，2012，34（6）：777-783.

［8］Balasubramanian S，Jansen M，Valerius MT，et al.Orphan nuclear receptor Nur77 promotes acute kidney injury and renal epithelial apoptosis［J］.J Am Soc Nephrol，2012，23（4）：674-686.

［9］Takase K，Takeyama Y，Nishikawa.Apoptotic cell death of renal tubules in experimental severe acute pancreatitis［J］.Surgery，1999， 125（4）：411-420.

［10］莊永敬，于永揚(yáng)，吳貴榮.烏司他丁對重癥急性胰腺炎大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及bcl-2基因表達(dá)的影響［J］.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2007，41（6）：656-659.

［11］He Y，Wan H，Du Y，et al.Protective effect of Danhong injection on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats［J］.J Ethnopharmacol，2012，144（2）：387-394.

（本文編輯：馬英，張震之）

Effect of Laifu Chengqi decoction on the apoptosis of renal cells in rats with severe acute pancreatitis

SONG Bao-ji1，F(xiàn)U Jin-peng1，LI Jia-rui2
（1.Department of General Surgery，Tianjin Hospital，Tianjin 300211，China；2.Department of Emergency Medicine，Tianjin Hospital，Tianjin 300211，China）

［Objective］To investigate the effect of Laifu Chengqi decoction on the apoptosis of renal cells and expression of apoptosis gene Bax and Bcl-2 in rats with severe acute pancreatitis.［Methods］The 72 healthy Wistar rats were randomly divided into control group（24 rats），SAP group（24 rats）and Laifu Chengqi decoction group（24 rats）.Heart blood of rats in the three groups was taken at 6 h，12 h，24 h after operation to detect serum Cr and BUN.Renal cells stained by Annexin V-FITC/PI were drawn off from kidney to detect apoptosis rate using flow cytometer.The expression of Bax and Bcl-2 mRNA in pancreatic tissue were detected by RT-PCR.［Results］Compared with the control group，with the change of time，serum Cr and BUN in SAP group were increased significantly（P＜0.01）.Index of renal cell apoptosis was increased gradually.The expression of Bax mRNA was significantly increased（P＜0.01）.The expression of Bcl-2 mRNA was significantly decreased（P＜0.01）.Compared with the SAP group，serum Cr and BUN in Laifu Chengqi decoction group were decreased（P＜0.01），and index of renal cell apoptosis was decreased.The expression of Bax mRNA was significantly decreased（P＜0.01），the expression of Bcl-2 mRNA was significantly increased（P＜0.01）.［Conclusion］Laifu Chengqi decoction may regulate the apoptosis related gene to decrease the apoptosis of renal cells，thereby reducing renal pathological damage.

severe acute pancreatitis；Laifu Chengqi decoction；cell apoptosis；Bax；Bcl-2

R285.5

A

1672-1519（2015）05-0295-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.11

天津市醫(yī)藥衛(wèi)生重點(diǎn)學(xué)科攻關(guān)項(xiàng)目（10kG118）；天津衛(wèi)生局科研課題基金項(xiàng)目。

宋寶驥（1978-），男，主治醫(yī)師，主要從事普通外科臨床和實(shí)驗(yàn)工作。

（2014-12-05）