涼血退赤方含藥血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGF、bFGF、ANG —1及PEDF表達(dá)的影響

祁燕 萬春平 鄭喜 馬珊

摘要：目的研究涼血退赤方（LXTCF）含藥血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ ECV304）血管內(nèi)皮生長因子（VE（；F）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（b-FGF）、促血管生成素1（ANG-1）及色素上皮衍生因子（PEDF）基因及蛋白表達(dá)的影響，探討其抑制角膜血管新生的可能作用機(jī)制。方法 制備LXTCF含藥血清，以不同濃度的LXTCF含藥血清（10%、20%）作用于ECV304，以正常大鼠血清（10%、20%）處理的ECV304為空白對(duì)照組，以單純培養(yǎng)體系處理的ECV304為正常對(duì)照組。采用Western Blot.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT一PCR）檢測ECV304細(xì)胞VEGF、b-FCF、ANC-1及PEDF蛋白及基因表達(dá)的變化。結(jié)果 與空白對(duì)照組（ 20%）[（0.695±0.028），（1.28±0.08）]比較，20% LXTCF含藥血清可明顯降低ECV304細(xì)胞VEGF[（0.416±0.053），（0.56 +0. 13）]，b-FGF[（0.306±0.053），（0.64±0.11）]蛋白及基因表達(dá)（P<0.05）；含藥血清（10%、20%）對(duì)ANC一1及PEDF蛋白及基因表達(dá)均無明顯影響（P>0.05）。結(jié)論 下調(diào)VEGF和b- FCF基因及蛋白表達(dá)，從而抑制角膜血管新生，可能是LXTCI治療CRNV性疾病的機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：涼血退赤方；角膜新生血管；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子、人堿性成纖維生長因子、促血管生成素-1.色素上皮衍生因子

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007 - 2349（ 2015） 02 - 0061 - 04正常的角膜組織透明，是屈光介質(zhì)之一。炎癥失調(diào)、角膜移植排斥反應(yīng)、堿灼傷、角膜潰瘍、角膜干細(xì)胞缺失等呵引起角膜新生血管（ corneal neovascularization，CRNV）發(fā)生[1]。CRNV破壞了角膜的正常微環(huán)境，使眼前節(jié)相關(guān)免疫赦免偏離消失[2]，并導(dǎo)致持續(xù)性炎癥和組織瘢痕化，產(chǎn)牛角膜混濁最終導(dǎo)致失明，因此，對(duì)CRNV發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究，一直是眼科領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。內(nèi)皮細(xì)胞（ EC）在NV發(fā)生、形成過程中發(fā)揮著重要的作用[1]。本實(shí)驗(yàn)選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（ ECV304）作為體外研究對(duì)象，從“熱郁肝肺”認(rèn)識(shí)CRNV，以“清肝肺郁熱，涼血退赤”立論，探討涼血退赤方（Li-ang Xue Tui Chi formula，LXTCF）抑制CRNV生成的作用及機(jī)制，為臨床CRNV性疾病的治療提供理論依據(jù)和治療途徑。1 材料與方法1.1 藥物L(fēng)XTCF藥材組成為臨床常用清熱涼血藥物密蒙花、生蒲黃、木賊、水牛角、海螵蛸等。藥物由云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房提供，并經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定。1.2 細(xì)胞人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（ HUVEC）株ECV304，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。1.3 主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基購自CibcoBRL公司；胎牛血清購自Hyclone；RIPA蛋白提取試劑盒購白碧云天；總RNA提取試劑盒購自天根；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix ExTaqⅡ均購自于TaKaRa；一抗兔抗大鼠抗體（bFGF、ANG-1、PEDF、VEGF）購自博爾森公司；二抗羊抗兔IRDye 800cw購自Li - Cor；內(nèi)參GADPH購自cell signaling公司；引物（bFGF、ANG-1、PEDF、VEGF）均由大連寶生物工程有限公司合成。1.4主要儀器恒溫C02細(xì)胞培養(yǎng)箱（Trermo公司，型號(hào)：3111）；紅外熒光成像掃描系統(tǒng)（Gene公司，型號(hào)：OdysseyCLX）；ABI PCR儀（Gene公司，型號(hào)：Veriti）；安捷倫核酸擴(kuò)增熒光檢測儀（Gene公司，型號(hào)：MX3000P）。1.5方法1.5.1 含藥血清的制備采用SPF級(jí)SD大鼠20只隨機(jī)分為空白對(duì)照組與含藥血清組。灌胃給藥，每日早晚各1次，連續(xù)3d，給藥組給藥劑量為2 mU200 g（人臨床等效劑量的10倍，相當(dāng)于原生藥的13.7 g/kg·d），空白對(duì)照組給予等容的蒸餾水。末次給藥后lh腹主動(dòng)脈取血，靜置30min，3000轉(zhuǎn)離心20min，取上清，56℃滅活30 min，0.22μm的針頭濾器過濾滅菌，置于- 80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.5.2

