MicroRNAs與OCT4基因之間的相互作用

陳琛 孟凡榮 綜述 萬(wàn)海粟 周清華 審校

1 OCT4介紹

哺乳動(dòng)物在胚胎發(fā)育過(guò)程中受著多種基因的嚴(yán)密調(diào)控，以保證其有序地進(jìn)行組織分化和個(gè)體發(fā)育。OCT4基因就是其中一個(gè)關(guān)鍵基因，也被稱(chēng)為OCT3、POU5F1、OTF3或OTF4，是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員[1,2]。人的OCT4基因位于6號(hào)染色體上（6p21.31），長(zhǎng)度為16.40 kb，具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄不同的mRNA亞型（Isoform），從而翻譯成多種蛋白質(zhì)[3]。OCT4 Isoform 1是轉(zhuǎn)錄的主要亞型之一，具有5個(gè)外顯子、4個(gè)內(nèi)含子，翻譯的蛋白質(zhì)含有一個(gè)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域——POU結(jié)合域，它能與含八聚體基序（octamer motif）的DNA結(jié)合從而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[4]。OCT4是一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在未分化胚胎干細(xì)胞中參與維持多能性和自我更新性[5]，在許多種癌癥包括肺癌[6]、生殖細(xì)胞腫瘤[7]、乳腺癌[8]、宮頸癌[9]、前列腺癌[10]、胃癌[11]、肝癌[12]和卵巢癌[13]中過(guò)表達(dá)。

2 MicroRNAs（miRNAs）介紹

miRNAs是一種小的、類(lèi)似于siRNA的分子，由高等真核生物基因組編碼，miRNA通過(guò)和靶基因mRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex,RISC）降解mRNA或阻礙其翻譯[14]。miRNAs在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在植物、動(dòng)物和真菌中發(fā)現(xiàn)的miRNAs只在特定的組織和發(fā)育階段表達(dá)，miRNAs組織特異性和時(shí)序性，決定組織和細(xì)胞的功能特異性，表明miRNAs在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)過(guò)程中起多種作用[15]。目前，在哺乳動(dòng)物基因組中，已鑒定出上百種miRNAs，但只有小部分明確了其功能特點(diǎn)[16]。

miRNAs基因通常是在核內(nèi)由RNA聚合酶II（polII）轉(zhuǎn)錄的，最初產(chǎn)物為大的具有帽子結(jié)構(gòu)（7MGpppG）和多聚腺苷酸尾巴（AAAAA）的pre-miRNA[17]。miRNAs在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成70個(gè)核苷酸組成的pre-miRNA。RAN-GTP和exportin 5將premiRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中。隨后，另一個(gè)核酸酶Dicer將其剪切產(chǎn)生約為22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的miRNA:miRNA*雙鏈。這種雙鏈很快被引導(dǎo)進(jìn)入RISC中，其中一條成熟的單鏈miRNAs保留在這一復(fù)合體中[18]。miRNAs結(jié)合到與其互補(bǔ)的mRNA的位點(diǎn)通過(guò)堿基配對(duì)調(diào)控基因表達(dá)[19]。

3 與OCT4相關(guān)的miRNAs

在細(xì)胞中，許多miRNAs都與OCT4基因相關(guān)，如miR-145、miR-302、miR-125b、miR-430、miR-200、miR-335。而且OCT4與這些miRNAs之間的相互影響對(duì)腫瘤細(xì)胞起到調(diào)節(jié)作用。

3.1 miR-145 miR-145通過(guò)結(jié)合到轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2和KLF4的3'UTR來(lái)調(diào)控這些因子。這種調(diào)控作用在許多腫瘤中都存在，如胸膜間皮瘤[20]、肝癌[21]、胰腺癌[22]、非小細(xì)胞肺癌[23]和前列腺癌[24]。

在肺腺癌中，miR-145的表達(dá)水平下調(diào)，和OCT4表達(dá)水平負(fù)相關(guān)。miR-145作為腫瘤抑制劑通過(guò)調(diào)控OCT4表達(dá)來(lái)下調(diào)肺癌起始細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型（epithelial-mesenchymal transition, EMT），抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[25]。

