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    高效石油烴降解菌CQ6的分離鑒定及He—Ne激光誘變

    2015-08-20 17:24:09付瑞敏康治華彭瑞強(qiáng)陳五嶺
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年7期
    關(guān)鍵詞:表面活性劑

    付瑞敏 康治華 彭瑞強(qiáng) 陳五嶺

    摘要:從長(zhǎng)慶油田石油污染土壤中分離得到一株產(chǎn)生生物表面活性劑的高效石油烴降解菌。通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)研究,篩選出的菌株CQ6被鑒定為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。為了增強(qiáng)該菌降解石油烴的能力,對(duì)其進(jìn)行He-Ne激光誘變,獲得6株突變株,通過(guò)檢測(cè)其表面張力、排油圈直徑和烴降解率,降解石油烴能力最強(qiáng)且遺傳性狀穩(wěn)定的突變株CQ66被挑選出來(lái)。本研究表明,He-Ne激光誘變育種技術(shù)可有效改良石油烴降解菌,該手段對(duì)修復(fù)石油污染土壤具有現(xiàn)實(shí)意義。

    關(guān)鍵詞:石油烴降解菌;表面活性劑;He-Ne激光誘變;遺傳穩(wěn)定性

    中圖分類(lèi)號(hào): S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2015)07-0404-03

    隨著石油工業(yè)的快速發(fā)展,在石油勘探、開(kāi)采、運(yùn)輸及煉制等過(guò)程都會(huì)出現(xiàn)原油的泄漏,從而對(duì)土地和鄰近水體造成嚴(yán)重污染[1]。這些原油可通過(guò)生物學(xué)或非生物學(xué)途徑而逐步降解。研究表明,消除石油烴污染的各個(gè)因素中,微生物降解具有重要作用,當(dāng)前已報(bào)道有多種微生物具有降解石油烴并產(chǎn)生表面活性劑的能力[2-4]。李倩等制備石油烴降解菌劑并將其應(yīng)用于溢油岸灘的生物修復(fù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)28 d的生物修復(fù),其石油烴降解率最高達(dá)45.07%[5]??梢?jiàn)采用現(xiàn)代育種技術(shù)選育石油烴降解菌對(duì)于石油污染區(qū)域的生物修復(fù)具有極為重要的應(yīng)用價(jià)值。 激光可通過(guò)光、電、熱和電磁等綜合作用引起菌體細(xì)胞基因發(fā)生改變,從而使所產(chǎn)生的酶發(fā)生激活或鈍化[6]。低能量的He-Ne激光作用于菌體細(xì)胞,可促進(jìn)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)而提高代謝物產(chǎn)量,當(dāng)前引起了微生物育種者的廣泛關(guān)注[7]。本研究針對(duì)長(zhǎng)慶油田石油污染土壤,進(jìn)行了石油烴高效降解菌的分離、鑒定,并通過(guò)He-Ne激光輻射誘變育種,選育出一株遺傳性能穩(wěn)定的高效石油烴降解菌,以期為石油污染土壤的生物修復(fù)提供數(shù)據(jù)參考。

    1 試驗(yàn)材料

    1.1 菌種來(lái)源

    從長(zhǎng)慶油田石油污染土壤中提取。

    1.2 培養(yǎng)基

    1.2.1 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基 MgSO4·7H2O 0.2 g,K2HPO4 1.0 g,KH2PO4 1.0 g,NH4NO3 1.0 g,F(xiàn)eCl3 0.05 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0。

    1.2.2 選擇培養(yǎng)基 將2 g原油抽濾滅菌后加到上述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,即為液體選擇培養(yǎng)基,也叫原油發(fā)酵培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂制成相應(yīng)的固體選擇培養(yǎng)基,即為油平板。試驗(yàn)所用原油采自長(zhǎng)慶油田G010-18 井。

    1.2.3 LB培養(yǎng)基 蛋白胨8 g,氯化鈉7 g,酵母浸膏5 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0,即為液體培養(yǎng)基;固體培養(yǎng)基的瓊脂添加量控制在15%~18%。

    1.2.4 復(fù)壯培養(yǎng)基 蛋白胨8 g,氯化鈉7 g,酵母浸膏5 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0,葡萄糖50 mmol/L

