亞麻枯萎病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒最適培養(yǎng)條件初探

宋喜霞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱150086)

亞麻枯萎病是由尖孢鐮刀菌亞麻專(zhuān)化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.lini(Bolley)]引起的一種真菌病害，普遍發(fā)生在各亞麻種植地區(qū)。一般發(fā)病率為20%～30%左右，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)40%以上，甚至絕產(chǎn)，嚴(yán)重影響亞麻產(chǎn)量和纖維質(zhì)量[1]。鐮刀菌毒素是鐮刀菌產(chǎn)生的能引起植物萎蔫的一種代謝產(chǎn)物，是鐮刀菌病害致病的主要原因之一[2]。

研究表明亞麻枯萎病毒素對(duì)亞麻種子萌發(fā)和胚根的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，可用作亞麻枯萎病抗性材料的篩選[3]。目前國(guó)內(nèi)外小麥、辣椒、西瓜等作物已利用鐮刀菌毒素對(duì)植物組織離體篩選抗逆種質(zhì)，在篩選抗病資源和改良品質(zhì)育種方面都取得了可喜成就[4－6]。本試驗(yàn)對(duì)尖孢鐮刀菌亞麻專(zhuān)化性病菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)毒條件進(jìn)行研究，明確尖孢鐮刀菌亞麻專(zhuān)化性病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的最適培養(yǎng)條件，為今后亞麻枯萎病的防治和利用毒素篩選亞麻枯萎病抗病品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株:黑龍江省蘭西縣亞麻田采集、分離、純化的尖孢鐮刀菌亞麻專(zhuān)化型強(qiáng)致病菌株(編號(hào)F4)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗毒素濾液的制備

將F4菌株移接在PSA平板培養(yǎng)基上，于25℃下培養(yǎng)7天，沿菌落邊緣打出直徑6 mm菌片，接入裝有150ml Richard培養(yǎng)液的250ml三角瓶?jī)?nèi)，每瓶接6片，置于30℃黑暗條件下，120r/min連續(xù)振蕩培養(yǎng)15天。培養(yǎng)液過(guò)濾(先用4層紗布，再用2層濾紙)，濾液離心30 min(3000 r/min)，棄去沉淀，上清液煮沸15min，濾液保存在4℃冰箱內(nèi)，供測(cè)備用。

1.2.2 胚根生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定方法

參照陸仕華 (1985)抑制胚根生長(zhǎng)測(cè)定法[7]。將供試的亞麻種子用漂白粉溶液 (1:14)浸種3min，進(jìn)行表面消毒。用無(wú)菌水沖洗3遍后放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，加入亞麻尖孢鐮刀菌毒素濾液15ml，25℃黑暗下培養(yǎng)，5天后測(cè)定并計(jì)算胚根生長(zhǎng)抑制率。每個(gè)培養(yǎng)皿中放50粒種子，設(shè)3次重復(fù)，對(duì)照用等量清水處理。

胚根生長(zhǎng)抑制率 (%)=(對(duì)照胚根生長(zhǎng)長(zhǎng)度－處理胚根生長(zhǎng)長(zhǎng)度)÷對(duì)照胚根生長(zhǎng)長(zhǎng)度×100

1.2.3 培養(yǎng)液的選擇

將供試F4菌株在PSA培養(yǎng)基25℃下培養(yǎng)7天，沿菌落邊緣打出6mm菌片，接種盛有150ml培養(yǎng)液的250ml三角瓶?jī)?nèi)，每瓶接6片，25℃培養(yǎng)15天，統(tǒng)計(jì)菌絲干重、孢子濃度和亞麻胚根生長(zhǎng)抑制率。

(1)改良Czapek培養(yǎng)液:硝酸鈉2g，硫酸亞鐵2.5g，磷酸二氫鉀1g，蔗糖30g，硫酸鎂0.01 g，氯化鉀0.5g，蒸餾水1000ml。

(2)Fries培養(yǎng)液:硫酸鎂0.5g，蔗糖20g，酒石酸5g，硝酸1g，磷酸二氫鉀1g，氯化鈉0.1g，氯化鈣0.13g，酵母浸膏1g，蒸餾水1000ml。

