復(fù)合木霉菌制劑防治葡萄灰霉病的效果研究

王承芳，陳 娟，2，曠文豐，毛偉力*（. 上海萬(wàn)力華生物科技有限公司，上海 20203；2. 上海交通大學(xué)，上海 200240）

復(fù)合木霉菌制劑防治葡萄灰霉病的效果研究

王承芳1，陳 娟1，2，曠文豐1，毛偉力1*
（1. 上海萬(wàn)力華生物科技有限公司，上海 201203；2. 上海交通大學(xué)，上海 200240）

通過(guò)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）進(jìn)行平皿對(duì)峙培養(yǎng)，從11個(gè)木霉（Tricheoderma Spp.）菌株中篩選出5 株對(duì)葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea，BC）有拮抗活性的菌株。以 Tr85為目標(biāo)菌株，分別與另 4個(gè)木霉菌株進(jìn)行相容性測(cè)試，將相容性好的 Tr85/Tr178B、Tr85/Tr469A 和 Tr178B/Tr469A 進(jìn)行混合，制成含 2×108個(gè)/g 孢子的復(fù)合菌或單菌株可濕性粉劑（WP），用于室內(nèi)生測(cè)。經(jīng)Tr85/Tr178B WP處理的葡萄葉片，對(duì)BC的防治效果（ERDC）顯著高于（P≤0.05）其它復(fù)合菌株或單菌株WP處理。將Tr85/Tr178B WP繼續(xù)用于2012和2013年在上海和山東的大田藥效試驗(yàn)。在上海，當(dāng)Tr85/Tr178B WP施用量為3.0 kg/hm2、 3.75 kg/hm2和5.25 kg/hm2時(shí)，各處理間對(duì)BC的ERDC沒(méi)有顯著性差異，但它們都顯著高于（P≤0.05）2.25 kg/hm和化學(xué)農(nóng)藥50%腐霉利WP3.75 kg/hm2處理。在山東，Tr85/Tr178B復(fù)合菌WP施用量在3.00 kg/hm2、 3.75 kg/hm2、5.25 kg/hm2的處理與50%腐霉利WP3.75 kg/hm2的處理之間，對(duì)BC的ERDC差異不顯著。但施用量為5.25 kg/hm2以及50%腐霉利WP3.75 kg/hm2（僅在2012年）對(duì)病害的ERDC顯著高于（P≤0.05）用量為2.25 kg/hm2。

木霉菌；抗藥性；灰霉??；防效

王承芳， 陳娟， 曠文豐， 等. 復(fù)合木霉菌制劑防治葡萄灰霉病的效果研究［J］. 生物災(zāi)害科學(xué)， 2015， 38（4）:333-338.

葡萄灰霉?。˙otrytis cinerea）是世界性分布、發(fā)生嚴(yán)重的葡萄病害之一。在低溫高濕的環(huán)境條件，特別當(dāng)溫度為 20～23℃，空 氣相對(duì)濕度達(dá) 90%以上時(shí)發(fā)病嚴(yán)重［1］。隨 著保護(hù)地葡萄種植面積的不斷增大，灰霉病在保護(hù)地葡萄種植區(qū)域中的發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重［1］。目前，生產(chǎn)中對(duì)葡萄灰霉病的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥。然而，長(zhǎng)期大量地使用化學(xué)農(nóng)藥，促使了灰霉菌對(duì)許多化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治效果逐年下降［2-3］。 當(dāng)前的研究調(diào)查表明，番茄灰霉菌對(duì)速克靈的抗藥性非常強(qiáng)，其中采自大豐番茄的 D1-3菌株對(duì)速克靈的抗性水平以達(dá)到EC50＞263.78 μg/mL，E C95＞6 000 μg/mL，其 中 EC95是敏感菌株的 1 400 倍［4］，同時(shí)化學(xué)藥劑的殘留，嚴(yán)重污染了農(nóng)產(chǎn)品和生態(tài)環(huán)境，危及了人畜的健康。