    1.3 試驗(yàn)儀器

    He-Ne激光發(fā)生器(波長(zhǎng)632 nm,功率10 mW),由西北大學(xué)光電廠(chǎng)生產(chǎn);WZY-1自動(dòng)液體表面張力儀,由上海衡平制造廠(chǎng)生產(chǎn)。

    2 試驗(yàn)方法

    2.1 菌株培養(yǎng)

    菌株分離自長(zhǎng)慶油田G010-18 井周邊污染土壤。將100 mL選擇液體培養(yǎng)基加入到250 mL錐形瓶中,121 ℃滅菌20 min,而后稱(chēng)取5 g污染土壤置于其中,透氣封口膜封住瓶口,280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d。

    2.2 菌株篩選與分離

    2.2.1 初篩 采用梯度稀釋法,將培養(yǎng)后的菌液用無(wú)菌水連續(xù)稀釋101~107倍,取10-5、10-6、10-7的梯度稀釋液分別涂布于以石油烴為唯一碳源的油平板上,每個(gè)稀釋度均做3個(gè)平行試驗(yàn),將其置于37 ℃培養(yǎng)3 d,能在油平板上生長(zhǎng)的就是石油烴降解菌。將石油烴降解菌通過(guò)平板劃線(xiàn)獲得單菌落,將其轉(zhuǎn)至斜面,4 ℃保存。

    2.2.2 復(fù)篩 為了進(jìn)一步檢測(cè)石油烴降解菌對(duì)石油烴的降解能力,采用表面張力檢測(cè)、排油圈[8]和烴降解率[9]等3種方法進(jìn)行復(fù)篩。(1)表面張力檢測(cè)[8]。將篩選出的石油烴降解菌菌株活化,以2%的比例接入葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基,280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d后,使用張力儀檢測(cè)發(fā)酵液的表面張力。(2)排油圈[8]。取90 mm培養(yǎng)皿,加入 50 mL 去離子水,滴加0.1 mL液體石蠟于水面,石蠟中心加入10 μL發(fā)酵液,發(fā)酵液會(huì)將石蠟擠向四周形成圓圈,菌株所產(chǎn)生表面活性劑的量及活性同該圓圈的直徑成正比。通過(guò)對(duì)比各菌株所形成的排油圈,選取排油圈直徑最大的菌株作深入研究。上述試驗(yàn)均重復(fù)3次。(3)烴降解率[9]。將石油烴降解菌菌液以10%的比例接入50 mL的原油發(fā)酵培養(yǎng)基中,280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d后,按照文獻(xiàn)[9]中方法測(cè)定培養(yǎng)液中原油降解率,計(jì)算石油烴降解率。

    降解率(D)=(m1-m7)/m1×100%。

    式中:m1為初始發(fā)酵培養(yǎng)基中原油含量;m7為培養(yǎng)7 d殘留油含量。

    經(jīng)過(guò)上述試驗(yàn),即可選出降解石油烴能力最強(qiáng)的菌株。

    2.3 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

    參照文獻(xiàn)[10-11]對(duì)所選的降解石油烴能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定(包括革蘭氏染色、芽孢染色和大小測(cè)定等),并參照微生物試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)該菌進(jìn)行生理生化測(cè)定(包括過(guò)氧化氫酶反應(yīng)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、IMViC試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)和耐鹽性試驗(yàn)等),上述試驗(yàn)均重復(fù)3次。

    2.4 16S rDNA序列分析

    參照Fani等的方法[12],采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供的試劑盒提取所選菌株的DNA和回收其16S rDNA片段。16S rDNA 的PCR擴(kuò)增引物采用通用引物(27F:5′-AGAGTTGTCATGGCTC-3′和1492R:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′),該引物合成自上海生工。PCR反應(yīng)參數(shù):94 ℃ 5 min;94 ℃ 50 s,50 ℃ 50 s,72 ℃ 90 s,共計(jì)30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。將所得PCR產(chǎn)物回收純化并提交目的片段至上海生工進(jìn)行基因測(cè)序,所得序列采用MEGA 3.0同NCBI上的相近物種的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),樹(shù)的聚類(lèi)穩(wěn)定性進(jìn)行1 000次自導(dǎo)檢驗(yàn)[13]。