Western Blot檢測含藥血清對(duì)ECV304細(xì)胞VECF、PEDF、bFGF、ANG -1蛋白表達(dá)的影響ECV304以l×I06個(gè)/mL接種于6孔板。培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁80010時(shí)，棄舊的培養(yǎng)基，給藥組分別加入體積分?jǐn)?shù)為10%、20%的含藥血清的培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加入10%、20%正常大鼠血清培養(yǎng)液。正常對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液（10%胎牛血清），每組5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，提取細(xì)胞蛋白，BCA蛋白定量法定量，變性后，以lO%SDS - PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，加入對(duì)應(yīng)抗體孵育后，上紅外熒光成像掃描系統(tǒng)檢測熒光強(qiáng)度。以目的蛋白與GADPH的密度比值作為目的蛋白的相對(duì)含量。1.5.3RT - PCR檢測含藥血清對(duì)ECV304細(xì)胞VEGF、PEDF、bFGF、ANG -1基因表達(dá)的影響 細(xì)胞分組給藥同前，細(xì)胞培養(yǎng)完后，取出六孔板，吸去上清液，加預(yù)冷的PBS洗1次，加入ImL trizol提取試劑提取細(xì)胞總RNA，cDNA合成按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，采用SYBR Greenl嵌合熒光法于熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，GADPH為內(nèi)參對(duì)照。結(jié)果采用相對(duì)定量法：各處理組相對(duì)于正常對(duì)照組的目的基因的量= 2-△△Ct。在PCR反應(yīng)程序結(jié)束后，進(jìn)入儀器自帶軟件的數(shù)據(jù)分析界面，設(shè)置CADPH為內(nèi)參基因（nomalize），正常對(duì)照組樣本為對(duì)照樣本（ calibrator），儀器自動(dòng)計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)差異倍數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，即2-△△Ct±標(biāo)準(zhǔn)差值。根據(jù)基因庫中基因序列設(shè)計(jì)VEGF、PEDF、bFGF、ANG -1基因及內(nèi)參基因GADPH引物，各基因引物序列見表1。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD一t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1 含藥血清對(duì)ECV304 VEGF、bFGF、ANC -1、PEDF蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，20%含藥血清作用24h后，與20%空白對(duì)照組比較ECV304 VEGF及bFGF蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）；各濃度（ 10%，20%）含藥血清對(duì)ANG -l、PEDF蛋白表達(dá)均無明顯影響（P>0.05），見表2、圖1。2.2 含藥血清對(duì)ECV304細(xì)胞VEGFmRNA、bFCF mRNA、AN（； -l mRNA、PF DF mRNA表達(dá)的影響 檢測所提取樣本總RNA A260/A280在1.8～2.0之間，RNA較純，無蛋白質(zhì)污染，內(nèi)參及目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)大于0. 99，擴(kuò)增效率90%～ 120%之間，可用2-△△Ct計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參及目的基因溶解曲線峰形單一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表叫，含藥血清作用于細(xì)胞24h后，與20%空白大鼠血清對(duì)照組比較，ECV304細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05）；各濃度含藥血清作用于細(xì)胞24h后，對(duì)ECV304胞內(nèi)ANG-1mRNA、PEDF mRNA表達(dá)均無明顯影響（P>0.05）3討論