近年來(lái)通過(guò)篩選和開(kāi)發(fā)有益微生物及其代謝產(chǎn)物，使生物防治日益成為防控多種植物灰霉病的一條有效途徑［5-6］。但至今有關(guān)生防菌防治植物病害的研究多偏向于單一生防菌株對(duì)某個(gè)病害進(jìn)行防治。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)，復(fù)合生防菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性、抗病范圍、防效穩(wěn)定性等方面比單一菌株更有優(yōu)勢(shì)，能夠提高對(duì)植物病害的防治效果［7-8］。陳永珍［9］利 用復(fù)合生防細(xì)菌解淀粉芽胞桿菌和熒光假單胞菌防治煙草灰霉病，對(duì)單個(gè)菌株和復(fù)合菌株進(jìn)行藥效測(cè)試并發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌劑對(duì)灰霉病的防效顯著高于單一菌劑。譙天敏［10］利 用銅綠假單胞菌和長(zhǎng)枝木霉對(duì)竹梢枯病進(jìn)行防治，結(jié)果表明兩菌株分別對(duì)竹梢枯病有良好的防治作用，而將兩個(gè)菌株混合使用，協(xié)同防效大大提高。

本研究從生防木霉菌株的篩選入手，測(cè)試了木霉菌單菌株與復(fù)合菌株制劑在溫室和大田條件下，對(duì)葡萄灰霉病的防效差異性，為開(kāi)發(fā)復(fù)合木霉菌制劑防治葡萄灰霉病，提供了可參考的數(shù)據(jù)和實(shí)踐方法。

1　材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 葡萄灰霉病原菌 灰葡萄孢霉（ Botrytis cinerea）菌株Bc-2，是由上海萬(wàn)力華生物科技有限公司（上海萬(wàn)力華）從 上海浦東地區(qū)葡萄種植園的病株上分離得到，經(jīng) 分子和形態(tài)學(xué)鑒定為葡萄灰霉病的病原菌。

1.1.2 木霉菌株 本實(shí)驗(yàn)中所測(cè)試的11個(gè)木霉菌株：T r85、T r115、T r178B、T r309、T r319B、T r407、T r422、Tr452B、Tr469A、Tr580、Tr606，均由上海萬(wàn)力從全國(guó)不同地區(qū)的葡萄種植園中所采集的土壤和植株樣品，利用木霉菌選擇性培養(yǎng)基（TSM）分離得到的，所有菌株均保存在4 ℃的PDA培養(yǎng)基中備用。TSM培養(yǎng)基：TSM培養(yǎng)基配方（單位為g/L）：MgSO4?7H2O 0.2 g、KH2PO40.9 g、KCl 0.15 g、NH4NO31.0 g、葡萄糖3 g、氯霉素0.25 g、甲基磺0.3 g、五氯硝基苯0.2 g，玫瑰紅0.15 g、瓊脂20 g。

1.1.3 供試藥劑 50%腐霉利可濕性粉劑：由日本住友化學(xué)株式會(huì)社生產(chǎn)。

木霉菌可濕性粉劑（WP）：將篩選出的菌株，經(jīng)過(guò)發(fā)酵和劑型處理，制成含2×108/ g活孢子的木霉菌WP。

1.2 方 法

1.2.1 木霉菌對(duì)病原菌的平皿拮抗測(cè)試 采用兩點(diǎn)對(duì)峙培養(yǎng)法，在直徑為90 mm的 PDA平皿上，一側(cè)接種直徑為 5 mm Bc-2 的病原菌絲塊，另一側(cè)分別接種直徑為 5 mm的 1 個(gè)木霉菌株的菌絲塊，單獨(dú)接種病原的平皿為對(duì)照，每個(gè)處理有3 個(gè)重復(fù)。將接種的平皿放置在 25 ℃恒溫箱中培養(yǎng) 4 d后，分別記錄每個(gè)處理的病原菌菌落生長(zhǎng)直徑，取平均值，并根據(jù)以下公式計(jì)算抑菌率：