(3)Richard培養(yǎng)基:硝酸鉀19g，氧化鐵0.01g，磷酸二氫鉀5g，蔗糖5g，硫酸鎂0.5g，蒸餾水1000ml。

(4)Armstrong鐮刀菌培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀1.1g，硫酸鎂0.4g，葡萄糖20g，氯化鉀1.6g，硝酸鈣5.9g，硫酸鋅0.2mg，三氯化鐵0.2mg，硫酸錳0.2mg，水1000ml。

(5)MS無(wú)機(jī)鹽+蔗糖培養(yǎng)液:MS無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基+3%蔗糖，蒸餾水1000ml。

(6)PD培養(yǎng)液:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000ml。

1.2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響

選擇最適合產(chǎn)生毒素的培養(yǎng)液，接種病菌后，分別置于5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃7個(gè)溫度梯度處理下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)15天，統(tǒng)計(jì)其菌絲干重、孢子濃度和對(duì)亞麻胚根的生長(zhǎng)抑制率。

1.2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響

選擇最適合產(chǎn)生毒素的培養(yǎng)液，接種病菌后，在最適溫度下，分別培養(yǎng)10天、15天、20天、25天、30天、35天統(tǒng)計(jì)其菌絲干重、孢子濃度和對(duì)亞麻胚根的生長(zhǎng)抑制率。

1.2.6 pH值對(duì)病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響

PH值設(shè)3、4、5、6、7、8、9共7種處理。

1.2.7 光照條件對(duì)病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響

24小時(shí)連續(xù)光照、12小時(shí)明暗交替、24小時(shí)連續(xù)黑暗，光照強(qiáng)度3000Lux。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)液對(duì)病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響

在6種不同培養(yǎng)液中亞麻尖孢鐮刀菌均能生長(zhǎng)和產(chǎn)毒，但6種培養(yǎng)液的菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢能力、產(chǎn)毒能力差異顯著，其中MS無(wú)機(jī)鹽+蔗糖培養(yǎng)液最利于菌絲生長(zhǎng)，其菌絲干重顯著高于其他培養(yǎng)液，菌絲干重達(dá)到421mg/瓶，其次為改良Czapek培養(yǎng)液，其菌絲干重為386mg/瓶;Armstrong鐮刀菌培養(yǎng)液最有利于孢子生長(zhǎng)，孢子濃度顯著高于其他培養(yǎng)液，為20.8×106個(gè)/ml，其次為改良Czapek培養(yǎng)液，孢子濃度為19.3×106個(gè)/ml;Richard培養(yǎng)液最有利于產(chǎn)毒，胚根的生長(zhǎng)抑制率顯著高于其他培養(yǎng)液，胚根的生長(zhǎng)抑制率為58.9%，其次為改良Czapek培養(yǎng)液，對(duì)亞麻胚根生長(zhǎng)的抑制率為45.8%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同培養(yǎng)液對(duì)亞麻尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響Tab.1 Effect of different culture media on F.oxysporum growth and toxin production

2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響

在6種培養(yǎng)溫度處理下菌絲生長(zhǎng)差異顯著，其中25℃最有利于菌絲生長(zhǎng)，菌絲干重顯著高于其他處理為，菌絲干重為384 mg/瓶;病菌在6種培養(yǎng)溫度下孢子生長(zhǎng)差異顯著，其中25℃孢子濃度顯著高于其處理，孢子濃度為12.5×106個(gè)/ml;病菌在6種培養(yǎng)溫度處理下產(chǎn)毒能力差異顯著，30℃條件下最有利于產(chǎn)毒，產(chǎn)毒能力顯著高于其他處理，胚根生長(zhǎng)抑制率達(dá)到64.4%，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響