目前認(rèn)為角膜新生血管的發(fā)生與促血管形成因子和抗血管形成因子的平衡失調(diào)有關(guān)。生理狀態(tài)下，角膜拈抗血管形成因子和促血管形成因子共同表達(dá)，維持平衡。許多研究表明，血管生成刺激因子如血管內(nèi)皮生長因子與血管生成抑制因子如色素上皮衍生因子之間平衡的破壞是導(dǎo)致新生血管發(fā)生的主要原因[3]。血管內(nèi)皮因子（VEGF）是主要的促血管生成因子[4]，抑制VEGF的表達(dá)即可抑制新生血管的形成[5]；VEGF、的表達(dá)與CNV的形成成正相關(guān)，VEGF可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)新生血管的形成[6]。bFGF是血管新生的主要誘導(dǎo)因子且和VEGF有協(xié)同作用，甚至有報(bào)道bFGF促進(jìn)脈絡(luò)膜毛細(xì)血管細(xì)胞增殖作用強(qiáng)于VFGF[7]，血管生成索1（Ang -1）也是特異作用于新生血管發(fā)生的主要細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞的一類促新生血管細(xì)胞岡子。其可拮抗血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和形成管狀結(jié)構(gòu)，維持內(nèi)皮細(xì)胞的靜息狀態(tài)和血管的完整。還可加強(qiáng)VEGF和內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（ EGF）促血管網(wǎng)存活的作用。當(dāng)以上機(jī)制發(fā)乍住視網(wǎng)膜或者脈絡(luò)膜，就起到了促使CRNV形成的過程[8]。色素上皮衍生因子（ PEDF）具有抑制血管生成的功能。在體外實(shí)驗(yàn)中，PEDF能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，能使bFGF誘導(dǎo)的毛細(xì)血管減少40%，被認(rèn)為是最有效的天然的血管生成抑制劑，PEDF在晚期CRNV的RPE細(xì)胞中有高度上調(diào)的表達(dá)，抑制CRNV的發(fā)展[9]。

“角膜”在中醫(yī)眼科學(xué)中稱為黑睛，屬于五輪中風(fēng)輪，內(nèi)應(yīng)肝膽，黑睛疾病治則祛風(fēng)清熱、退翳明日。本課題從“熱郁肝肺”認(rèn)識(shí)CRNV以“清肝肺郁熱，涼血退赤”立淪治療CRNV，希望能挖掘出中醫(yī)藥治療CRNV類疾病的巨大優(yōu)勢潛力.

本課題前期研究結(jié)果表明[10]，20%涼血退赤方含藥血消可顯著降低人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF含量。本研究進(jìn)一步在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型上，研究涼血退赤方對(duì)促血管形成因子（VECF、bFGF和Ang-1）和角膜拮抗血管形成因子（ PEDF）的調(diào)控作用，揭示涼血退赤方抑制新生血管形成的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20%含藥血清可降低ECV304細(xì)胞VEGF及bFGF基因及蛋白表達(dá)，但對(duì)ANG -1及PEDF表達(dá)無明顯影響。以L研究結(jié)果提示，涼血退赤方可能通過下調(diào)促血管形成岡子VEGF及b-FGF的表達(dá)，進(jìn)而抑制角膜新生血管的形成。但本研究只觀察了含藥血清對(duì)正常培養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)胞VECF等指標(biāo)的影響，而在刺激或有損傷岡素作用下含藥血清對(duì)ANC -1、PEDF等岡子表達(dá)的是否有影響，及其相關(guān)的調(diào)控機(jī)制、信號(hào)傳導(dǎo)途徑，仍有待于進(jìn)一步的研究。參考文獻(xiàn)：[1] Penn JS，Madan A，Caldwell RB，et al.Vascular endothelial growth factor in eye disease[Jl. Prog Retin Eye Res，2008.27（4）：331 – 371[2] Dana MR，Streilein JW.Loss and restoralion of immune privilegein eyeswith corneal neovascularization[J].Invest Ophthalmol Vis Sei， 1996，37.2485 - 2494.[3] Miller JW. Vascular endothelial growth factor and ocularneovascularization[J]. Am J Pathol，1997 ，151（1）：13 - 23.[4]劉志剛，陳芳育，蔣立輝，等.血管抑素下調(diào)舌鱗癌細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（16）：1557 - 1560.[5]劉子彬，劉?？。S丹丹，等.血管抑索對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2012，21（7）：1165 -1167[6]丁怡，張明昌.CD105和血管內(nèi)皮生長因子在大鼠角膜新生血管中的表達(dá)[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010 ，39 （2） ：221-224.[7] Zubilewicz A，Hecquet C，Jeanny J，et al. Find all citations hy this au-thor（ default）. Orfilter your current searchFind all citations by this au-thor（ default）. Orfilter your current searchTwo distinct signalling path-ways are involved in FCF2 - stimulated proliferation of choriocapillaryendothelial cells ：a comparative study with VEGF-[J] . Oncogene，2001 ，20 （ 12 ） ：1403 - 1413.[8]王應(yīng)利，惠延年，血管生成素1對(duì)視網(wǎng)膜新生血管形成的作用及其機(jī)制[J].中華眼底病雜志，2007，3（23）：149-152.[9]汪浩，王文吉.脈絡(luò)膜新生血管的治療進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)眼科分冊(cè)，2001：25：288 - 295.[10]馬珊，馬俊，彭華，等，涼血活血中藥含藥血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，11（33）：38 -41.（收稿日期：2014-09-21）