1.2.2 木霉菌株相容性測(cè)試 在PDA培養(yǎng)基平皿中心接種1株直徑為5 mm的目標(biāo)木霉菌株的絲塊，同時(shí)在其四周分別接種另四株直徑為5 mm的木霉菌株的菌絲塊，每個(gè)處理重復(fù)3次。將平皿放置在28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，觀察和記錄目標(biāo)木霉菌株與其它木霉菌株之間的相容性反應(yīng)。2個(gè)菌株生長(zhǎng)之間不產(chǎn)生抑菌條帶（抑菌圈）的為相容性好，反之為不相容。

1.2.3 復(fù)合木霉菌制劑抑制葡萄灰霉病室內(nèi)生測(cè)和大田藥效測(cè)試 （1）室 內(nèi)離體生測(cè)實(shí)驗(yàn)。采 葉齡一致、帶有1～2 cm葉柄的葡萄葉片，用濕棉球包裹葉柄保濕并放置在培養(yǎng)皿中。將含2×108/g活孢子的木霉菌可濕性粉劑（WP），用無(wú)菌蒸餾水（SDW）進(jìn)行梯度稀釋至cfu為1×105的單菌株懸浮液，再將兩個(gè)單菌株懸浮液按1∶1體積進(jìn)行混合，配置成雙菌株復(fù)合懸浮液。將各處理藥液以及SDW（病原對(duì)照處理）均勻地噴灑到葉片正反面，每個(gè)處理10個(gè)葉片，重復(fù)4次。待藥液干后，用無(wú)菌接種器取直徑為5 mm的Bc-2病原菌絲塊，接 種到各處理葉片的背面，將 葉背面朝上置于培養(yǎng)皿內(nèi)，蓋 上皿蓋。將 培養(yǎng)皿置于設(shè)置為：溫度25 ℃，濕度85%，12 h光暗交替，光強(qiáng)為10 000 Lux條件下人工氣候箱中培養(yǎng)5 d后，觀察和記錄個(gè)處理葉片的病斑直徑，取平均值。

（2）大 田藥效實(shí)驗(yàn)。大 田藥效測(cè)試點(diǎn)安排在上海市浦東新區(qū)傅嘉果蔬專業(yè)合作社和山東省泰安市岱岳區(qū)天平辦事處南王家莊葡萄園，測(cè)試時(shí)間在2012和2013年。測(cè)試處理包括用2×108個(gè)/g復(fù)合木霉菌WP（Tr85/Tr178B）的處理1（Trt.1）: 2.25 kg/hm2；Trt.2: 3.00 kg/hm2；Trt.3:3.75 kg/hm2以 及Trt.4:50%腐霉利WP3.75 kg/hm2和Trt.5:清水對(duì)照（CK）。每個(gè)處理小區(qū)面積為30 m2，重復(fù)3次，采用隨機(jī)區(qū)組排列。噴藥處理共3次：1：葡萄花絮分離期；2：初花期；3：末花期。每畝用水量為50 L。在第1次施藥前和第3次施藥后7～10 d進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。調(diào)查每小區(qū)的全部花穗數(shù)，病情指數(shù)是以每個(gè)花穗的發(fā)病面積占整個(gè)花穗的百分比進(jìn)行分級(jí)，0級(jí)：花序無(wú)?。?級(jí)：花序發(fā)?。?%；3級(jí)：6～10%；5級(jí)：11～25%；7級(jí)：25～50%；9級(jí)：＞50%。病情指數(shù)和防治效果按以下公式進(jìn)行計(jì)算。