    2.5 He-Ne激光誘變和突變株的選育

    2.5.1 誘變前的活化

    將所選菌株于37 ℃培養(yǎng)24 h后,用5 mL無(wú)菌生理鹽水沖洗斜面后將其置于三角瓶中(內(nèi)含玻璃珠),充分振蕩混勻,采用光電比濁計(jì)數(shù)法將菌懸液的D值調(diào)節(jié)至0.986,使其濃度為108 CFU/mL。

    2.5.2 He-Ne激光誘變[14]

    取2 mL菌懸液分別置于無(wú)菌試管中,將 He-Ne 激光的輸出功率調(diào)節(jié)為10 mW,照射距離調(diào)節(jié)為 25 cm,照射時(shí)間為5、10、15、20、25 min,以原菌液為對(duì)照,試驗(yàn)均重復(fù)3次。

    2.5.3 誘變菌培養(yǎng)

    無(wú)菌條件下取1 mL激光照射后的菌液,將其置于裝有9 mL無(wú)菌水的試管中,作為10-1,振蕩混勻后再以同樣方法將其稀釋至10-5、10-6、10-7,從3個(gè)梯度的稀釋液中各取0.2 mL涂平板,每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)平行,37 ℃ 培養(yǎng)20 h后,以原菌懸液作為對(duì)照,進(jìn)行菌落形態(tài)觀(guān)察和菌落計(jì)數(shù)。

    2.5.4 存活率和正突變率的計(jì)算

    將激光誘變后的菌懸液用復(fù)壯培養(yǎng)基培養(yǎng),條件為280 r/min 、37 ℃下培養(yǎng)6 h,而后使用梯度稀釋法將其稀釋至10-6,分別取0.1 mL 10-4、10-5和10-6的稀釋液涂布在油平板上,以未照射的菌液為對(duì)照,37 ℃、96 h后觀(guān)察生長(zhǎng)狀況,并計(jì)算存活率和正突變率:

    存活率=誘變后活菌數(shù)/誘變前活菌數(shù)×100%;

    正突變率=正突變菌株數(shù)/誘變后活菌數(shù)×100%。

    2.5.5 挑取優(yōu)良突變株

    通過(guò)菌落形態(tài)觀(guān)察和計(jì)數(shù),從誘變后的菌株中挑選出菌落形態(tài)變化較大、長(zhǎng)得又快又好且透明圈明顯的突變株,通過(guò)表面張力檢測(cè)、排油圈和烴降解率等方法檢測(cè)正突變株降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的能力,并挑選優(yōu)良突變株。

    2.5.6 突變株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

    將挑選出的降解石油烴能力最強(qiáng)的突變株轉(zhuǎn)接至LB平板上,作為第1代,然后以相同方法連續(xù)繼代20代,每隔4代分別將其按照10%的比例接入原油發(fā)酵培養(yǎng)基中,280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d,測(cè)其降解率和表面張力,并將其與第1代菌株比較,確定突變株的遺傳穩(wěn)定性。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 石油烴降解菌的篩選與分離

    從長(zhǎng)慶油田石油污染土壤中分離得到可在油平板上生長(zhǎng)且產(chǎn)生透明圈的石油烴降解菌6株,分別為CQ1、CQ2、CQ3、CQ4、CQ5和CQ6,經(jīng)過(guò)表面張力、排油圈和烴降解率等方法檢測(cè),結(jié)果如表1所示:6株菌對(duì)石油烴的降解能力和產(chǎn)生表面活性劑的能力有較為顯著的差異,菌株CQ6的排油圈直徑和石油烴降解率均高于其他菌株,且表面張力低于其他菌株?;诖?,說(shuō)明菌株CQ6的降解石油烴能力和產(chǎn)生表面活性劑能力最強(qiáng),因此選取菌株CQ6進(jìn)行后續(xù)研究。

    3.2 石油烴降解菌CQ6的表型特征和生理生化特性

    將上述所選的石油烴高效降解菌株CQ6挑選出來(lái)并進(jìn)行顯微鏡鏡檢和菌落形態(tài)觀(guān)察。結(jié)果顯示:該菌個(gè)體形態(tài)為桿狀,G-,產(chǎn)橢圓形芽孢,芽孢囊膨大,菌落干燥、不透明且有皺褶,菌落邊緣有不規(guī)則擴(kuò)散。

