宣威肺癌分子流行病學(xué)研究：煤種、基因型與肺癌風(fēng)險(xiǎn)

李繼華 何俊 唐銳 Wei HU Qing LAN 何興舟 李云 張?jiān)粕?/p>

云南宣威是滇東黔西晚二疊世聚煤區(qū)主要產(chǎn)煤地之一，數(shù)百年來當(dāng)?shù)鼐用窬徒∶鹤鳛樽鲲垺⑷∨闹饕钊剂稀?0世紀(jì)70年代全國死因調(diào)查發(fā)現(xiàn)宣威縣是我國肺癌死亡率最高地區(qū)之一，男、女性肺癌死亡率分別是全國平均水平的4倍和8倍[1,2]。一般而言，男性肺癌死亡率通常高于女性，這可能與男性吸煙有關(guān)。當(dāng)?shù)嘏跃用窕静晃鼰?，但肺癌死亡率卻與男性相差不大（1973年-1979年男女肺癌死亡率分別為27.7/10萬和25.3/10萬[3,4]）。早期研究[2-5]表明，居民室內(nèi)使用無煙囪火塘燃燒煙煤產(chǎn)生很高濃度的空氣顆粒物和苯并a芘（benzo[a]pyrene, BaP）以及其他的有機(jī)化合物[1,4]，室內(nèi)燃煤與肺癌之間存在較高的關(guān)聯(lián)。毒理學(xué)研究[6,7]也顯示宣威的煙煤燃燒產(chǎn)物比無煙煤和木柴燃燒產(chǎn)物更具致癌致突變毒性。同時(shí)，研究[3,4]還發(fā)現(xiàn)雖然居民生活同樣使用煙煤，但由于煤源不同，不同地區(qū)（鄉(xiāng)鎮(zhèn)）肺癌死亡率相差數(shù)倍至數(shù)十倍之多；即便是同一地區(qū)不同家族、同家族中有血緣關(guān)系的一級(jí)親屬與配偶家系間肺癌風(fēng)險(xiǎn)差別也很大，肺癌流行具有明顯的家族聚集性[4,8]，在肺癌的發(fā)生過程中基因變異可能起到了重要作用[9,10]。

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）進(jìn)入人體后，大部分經(jīng)混合功能氧化酶代謝生成多種中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物，其中一些代謝產(chǎn)物與DNA共價(jià)形成PAH-DNA加合物，引起DNA損傷，誘導(dǎo)基因突變，甚至誘發(fā)腫瘤形成。多態(tài)性谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase, GST）基因超家族控制了內(nèi)源性和外源物與谷胱甘肽的結(jié)合酶，這些基因在解毒和偶然性外源物激活過程中可能發(fā)揮重要作用。正?；蛟鰪?qiáng)的GST酶活性會(huì)通過這種結(jié)合限制親電性致癌物，從而保護(hù)敏感組織發(fā)生細(xì)胞DNA突變。在GSTM1和GSTT1基因中純合子缺失的載體會(huì)分別呈現(xiàn)出GSTM1和GSTT1酶活性失活，而GSTM1對(duì)PAHs代謝產(chǎn)物有解毒作用，GSTT1對(duì)其他可能的致癌物質(zhì)（例如鹵代甲烷、環(huán)氧乙烷）有解毒作用[11-13]。另外，PAHs至少通過三種代謝途徑產(chǎn)生具有基因毒性的中間產(chǎn)物。這三種途徑都會(huì)發(fā)生堿基G和T的顛換。其中一種途徑涉及到二氫二醇脫氫酶，它是醛酮還原酶（aldo-keto reductase, AKR）超家族中的一員，而且此途徑會(huì)形成DNA加合物和氧自由基（reactive oxygen species, ROS）的中間產(chǎn)物（如8羥基脫氧鳥苷）從而產(chǎn)生DNA氧化損傷[14]。在AKR超家族中，AKR1C3是一種特別重要的酶，它可以代謝含2環(huán)以上的反式二氫二醇[14]。其他重要的酶還包括8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶（8-oxoguanine DNA glycosylase, OGG1），它與堿基切除修復(fù)的氧化損傷修復(fù)途徑有關(guān)[15,16]。研究暴露于高濃度室內(nèi)空氣污染物，特別是暴露于高濃度PAHs的宣威人群，對(duì)于認(rèn)識(shí)基因型與肺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)具有重要價(jià)值。為了深入探索宣威肺癌風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)因素及發(fā)病機(jī)理，我們開展了兩個(gè)基于人群的病例對(duì)照研究分別探討了不同燃料種類和基因型差異與肺癌風(fēng)險(xiǎn)性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 第一個(gè)基于人群的病例對(duì)照研究 第一個(gè)病例對(duì)照研究開展于1985年-1990年，其主要研究目的之一是探索煙煤種類與肺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)。病例是于1985年11月-1990年2月在宣威的4家主要醫(yī)院征集的新診斷肺癌患者，病例的合格條件是：①農(nóng)民；②年齡18歲-85歲；③在診斷前居住在宣威至少1年以上?？偣舱骷?00個(gè)肺癌病例，其中2例由于地址不正確而被剔除。在有效征集的498例肺癌病例中，303例僅經(jīng)過X線胸片和臨床診斷，195例（39%）還經(jīng)痰液或支氣管纖維鏡、手術(shù)或活檢穿刺等細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)診斷。其中51例有組織學(xué)分類的病例中，39%是鱗狀細(xì)胞癌，43%是腺癌，10%為未分化癌，8%為小細(xì)胞癌。