2　結(jié)果與分析

2.1 平皿拮抗培養(yǎng)測(cè)試

通過(guò)將 11 個(gè)木霉株與病原菌株 Bc-2 進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)測(cè)試，4 d后觀察到，不同的木霉菌株對(duì) Bc-2 生長(zhǎng)的抑制率差異較大（見(jiàn)表 1）。雖然所有測(cè)試的木霉菌株對(duì) Bc-2 生長(zhǎng)的抑制率都超過(guò)了 50%，但只有Tr178B，Tr469A和 Tr85 對(duì) Bc-2 生長(zhǎng)的抑制率超過(guò)了 75%，分別為 75.00%，77.78%和 83.33%，顯著地高于（P≤0.05）其它菌株對(duì) Bc-2 生長(zhǎng)的抑制率。

表1　木霉菌株與BC-2平皿拮抗培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果

2.2 木霉菌株相容性測(cè)試

通過(guò)以上平皿拮抗培養(yǎng)測(cè)試，選出 5 個(gè)對(duì) Bc-2 生長(zhǎng)抑制率強(qiáng)的木霉菌株 Tr422，Tr178B，Tr452B，Tr469A和 Tr85，并以 Tr85 作為目標(biāo)菌株，測(cè)試 Tr85與其它 4 個(gè)菌株之間的相容性。結(jié)果顯示（見(jiàn)表 2和圖 1），Tr85 分別與 Tr469A和 Tr178B 菌株之間，以及 Tr469A和 Tr178B 之間相容性好，但與 Tr422 和 Tr452B 之間不相容。

表2　木霉菌株相容性測(cè)試結(jié)果

2.3 室內(nèi)離體生測(cè)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)木霉菌株相容性測(cè)試結(jié)果，選用了 Tr178B，Tr469A，Tr85單菌株和雙菌株 WP 懸浮液進(jìn)行室內(nèi)離體生測(cè)試驗(yàn)。結(jié)果顯示（見(jiàn)表3）， 經(jīng)單菌株和雙菌株WP 懸浮液處理的葡萄葉的灰霉病病情指數(shù)都控制在 25 以下，顯著低于（P≤0.05）經(jīng) SDW CK處理葉片的病情指數(shù)， 防治效果 （ERDC， %） 都達(dá)到 55%以上。 其中， 經(jīng)單菌株 Tr85 WP處理的葉片，對(duì)葡萄灰霉病的 ERDC為 66.42%，顯著性地高于（P≤0.05）經(jīng)其它單菌株 WP 和 Tr178B/Tr469A 以及 Tr85/Tr469A 雙菌株WP 處理葉片的 ERDC，但顯著低于（P≤0.05）經(jīng) Tr178B/Tr85 雙菌株 WP 處理葉片的 ERDC（74.04%）。

圖1　木霉菌株Tr85與其它4株菌株間相容性測(cè)試

表3　復(fù)合木霉菌株WP防治葡萄灰霉病室內(nèi)生測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 田間藥效測(cè)試

將Tr85/Tr178B復(fù)合WP進(jìn)一步用于防治葡萄灰霉病的田間藥效試驗(yàn)，結(jié)果顯示（見(jiàn)表3），雖然2012年兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的病情指數(shù)（DS）都高于 2013 年，同時(shí)在對(duì)葡萄灰霉病的 ERDC 上，不同地區(qū)有一定的差異性，但 在同一地區(qū)，兩 年的ERDC基本一致。在 上海，當(dāng) Tr85/Tr178B復(fù)合菌WP施用量為3.00 kg/hm2、3.75 kg/hm2和5.25 kg/hm2時(shí)，每個(gè)處理間對(duì)灰霉病的ERDC沒(méi)有顯著性差異，但它們都顯著性地高于行改革（P≤0.05）用量為2.25 kg/hm2和化學(xué)農(nóng)藥50%腐霉利WP3.75 kg/hm2對(duì)灰霉病的ERDC。在山東地區(qū)，Tr85/Tr178B復(fù)合菌WP施用量在3.00 kg/hm2、 3 .75 kg/hm2、5 .25 kg/hm2的處理與50%腐霉利WP3.75 kg/hm2的處理之間，對(duì)灰霉病的 ERDC差異不顯著。但施用量為 5.25 kg/hm2以及 50%腐霉利WP 3.75 kg/hm2（僅在 2012年）對(duì)灰霉病的ERDC 顯著性地高于（P≤0.05）用量為2.25 kg/hm2。