Chinnathambi等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell, ESCs）中存在一個(gè)OCT4和miR-145之間的平衡，在人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell,hESCs）中，OCT4高表達(dá)，而miR-145表達(dá)低。當(dāng)miR-145在hESCs中升高時(shí)，多能性重編程因子OCT4、SOX2、KLF的未翻譯區(qū)被抑制。此外，OCT4能夠結(jié)合并抑制miR-145的啟動(dòng)子。因此，OCT4和miR-145之間互相調(diào)控。

OCT4和miR-145之間的平衡會(huì)被多種因素調(diào)控。例如：缺氧條件可以調(diào)控Oct4/miR-145平衡進(jìn)而調(diào)整人腎髓質(zhì)CD133前體細(xì)胞的未分化表型[27]。姜黃素通過(guò)上調(diào)miR-145來(lái)降低OCT4A、OCT4B1、SOX2和NANOG的表達(dá)，進(jìn)而減少U87MG細(xì)胞的增殖[28]。

Wang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，OCT4的一個(gè)假基因OCT4-pg4，在肝癌細(xì)胞中被激活。OCT4-pg4的表達(dá)水平與OCT4正相關(guān)，這兩種基因轉(zhuǎn)錄都被抑制腫瘤的miR-145作用。OCT4-pg4有生物活性，可以保護(hù)OCT4轉(zhuǎn)錄不被miR-145抑制，上調(diào)OCT4蛋白在肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）中的水平。OCT4-pg4可以促進(jìn)HCC的生長(zhǎng)，因此，在肝癌中起到致瘤性的作用。

3.2 miR-302 miR-302基因編碼8個(gè)miRNA的miRNAs簇（miR-302b*-b-c*-c-a*-a-d-367），這幾個(gè)miRNAs簇在hESCs和腫瘤胚胎細(xì)胞中表達(dá)，提高細(xì)胞重編程效率[30]。

在發(fā)育的早期階段，OCT4和miR-302在同一個(gè)組織同時(shí)表達(dá)。OCT4、SOX2和NANOG結(jié)合到miR-302的啟動(dòng)子，活化miR-302在hESCs中的轉(zhuǎn)錄[31]。當(dāng)miR-302a在非多能性細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，抑制了cyclin D1 的mRNA，導(dǎo)致cyclin D1蛋白水平降低，喪失G1/S checkpoint，調(diào)控細(xì)胞從G1期到S期轉(zhuǎn)換，S期細(xì)胞升高，G1期細(xì)胞降低。相反，抑制hESCs中的miR-302時(shí)會(huì)導(dǎo)致G1細(xì)胞數(shù)量增加[32]。在HeLa細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和皮膚癌細(xì)胞中，表達(dá)外源miR-302可以誘導(dǎo)細(xì)胞快速增殖，提高S期細(xì)胞數(shù)，降低G1期細(xì)胞數(shù)[26]。

Brautigam等[33]對(duì)比了miR-290簇和miR-302簇作用的區(qū)別，miR-290簇miRNAs在鼠胚胎的4個(gè)細(xì)胞期上調(diào)，在胚囊期達(dá)到最高水平，而miR-302簇miRNAs在E6.5開(kāi)始表達(dá)，在E7.5時(shí)達(dá)到峰值。這些簇的特定表達(dá)模式表明兩種簇的miRNAs在胚胎發(fā)育的不同階段很重要。miR-290簇miRNAs在mESCs中和體內(nèi)胚囊期有重要作用，而miR-302簇miRNAs在后面階段有重要作用。

3.3 miR-125b 作為最早發(fā)現(xiàn)的miRNAs之一，miR-125b是主要的致癌因子，參與增殖、凋亡、分化、耐藥性和免疫。miR-125b作為原癌miRNAs，通過(guò)抑制凋亡來(lái)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[34,35]。

利用染色質(zhì)免疫沉淀分析發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌和畸胎癌細(xì)胞中，OCT4結(jié)合在miR-125b-1的啟動(dòng)子上，上調(diào)miR-125b的表達(dá)。miR-125b的過(guò)表達(dá)能夠抑制凋亡和BAK1的表達(dá)。Western blot分析表明，在宮頸癌細(xì)胞中BAK1表達(dá)與miR-125b表達(dá)負(fù)相關(guān)，與OCT4水平不相關(guān)。Luciferase數(shù)據(jù)也證實(shí)了BAK1是miR-125b的直接的靶基因，OCT4通過(guò)miR-125b來(lái)抑制BAK1表達(dá)。這說(shuō)明OCT4間接作用到BAK1誘導(dǎo)其下調(diào)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。IHC分析表明，BAK1的表達(dá)在原發(fā)宮頸癌中與OCT4負(fù)相關(guān)，而miR-125b與OCT4正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)OCT4的通過(guò)活化miRNA-125b/BAK1通路導(dǎo)致宮頸致癌[36]。