對(duì)照選?。涸诓±\斷4周內(nèi)，采用分層隨機(jī)抽樣法在宣威的20個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)內(nèi)隨機(jī)選擇鄉(xiāng)（公社），然后在鄉(xiāng)內(nèi)隨機(jī)選擇行政村（大隊(duì)），在行政村內(nèi)隨機(jī)抽取自然村（小隊(duì)），最后在自然村隨機(jī)選擇一名性別和年齡（±2歲）與病例匹配的對(duì)照。由于鄉(xiāng)鎮(zhèn)間的人口數(shù)量差異比行政村和自然村大，本研究根據(jù)鄉(xiāng)鎮(zhèn)人口數(shù)占宣威全部鄉(xiāng)鎮(zhèn)總?cè)丝诘谋壤O(shè)計(jì)了各鄉(xiāng)鎮(zhèn)的加權(quán)值（如A鄉(xiāng)人口數(shù)占總?cè)丝诒壤秊?0%，加權(quán)值=0.2；B鄉(xiāng)人口數(shù)占總?cè)丝诒壤秊?0%，加權(quán)值=0.1，抽取鄉(xiāng)級(jí)樣本時(shí)A鄉(xiāng)被選擇的機(jī)率是B鄉(xiāng)的2倍），從而保證在每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)里的對(duì)照研究對(duì)象被選擇的機(jī)率是相似的。

問卷調(diào)查在研究對(duì)象的家中（19%病例和96%對(duì)照）或在醫(yī)院完成（81%病例和4%對(duì)照）。問卷內(nèi)容信息包括生活燃料使用、居住環(huán)境、做飯、室內(nèi)外停留時(shí)間、吸煙、環(huán)境煙草暴露、醫(yī)療、家族惡性腫瘤患病史、飲食方式以及社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況等。對(duì)照和病例的參與率分別達(dá)97%和100%。

在20世紀(jì)80年代，宣威90%以上的居民是農(nóng)民。他們居住情況非常穩(wěn)定，男性一般一生中都生活在同一村莊，而女性一般在結(jié)婚后遷居到其丈夫家里。即使這樣，女性也一般都不會(huì)離開她們出生的鄉(xiāng)鎮(zhèn)。用煤家庭一般每年從離家最近的煤礦購買或采掘煤碳。一般來說，在一生中家庭年用煤量基本不變。累積燃煤量可通過年用煤量與燃煤年數(shù)的乘積得到。根據(jù)當(dāng)?shù)孛旱V地質(zhì)特征分析，本研究將宣威煙煤種類按煤的來源分為10個(gè)不同種類，分別按10個(gè)不同的鄉(xiāng)鎮(zhèn)命名。