表4　2億活性孢子/克木霉菌WP防治葡萄灰霉病的效果

3　結(jié)論與討論

對(duì)于大多數(shù)植物的病原菌生防菌的篩選，大部分是利用平皿對(duì)峙法進(jìn)行菌株的篩選，但是單純依靠一種方法來(lái)篩選某一種植物病害的生防菌是不太可靠的，且容易造成漏篩。據(jù)陳捷［11］介紹篩選木霉菌的作用機(jī)理多樣，熊敏［12］利 用 11 株不同木霉菌株分別比較對(duì)峙培養(yǎng)法、病原菌存活率測(cè)定法、生防菌分泌物降解病原菌測(cè)定法、浸種抑菌萌發(fā)試驗(yàn)法及種苗接種活體篩選法對(duì)抑制黃瓜枯萎病尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的拮抗木霉菌的篩選效率。試驗(yàn)表明不同的篩選方法獲得拮抗木霉菌菌株的結(jié)果差異較大。本 文通過(guò)平皿拮抗培養(yǎng)測(cè)試和室內(nèi)離體生測(cè)試驗(yàn)兩種室內(nèi)篩選方式相結(jié)合，篩 選出 Tr85/Tr178B復(fù)合菌株。將 其制成含 2×108個(gè)/g活孢子的木霉菌WP，在 田間 2 年 4地的藥效測(cè)試中，試 驗(yàn)效果穩(wěn)定。因此，利用多種室內(nèi)篩選方法有利于篩選出效果穩(wěn)定的菌株。

在進(jìn)行生防菌復(fù)合前，要對(duì)菌株之間的親和性進(jìn)行測(cè)試，因?yàn)榫曛g的親和與否對(duì)植物病害的防治效果有一定的影響。如菌株之間親和性好，通常有協(xié)同增效作用，如菌株之間親和性不好，容易引起藥效不穩(wěn)定。陳志誼［13］研 究了拮抗細(xì)菌菌株之間親和性和生物防治效果之間的關(guān)系。本文試驗(yàn)表明:在兩個(gè)拮抗菌之間存在多種互作關(guān)系。當(dāng)混合的 2 個(gè)菌株之間互作關(guān)系是親和的，其生防效果有所提高。如Tr85 和 Tr178B，單獨(dú)菌株的防效分別為 66.42%和 55.71%，而復(fù)合后達(dá)到 74.04%，提高了 7.62%。當(dāng)復(fù)合的 2 個(gè)菌株之間互作關(guān)系是不親和的，有 的菌株組合生防效果提高不明顯甚至下降。如 Tr85 和 Tr469A單獨(dú)菌株的防效分別為 66.42%和 59.62%，而復(fù)合后達(dá)到 67.48%，僅提高了 1.06%。因此，在生物防治的實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)不同的菌株進(jìn)行親和性測(cè)試，篩選出具有協(xié)同、增效作用的親和性好的菌株，為生防菌組合菌劑具有較好的防治效果和生態(tài)適應(yīng)性。

生物防治的防治效益和穩(wěn)定性始終是限制生物防治發(fā)展的主要問(wèn)題。由于單一生防菌株適應(yīng)性有一定限制，使用復(fù)合菌則可拓寬木霉菌的適應(yīng)范圍，有利于抵抗葉表不良的環(huán)境條件，同時(shí)強(qiáng)化生防效應(yīng)［8］。因?yàn)榛旌鲜褂脮r(shí)菌株間的作用可能不只是簡(jiǎn)單的積加而具有了一定的協(xié)同性，提 高了與病菌的競(jìng)爭(zhēng)能力。如 Tr85 和 Tr178B 分別為哈茨木霉和綠色木霉，兩者的復(fù)合菌株的防治效果比其它組處理效果好。因此通過(guò)不同類型生防菌復(fù)合使用可以在一定程度上解決生防菌適應(yīng)性差和防效偏低的問(wèn)題。