在6種培養(yǎng)時(shí)間處理下菌絲生長(zhǎng)差異顯著，在25天時(shí)菌絲干重顯著高于其他處理，菌絲干重為912mg/瓶;在6種培養(yǎng)時(shí)間處理下孢子濃度差異顯著，在25天時(shí)孢子濃度顯著高于其他處理，孢子濃度為19.6×106個(gè)/ml;在6種培養(yǎng)時(shí)間處理下病菌產(chǎn)毒能力差異顯著，在25天時(shí)病菌產(chǎn)毒能力顯著高于其他處理，對(duì)亞麻胚根生長(zhǎng)抑制率達(dá)到75.6%，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 培養(yǎng)溫度對(duì)亞麻枯萎病病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響Tab.2 Effect of temperature on F.oxysporum growth and toxin production

表3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)亞麻尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響Tab.3 Effect of culture time on F.oxysporum growth and toxin production

2.4 pH值對(duì)病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響

在7種處理?xiàng)l件下病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子濃度和產(chǎn)毒能力都差異顯著，總體來(lái)看病菌在PH 6～7之間生長(zhǎng)較好，最適PH值為7，在PH7時(shí)菌絲干重、孢子濃度和病菌產(chǎn)毒能力都顯著高于其他處理。隨著PH值的升高亞麻枯萎病病菌產(chǎn)毒能力升高，但增長(zhǎng)速度緩慢，PH7時(shí)亞麻胚根生長(zhǎng)抑制率達(dá)到最高為65.8%，之后隨PH值升高，胚根生長(zhǎng)抑制率下降，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 PH對(duì)亞麻尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響Tab.4 Effect of pH on F.oxysporum growth and toxin production

2.5 光照條件對(duì)病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響

24小時(shí)連續(xù)黑暗條件下菌絲干重顯著高于其他2種處理，為389 mg/瓶;24小時(shí)連續(xù)黑暗條件下孢子濃度顯著高于其他2種處理，孢子濃度高為12.3×106個(gè)/ml;24小時(shí)連續(xù)光照條件下產(chǎn)毒能力顯著高于其他2種處理，亞麻胚根生長(zhǎng)抑制率達(dá)到64.3%，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 光照條件對(duì)亞麻枯萎病病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響Tab.5 Effect of light treatment on F.oxysporum growth and toxin production

3 結(jié)論與討論

3.1 亞麻枯萎病病原菌最適生長(zhǎng)培養(yǎng)條件

MS無(wú)機(jī)鹽+蔗糖培養(yǎng)液最適合病菌菌絲的生長(zhǎng)，Armstrong鐮刀菌培養(yǎng)液最適合病菌孢子的生長(zhǎng)，病菌最適生長(zhǎng)的溫度為25℃，最適培養(yǎng)時(shí)間為25～30天，最適PH值為7，最適24小時(shí)連續(xù)黑暗下生長(zhǎng)。

3.2 亞麻枯萎病病菌最適產(chǎn)毒培養(yǎng)條件

Richard培養(yǎng)液最適病菌產(chǎn)毒，病菌產(chǎn)毒最適的溫度為30℃，最適培養(yǎng)時(shí)間為25天，最適PH值為7，最適24小時(shí)連續(xù)光照生長(zhǎng)。

3.3 討論

從研究結(jié)果來(lái)看在同一培養(yǎng)條件下隨著菌絲生長(zhǎng)，菌株產(chǎn)毒能力增強(qiáng)，但孢子濃度的多少與菌株產(chǎn)毒能力無(wú)必然聯(lián)系，當(dāng)孢子濃度升高到一定程度時(shí)，菌株產(chǎn)毒能力反而下降，這可能是孢子與毒素間競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)成分造成的，這與馬國(guó)斌 (1996)[8]的研究結(jié)果一致。

本文僅對(duì)亞麻枯萎病病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒條件進(jìn)行了研究，明確亞麻枯萎病病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的最適培養(yǎng)條件，在今后的工作中還需對(duì)亞麻枯萎病病菌產(chǎn)生鐮刀菌酸的規(guī)律進(jìn)行繼續(xù)研究探索，為亞麻枯萎病的高效防治和利用亞麻枯萎病粗毒素篩選亞麻枯萎病抗病品種奠定基礎(chǔ)。

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