1.2 第二個(gè)基于人群的病例對(duì)照研究 為了研究基因型的差異與肺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)，1995年3月-1996年3月間又開展了一次以宣威居民為目標(biāo)人群的病例對(duì)照研究。從宣威的4家主要醫(yī)院和昆明的1家醫(yī)院（經(jīng)這5家醫(yī)院診斷的肺癌患者包括了絕大部分同期被診斷的宣威肺癌病例）共征集了新發(fā)肺癌病例135例，其中參與本研究133例，參與率達(dá)98%。病例的征集條件包括：①經(jīng)細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)檢查確診為肺癌（105例，占78.9%）；或者②研究對(duì)象在1年內(nèi)死亡（17例，12.8%）。對(duì)宣威肺癌病例的隨訪觀察顯示宣威肺癌病例的1年生存率為43.2%，因而本研究采用了1年內(nèi)非其他原因死亡作為對(duì)僅有X胸片和臨床體征病例的補(bǔ)充診斷方法。共有122例肺癌病例滿足這些條件，其中包括24例非小細(xì)胞癌、3例小細(xì)胞癌和8例其他類型肺癌。

在征集的病例獲得診斷后的2周內(nèi)，通過戶口登記系統(tǒng)隨機(jī)在病例所居住的同一村莊選擇一名年齡（±2歲）、性別和目前用來做飯和取暖的燃料種類都匹配的對(duì)照。對(duì)照的參與率為100%。

對(duì)每位參與本研究的研究對(duì)象都進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)問卷調(diào)查，內(nèi)容包括人口統(tǒng)計(jì)學(xué)信息、吸煙史、家庭和個(gè)人醫(yī)療史、用煤量信息等。用煤量通過詢問研究對(duì)象每年購買多少車拖拉機(jī)的煤來估計(jì)噸數(shù)，同時(shí)并詢問用煤量是否有變化。煙煤的累積暴露量通過年用量與使用年數(shù)的乘積計(jì)算得到。

每個(gè)病例和對(duì)照均被采集一份口腔細(xì)胞樣品，用于基因型分型分析。采集時(shí)用牙刷刷取口腔細(xì)胞，然后用生理鹽水沖洗掉牙刷上的細(xì)胞，最后將口腔細(xì)胞放置在另一種含50%乙醇的鹽溶液中于-20 ℃下保存?？谇患?xì)胞中的DNA提取方法參見文獻(xiàn)[17]。GSTM1和GSMTT1基因型的分析采用了基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）的方法[18,19]。此方法在同一放大混合物中同時(shí)使用了GST特異性引物對(duì)和β-球蛋白的第3個(gè)引物對(duì)。GSTM1缺失或GSTT1缺失的特異性片段顯示出空白基因型。β-球蛋白的特異性片段則用于對(duì)PCR是否足量的陽性控制。每個(gè)樣品采樣單盲法分析2次，對(duì)實(shí)驗(yàn)室來說樣品的病例或?qū)φ盏臓顟B(tài)是未知的。

另外，還采集了每位研究對(duì)象的痰液樣品，并用苯酚-三氯甲烷提取了痰樣中的DNA。在122對(duì)病例對(duì)照中，成功地提取了119個(gè)病例和113名對(duì)照的DNA?；蛐蛼呙璨捎肁BI 7900HT系列檢測系統(tǒng)的實(shí)時(shí)PCR法，詳見SNP500的網(wǎng)站[20]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 在分析煤種、GST基因型與肺癌關(guān)聯(lián)性時(shí)采用了條件Logistic回歸分析估計(jì)了比數(shù)比（odds ratios,ORs）及其95%CI。在分析煤種與肺癌關(guān)聯(lián)模式中，根據(jù)先前的研究結(jié)果，本研究以預(yù)計(jì)肺癌風(fēng)險(xiǎn)低的使用無煙煤和木柴的研究對(duì)象作為了參照。煤種模型中包括了使β參數(shù)值改變10%以上的可能混雜因子，或者以前的研究顯示與肺癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)聯(lián)的因子。最終多因素Logistic回歸模型包括了年齡、性別、教育程度、直系親屬肺癌患病史、在家中逗留的累積時(shí)間、肺部疾病史、吸煙及被動(dòng)吸煙暴露史等。另外，還按性別進(jìn)行了煤種與肺癌風(fēng)險(xiǎn)的分層回歸分析。