    對(duì)CQ6進(jìn)行生理生化檢測(cè),結(jié)果顯示:CQ6為嚴(yán)格好氧菌,抗氯化鈉2%、5%、7%、10%,可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸,IMViC試驗(yàn)結(jié)果為-+++,淀粉水解和酪素水解試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

    通過(guò)分析CQ6的表型特征和生理生化特征,發(fā)現(xiàn)其形態(tài)和生理生化特點(diǎn)均和枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株相同,據(jù)此,可初步判定菌株CQ6為芽孢桿菌屬。

    3.3 CQ6的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育研究

    菌株CQ6的16S rDNA片段(約1 500 bp)的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示,將所得PCR產(chǎn)物測(cè)序,得到 1 492 bp 的序列,將該序列和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的各近緣菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì),應(yīng)用Bioedit7.0軟件進(jìn)行多重比較,分析其同源性,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2),經(jīng)分析,所得序列和Bacillus pumilus(登錄號(hào):X60637)顯示了99%的同源性,根據(jù)其系統(tǒng)進(jìn)化特征,可確定菌株CQ6為短小芽孢桿菌。

    3.4 突變株篩選

    用激光照射誘變育種的生物學(xué)效應(yīng)主要是引起基因突變從而使酶激活或鈍化,激光照射時(shí)間會(huì)導(dǎo)致突變率發(fā)生變化,照射時(shí)間越長(zhǎng),突變率越高,但是致死率也隨之升高,因此要挑選合適的照射時(shí)間以保證一定的突變率和控制致死率。用激光對(duì)石油烴降解菌CQ6照射不同時(shí)間,結(jié)果如表2所示。

    由表2可以看出,隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng),菌株的存活率不斷下降,正突變率的變化趨勢(shì)是先升高后降低,推斷造成這種情況的原因是由于照射時(shí)間過(guò)長(zhǎng),不僅會(huì)導(dǎo)致活菌數(shù)劇烈下

    降,也會(huì)使更多的菌株出現(xiàn)負(fù)突變,因此,綜合考慮,CQ6的最佳照射時(shí)間選為15 min。

    采用排油圈檢測(cè)、表面張力檢測(cè)和烴降解率等方法,5株降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的能力均強(qiáng)于親本CQ6的菌株被挑選出來(lái),分別編號(hào)為CQ61、CQ63、CQ65、CQ66和CQ67,其降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的結(jié)果如表3所示。

    如表3所示,突變株CQ66的排油圈直徑和石油烴降解率均高于其他突變株,且表面張力低于其他突變株,說(shuō)明該突變株的降解石油烴能力和產(chǎn)生表面活性劑能力是突變株中最強(qiáng)的,故將其挑選出來(lái),用于后續(xù)研究。

    3.5 突變株遺傳穩(wěn)定性研究

    把石油烴降解能力和產(chǎn)生表面活性劑能力均有所提高的突變株CQ66繼代培養(yǎng)20代,每隔4代的菌株分別做石油烴降解率和表面張力試驗(yàn),結(jié)果(表4)表明各代降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的能力基本一致,說(shuō)明突變株CQ66的降解石油烴能力的遺傳穩(wěn)定性良好。

    4 討論

    本研究從長(zhǎng)慶油田石油污染的土壤中分離篩選得到一株高效降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的菌株CQ6,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子鑒定確定該菌株為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。

    為了增強(qiáng)該菌株降解石油烴的能力和產(chǎn)生表面活性劑的能力,對(duì)所選菌株進(jìn)行He-Ne激光誘變育種,并確定最佳照射時(shí)間為15 min。

    He-Ne激光誘變后,采用排油圈檢測(cè)、表面張力檢測(cè)和烴降解率等方法挑選出降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑能力最強(qiáng)的突變株CQ66,并對(duì)其進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè), 試驗(yàn)結(jié)果表明,該突變株降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的遺傳性狀穩(wěn)定,可用于制備固體菌劑或液體菌劑應(yīng)用于長(zhǎng)慶油田石油污染土壤的生物修復(fù)。

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