灰霉病發(fā)生的嚴(yán)重程度受當(dāng)年的天氣影響比較大［1］。從文中比較 2012 和 2013 年，這兩年的天氣差異顯著，導(dǎo)致病害整體發(fā)生區(qū)別較明顯。2012 年陰雨天氣多，空氣濕度大，上海和山東兩地的灰霉病的病情指數(shù)均較 2013 年高。因此，在預(yù)測(cè)到葡萄開(kāi)花時(shí)期陰雨天氣多時(shí)，應(yīng)提前防治，以免灰霉病大規(guī)模爆發(fā)。

總之，目前木霉菌防治灰霉病的運(yùn)用主要在試驗(yàn)室，在田間的具體應(yīng)用較少。作者通過(guò)對(duì)木霉菌可濕性粉劑的田間藥效研究，表明了在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中利用混合木霉菌對(duì)葡萄灰霉病進(jìn)行防治，取得優(yōu)異的防治效果。使用 2.25 kg/hm2的使用劑量，能夠保證其效果穩(wěn)定。

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Bio-control of Grape Grey Mold by Using A WP-Formulation Mixed with Two Trichoderma Strains

WANG Cheng-fang1， CHEN Juan1，2， KUANG Wen-feng1， MAO Wei-li1*
（1. Shanghai WLH Bio-tech Corpration， Shanghai 201203， China； 2. Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240， China）

A screening test was conducted on petri dishes with potato dextrose agar （PDA）， and five Trichoderma strains were selected from 11 strains， which showed an antagonistic effect on inhibiting the growth of the pathogen of grape grey mold （Botrytis cinerea）. Using Tr85 as a target strain，a compatibility test was conducted with the other 4 strains. A wettable powder （WP） formulation containing 2x108/g spores was made with each of the signal strains or 2 strains， which were then used in an indoor bioassay. The grape leaves treated with the WP formulated with 2 strains of Tr85/Tr178B had a significantly higher（P≤0.05）efficacy rate （%） of disease control（ERDC） compared to those treated with each of the WPs formulated with a signal strain or other 2 strains. The WP formulation with Tr85/Tr178B was further used in field tests located in Shanghai and Shandong in 2012 and 2013. In Shanghai， there were no significant differences on ERDC among the treatments with the WP formulations of Tr85/Tr178B at 2.25 kg/hm2、 3.00 kg/hm2、5.25 kg/hm2， but the parameters of ERDC of each of the treatments were significantly higher（P≤0.05）than those with the treatments ofTr85/Tr178B WP at 2.25 kg/hm2and the chemical fungicide of 50% Procymidone WP at 3.75 kg/hm2. In Shandong， there were no significant differences on ERDC among the treatments of the WP formulations with Tr85/Tr178B at 2.25 kg/hm2、 3.00 kg/hm2、 5.25 kg/hm2a nd 50% Procymidone WP at 3.75 kg/hm2， but the parameters of ERDC with the treatments of Tr85/Tr178B WP at 5.25 kg/hm2and 50% Procymidone WP at 3.75 kg/hm2（only in 2012） were significantly higher（P≤0.05）than those with the treatment of Tr85/Tr178B WP at 2.25 kg/hm2.

Trichoderma； drug resistance； grape grey mold； mixed strains； efficacy rate of disease control

S436.631

A

2095-3704（2015）04-0333-06

2015-10-13

科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金（14C26213100929）、浦東新區(qū)科技發(fā)展基金創(chuàng)新資金（PKJ2014-NO1）和上海市科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金（1408H138600）

王承芳，女，工程師，碩士，主要從事生物農(nóng)藥研發(fā)，E-mail: wangfang3307@163.com；*通信作者：毛偉力，博士，E-mail:weilimao@hotmail.com。