GST基因型模型中調(diào)整的因子包括使用煙煤、吸煙的包年數(shù)（定義為每日吸煙包數(shù)與吸煙年數(shù)的乘積，假定1支香煙1 g煙草量）、慢性阻塞性肺部疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease, COPD）和家庭成員肺癌史。AKR、OGG1基因型數(shù)據(jù)分析以最常用的基因型為參考，但AKR1C3例外，因?yàn)槠渥畛Ｒ娮冃团cROS的產(chǎn)生有關(guān)聯(lián)。數(shù)據(jù)分析采用了非條件Logistic回歸模型以估計(jì)ORs和95%CIs。調(diào)整的因子有年齡、性別和煙草包年數(shù)。本研究還按性別和煙煤用量分層分析了AKR1C3、OGG1和GSTM1基因型與肺癌的關(guān)聯(lián)性，調(diào)整了年齡、吸煙的包年數(shù)（僅男性）。運(yùn)用了所觀測的基因型頻數(shù)和一個(gè)自由度的χ2檢驗(yàn)，本研究針對(duì)對(duì)照進(jìn)行了遺傳平衡檢驗(yàn)（Hardy-Weinberg equilibriumtest）。

以上所有數(shù)據(jù)分析皆采用了SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件包（SAS Institute, Cary, NC）。

2 結(jié)果

2.1 煤種與肺癌風(fēng)險(xiǎn) 研究對(duì)象出生時(shí)的室內(nèi)燃煤種類與肺癌的分析結(jié)果參見圖1。與燃用無煙煤和木柴相比，燃用煙煤的肺癌風(fēng)險(xiǎn)增高（OR=7.7, 95%CI: 4.5-13.3），其幅度視煙煤的種類不同有很大的變化。按其肺癌風(fēng)險(xiǎn)OR（95%CI）排序，分別為來賓24.8（12.4-49.6）、龍?zhí)?1.6（5.0-27.2）、寶山6.0（2.2-16.7）、龍場4.1（2.0-8.6）、羊場3.8（1.8-8.3）、文興3.8（1.4-10.5）、倘塘2.8（1.2-6.6）、雙河1.1（0.2-4.7）、楊柳0.7（0.2-3.1）、田壩0.6（0.2-1.9）等煙煤。異質(zhì)性檢驗(yàn)顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=5.17×10-10）。

按男女性別分層后的煤種與肺癌風(fēng)險(xiǎn)分析顯示男性和女性的肺癌風(fēng)險(xiǎn)與煤種的關(guān)聯(lián)相似（圖2）。燃用來賓煙煤對(duì)于男性和女性的肺癌風(fēng)險(xiǎn)與燃用無煙煤和木柴相比皆為最高，分別為OR=25.2（95%CI: 9.4-67.3）和26.4（95%CI: 9.6-72.6）；龍?zhí)镀浯?，分別為OR=14.8（95%CI: 4.2-51.5）和9.4（95%CI: 2.8-31.1）。與女性肺癌關(guān)聯(lián)度大的煤種也與男性肺癌有很強(qiáng)關(guān)聯(lián)（男性與女性O(shè)R的Spearman相關(guān)系數(shù)為0.89，P=0.000,5）。另外，按吸煙與未吸煙分層分析顯示肺癌風(fēng)險(xiǎn)在吸煙者與非吸煙者之間相似。本研究對(duì)煤種與肺癌風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)性的分析結(jié)果進(jìn)一步提供了家用不同的煤種的肺癌風(fēng)險(xiǎn)存在較大差異的依據(jù)。