3.4 miR-430 miR-430是目前已發(fā)現(xiàn)的最大miRNAs基因簇，在斑馬魚(yú)和非洲爪蟾中起到清除母系mRNA的作用，它被NANOG、POU5f1和SOXB1共同調(diào)控。miR-430負(fù)責(zé)在母型-合子型過(guò)渡（maternal-to-zygotic transition,MZT）過(guò)程清除母系的mRNA，促進(jìn)向合子轉(zhuǎn)化。保守的miR-430/295/302/372家族的miRNAs穩(wěn)定了胚胎干細(xì)胞的自行更新，加強(qiáng)了重編效率[37]。這些miRNAs通過(guò)加速去除前面程序的mRNA來(lái)消除記錄，通過(guò)重編因子促進(jìn)建立新的轉(zhuǎn)變狀態(tài)。NANOG、SOXB1和POU5f1導(dǎo)致miR-430表達(dá)上調(diào)進(jìn)而提供了啟動(dòng)合子基因激活和清除之前母系記錄之間的聯(lián)系[38]。

3.5 miR-200 miR-200家族包括5個(gè)成員：miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429。這些miRNAs在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、自我更新、分化中起重要作用。如miR-200b可以抑制前列腺癌的細(xì)胞增殖、遷移以及提高化療敏感度[39]。

miR-200家族5個(gè)成員定位在小鼠的2個(gè)染色體上的2個(gè)簇（染色體4：miR-200a/b/429；染色體6: miR-141/200c）。OCT4和SOX2能結(jié)合到miR-141/200c 和miR-200a/b/429各自的啟動(dòng)子，激活miR-200s的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)OSKM誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPSC）的繁殖需要miR-200，結(jié)合這一點(diǎn)可以看出，內(nèi)源miR-200s作為OCT4和SOX2唯一的介質(zhì)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞重編程。

在iPSC繁殖的早期階段，miR-200/ZEB2通路的激活是OCT4/SOX2的一個(gè)重要功能。OCT4和SOX2通過(guò)結(jié)合到miR-200家族的啟動(dòng)子區(qū)域直接激活miR-200家族的表達(dá)，而miR-200s的表達(dá)會(huì)作用到ZEB2的3′ UTR進(jìn)而抑制ZEB2的表達(dá)。miR-200/ZEB2通路幫助成纖維細(xì)胞越過(guò)MET屏障，促進(jìn)iPSC繁殖[40]。

3.6 miR-335 Schoeftner等[41]研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)連接miR-335、OCT4、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的調(diào)控通路，這個(gè)通路控制mESCs的自我更新和分化。OCT4驅(qū)使Nipp1和Ccnf表達(dá)，抑制磷酸酶1（phosphatase 1, PP1）蛋白復(fù)合物的活性，建立視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)（retinoblastoma protein, pRb）磷酸化，而pRb磷酸化是mESCs自我更新的標(biāo)志性特征。miR-335調(diào)控OCT4和Rb的表達(dá)，在miR-335控制下，OCT4-Nipp1/Ccnf-PP1-pRb軸促進(jìn)mESCs自我更新。當(dāng)mESCs分化時(shí)，miR-335上調(diào)，OCT4 轉(zhuǎn)錄抑制，使Oct4-Nipp1/Ccnf-PP1-pRb軸崩潰，pRb去磷酸化，退出自我更新，建立了一個(gè)pRb調(diào)控細(xì)胞周期的程序。

Gao等[42]發(fā)現(xiàn)，OCT4是miR-335的一個(gè)直接的功能目標(biāo)，miR-335通過(guò)作用OCT4來(lái)抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和干細(xì)胞特性。系統(tǒng)地輸送miR-335可以抑制胰腺癌轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)生存。

4 總結(jié)

OCT4基因是維持胚胎干細(xì)胞多潛能性和自我更新的最關(guān)鍵基因，在許多腫瘤中高表達(dá)，許多種miRNAs通過(guò)與OCT4作用來(lái)調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及化療敏感度。這些發(fā)現(xiàn)可能將會(huì)為腫瘤治療提供新的手段。