2.2 基因型與肺癌風(fēng)險(xiǎn) 圖3顯示了3種基因型與肺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)關(guān)系。對(duì)于GSTM1缺失基因型（病例組67.2%vs對(duì)照組50.8%）和 AKR1C3（Ex1-70C＞G）、OGG1（Ex6-315C＞G）基因型，本研究發(fā)現(xiàn)肺癌風(fēng)險(xiǎn)明顯增高，且具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR（95%CI）分別為2.3（1.3-4.2）、1.8（1.0-3.5）和1.9（1.1-3.3）]。

對(duì)于家用煙煤累積用量小[＜130 t（對(duì)照組的煙煤累積用量的均值）]，與基因型為GSTM1陽性的研究對(duì)象相比，具有GSTM1缺失基因型的女性肺癌風(fēng)險(xiǎn)OR為2.2（95%CI: 0.5-9.3），男性O(shè)R為1.5（95%CI: 0.6-3.7）；但對(duì)于家用煙煤累積用大（≥130 t）的研究對(duì)象，具有GSTM1缺失基因型的肺癌風(fēng)險(xiǎn)在女性中OR為4.9（95%CI: 1.3-18.2），男性O(shè)R為2.7（95%CI: 1.0-7.4）（表1）。這提示無論男女，GSTM1基因型與燃用煙煤有聯(lián)合效應(yīng)。與GSTM1基因型不同的是，AKR1C3和OGG1基因型僅在燃用煙煤量很高的女性當(dāng)中顯示出明顯的高肺癌風(fēng)險(xiǎn)[OR（95%CI）分別為12.9（2.2-107.8）和5.7（1.1-34.2）]。由于這兩種基因型在BaP的代謝途徑中發(fā)揮重要作用，這提示可能與女性在家里燒火做飯暴露于高濃度的PAHs有關(guān)。

表1 按性別與煙煤用量分層的AKR1C3、OGG1和GSTM1基因型與肺癌風(fēng)險(xiǎn) (ORs和95%CIs）Tab1 AKR1C3, OGG1, and GSTM1 genotype and lung cancer risk (ORs and 95%CIs), by sex and level of the lifetime exposure to smoky coal combustion

圖1 不同煤種的肺癌危險(xiǎn)性Fig1 ORs of lung cancer in relation to coal type

圖2 按性別分層的不同煤種的肺癌危險(xiǎn)性Fig2 ORs of lung cancer in relation to coal type, stratified by gender

圖3 GSTM1缺失基因型和AKR1C3 (Ex1-70C＞G)和OGG1 (Ex6-315C＞G)基因型和肺癌風(fēng)險(xiǎn)Fig3 GSTM1-null, AKR1C3 (Ex1-70C＞G),and OGG1 (Ex6-315C＞G) genotype and lung cancer risk

3 討論

宣威地區(qū)煤田成煤于晚二疊紀(jì)，但由于成煤物質(zhì)、成煤環(huán)境以及后期成煤過程中地壓、地溫及變質(zhì)時(shí)間等多種因素的差異，不同地理位置來源煤種的組分及其燃燒產(chǎn)物變化很大。煤的不完全燃燒可能產(chǎn)生許多揮發(fā)性或不揮發(fā)的可吸入性顆粒，如B(a)P、苯、甲醛等[5]，不同類型煤的使用對(duì)健康的危害主要取決于其組成成分。居民生活使用燃煤的種類不同，所產(chǎn)生的肺癌危險(xiǎn)性有明顯的差別，其中燃煙煤的肺癌風(fēng)險(xiǎn)大于無煙煤和木柴，暴露于來賓、龍?zhí)兜貐^(qū)煙煤的風(fēng)險(xiǎn)明顯高與其他地區(qū)。在男性與女性或吸煙與非吸煙人群間相同煤種暴露的肺癌風(fēng)險(xiǎn)相似，不同煤種的肺癌風(fēng)險(xiǎn)相差較大。這些特點(diǎn)與宣威不同地區(qū)煤種燃燒產(chǎn)生的室內(nèi)環(huán)境B(a)P濃度檢測結(jié)果[2-4]和多次肺癌死亡率調(diào)查結(jié)果相吻合[3,4,21-23]，而且在宣威周邊地區(qū)肺癌與PAHs暴露研究結(jié)果也顯示不同位置來源的煤燃燒產(chǎn)生了不同種類或不同濃度的致癌物[24-27]。其次，本研究為基于農(nóng)村人群的病例對(duì)照研究，人群的居住環(huán)境、生活燃料和燃煤方式相對(duì)穩(wěn)定，并且遠(yuǎn)離汽車尾氣、工業(yè)生產(chǎn)排放污染和職業(yè)暴露，與城市等其他地區(qū)研究相比，受到不可預(yù)測暴露的干擾相對(duì)較小，研究結(jié)果從煤種類型方面加強(qiáng)了宣威肺癌高發(fā)與燃煤污染的關(guān)聯(lián)。

GSTM1、AKR1C3和OGG1等與致癌物質(zhì)解毒、DNA氧化損傷和修復(fù)有關(guān)的酶均與宣威肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。GSTM1缺失基因型與肺癌風(fēng)險(xiǎn)增高有明顯關(guān)聯(lián)，GSTM1基因型缺失人群患肺癌的危險(xiǎn)性是非缺失人群的2.3倍，而且男、女性肺癌風(fēng)險(xiǎn)均隨著家庭生活燃煤量的增加而提高，特別是主要承擔(dān)燒火做飯、日常家務(wù)而在室內(nèi)逗留時(shí)間長、B(a)P等致癌物較高濃度暴露的女性患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)更高。AKR1C3和OGG1基因型與肺癌的關(guān)聯(lián)度相對(duì)較弱，僅在燃用煙煤量大于130 t的女性中顯示出高肺癌風(fēng)險(xiǎn)，而在男性和燃煤量較低的女性人群中沒有顯示出明顯的肺癌風(fēng)險(xiǎn)。以往一些研究表明宣威非吸煙女性肺癌與室內(nèi)燃煤、B(a)P等暴露的風(fēng)險(xiǎn)大于男性[2-4]，女性親屬肺癌家族聚集性風(fēng)險(xiǎn)高于男性親屬[4,8]，本研究在調(diào)整煙煤使用、肺癌家族史等因素后，女性對(duì)基因多態(tài)性的敏感仍高于男性，再次說明煙煤污染對(duì)肺癌的決定作用，宣威地區(qū)人群GSTM1、AKR1C3和OGG1基因型與煙煤用量存在聯(lián)合效應(yīng)。

Wacholder等[28]指出樣本量較小的研究中，得出的關(guān)聯(lián)關(guān)系出現(xiàn)假陽性結(jié)果的可能也較高。由于肺癌患病率以及突變基因型的頻率在自然人群中分布較低，本研究無論從煤種、還是基因型與肺癌關(guān)系研究方面都存在樣本量較小的缺陷。有些煤種因產(chǎn)地范圍窄（局限在個(gè)別鄉(xiāng)鎮(zhèn)）或產(chǎn)量低或?qū)Ψ伟┑奈ｋU(xiǎn)性小，被征集的病例數(shù)過少對(duì)研究的結(jié)果產(chǎn)生一些影響。研究地區(qū)為西部欠發(fā)達(dá)地區(qū)，醫(yī)療資源有限，當(dāng)?shù)乇患?xì)胞學(xué)、組織學(xué)確診的肺癌比例較低（約40%左右），診斷可靠性較低的病例又不便作為基因多態(tài)性研究對(duì)象，所以人群GSTM1、AKR1C3和OGG1基因型研究同樣也受到樣本量和樣本代表性的制約。本研究的結(jié)果尚待更多（尤其是滇東同類地區(qū)）的研究結(jié)果的重現(xiàn)和支持。