基于在線生理參數(shù)的黑曲霉生產(chǎn)葡萄糖酸鈉發(fā)酵動力學模型

平康康 路飛 王澤鍵 趙偉 儲炬 莊英萍 王永紅

摘要：對黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的發(fā)酵過程進行研究，并通過在線參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)在線生理參數(shù)攝氧率（OUR）和呼吸熵（RQ）可以用來表征發(fā)酵過程中底物葡萄糖消耗速率和得率的高低?；诖税l(fā)現(xiàn)，將在線生理參數(shù)攝氧率（OUR）和呼吸熵（RQ）成功用于葡萄糖酸鈉發(fā)酵動力學特性表征和分析，得到了葡萄糖酸鈉發(fā)酵過程中葡萄糖消耗率和得率及葡萄糖酸生成的動力學方程，并對方程參數(shù)進行最優(yōu)參數(shù)估計和非線性擬合。通過計算值與試驗數(shù)據(jù)的比較，發(fā)現(xiàn)試驗值和計算值可以很好地擬合。該模型可以很好地應(yīng)用于葡萄糖酸鈉發(fā)酵工藝優(yōu)化預測及后續(xù)放大過程。

關(guān)鍵詞：黑曲霉；葡萄糖酸鈉；在線生理參數(shù)；動力學模型

中圖分類號： S188+.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0375-04

葡萄糖酸鈉是一種具有咸苦味、無腐蝕性、無揮發(fā)性、無毒、溫和的有機酸鈉鹽[1]。近年來，由于其在食品、飼料、醫(yī)藥及建筑等行業(yè)的廣泛應(yīng)用[2-6]，葡萄糖酸鈉越來越受到人們的關(guān)注。統(tǒng)計數(shù)字表明，葡萄糖酸鈉的市場需求量在逐年遞增[7-8]。目前工業(yè)上多采用黑曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉。黑曲霉代謝合成葡萄糖酸鈉的代謝過程可以簡化如圖1表示[9]。其反應(yīng)方程式可以簡化如下：

C6H12O6+12O2→C6H12O7；

C6H12O7+NaOH→C6H12O6Na。

在此發(fā)酵過程中，氧氣不僅僅用于菌體生長和維持菌體的基本代謝，還作為生成葡萄糖酸反應(yīng)的基本底物之一。因此發(fā)酵過程中的攝氧率（OUR）是非常重要的生理參數(shù)之一。用數(shù)學模型研究發(fā)酵動力學可以很好地揭示發(fā)酵過程中菌體生長、底物消耗和產(chǎn)物形成的規(guī)律，在預測微生物發(fā)酵過程和指導工藝優(yōu)化方面起著很重要的作用[10]；但是傳統(tǒng)的葡萄糖酸發(fā)酵動力學在預測和進行工藝優(yōu)化時面臨較大的局限性，如產(chǎn)物和菌體量難以較快離線測定。本研究基于發(fā)酵過程中過程質(zhì)譜儀檢測分析尾氣成分及經(jīng)Biostar軟件采集計算所得的OUR、CER等生理參數(shù)，對黑曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的過程進行在線參數(shù)分析，建立底物消耗動力學、產(chǎn)物生成動力學及得率的動力學方程。該模型可以很好地描述黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸的過程，可為工藝優(yōu)化及自動化控制軟件設(shè)計提供較好的參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger），由山東福洋生物科技有限公司實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基組成

斜面孢子培養(yǎng)基：葡萄糖 60 g/L、尿素 2 g/L、KH2PO4 13 g/L、MgSO4·7H2O 0.02 g/L、玉米漿 1 g/L、CaCO3 5 g/L、瓊脂 2 g/L，調(diào)pH值至6.5～7.0，在0.1 MPa、121 ℃條件下滅菌30 min?？刂婆囵B(yǎng)溫度和濕度，溫度35 ℃，濕度40%，培養(yǎng)周期36～48 h。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖 300 g/L、（NH4）2HPO4 1 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4·7H2O 0.02 g/L、玉米漿30 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 300 g/L、（NH4）2HPO4 2 g/L、KH2PO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.02 g/L、玉米漿 20 g/L。

1.3 分析檢測方法

菌濃度的測定：取50 mL發(fā)酵液，微孔濾膜（0.8 μm，上海迪清過濾技術(shù)有限公司）過濾，去離子水沖洗菌絲體5次，80 ℃ 烘干至質(zhì)量恒定，電子天平稱質(zhì)量。

葡萄糖的檢測：取發(fā)酵液過濾所得清液，稀釋到適當濃度，用菲林法[11]滴定。

葡萄糖酸鈉的檢測：取發(fā)酵液所得清液，稀釋適當倍數(shù)，HPLC（HP1100，安捷倫）測定，流動相為3 mol/L甲醇-0.25 mol/L 磷酸溶液（1 ∶1），流速1 mL/min，柱溫28 ℃，每次進樣20 μL。

pH值與溶氧（DO）的測定：pH值、DO均用梅特勒電極測定。

發(fā)酵過程尾氣的采集：采用Extrel過程質(zhì)譜MAX300-LG對發(fā)酵過程中的進氣和尾氣進行實時在線采集分析，該質(zhì)譜儀能夠精確測定發(fā)酵過程尾氣中的氬氣、氮氣、二氧化碳和氧氣等相對分子質(zhì)量在300以內(nèi)的可揮發(fā)性氣體。在使用之前用標準氣體對儀器的響應(yīng)度進行標定[12-13]。

攝氧率（OUR）和二氧化碳的生成速率（CER）測定[14]：OUR和CER通過對發(fā)酵尾氣的分析數(shù)據(jù)計算得到。以進氣和尾氣中惰性氣體N2維持恒定建立平衡方程，求得OUR和CER的計算公式如下：

OUR=FinV[CO2，in-Cinertin×CO2，in1-（CO2，out+CCO2，out]×273273+Tin×11+h×Pin×1×10-5；

CER=FinV[Cinertin×CCO2，in1-（CO2，out+CCO2，out）-CCO2，in]×273273+Tin×11+h×Pin×1×10-5；

RQ=CEROUR。

式中：Fin為通氣速率；V是發(fā)酵液體積；Cinertin、CO2，in、CCO2，in分別是進氣中惰性氣體、氧氣及二氧化碳的體積分數(shù)；CO2，out、CCO2，out分別是出氣中氧氣及二氧化碳的體積分數(shù)；Pin為進氣的絕對壓強；Tin 是進氣溫度；h為進氣的相對濕度；RQ為呼吸熵。

1.4 培養(yǎng)方法

種子的培養(yǎng)：在無菌條件下，將孢子培養(yǎng)基斜面上的孢子用去離子水洗下，接入5 L發(fā)酵罐（裝液量3 L）的種子生長培養(yǎng)基中，在37 ℃、通風量300 L/h、pH值用10 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)維持在5.8的條件下培養(yǎng)18～20小時。

分批發(fā)酵培養(yǎng)：將制備好的種子培養(yǎng)液在無菌條件下按接種量10%轉(zhuǎn)入5 L發(fā)酵罐（裝液量3 L）中，溫度維持在 37 ℃，通風量300 L/h并保持一定攪拌轉(zhuǎn)速，pH值用10 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)維持在5.8的條件下培養(yǎng)至殘?zhí)墙抵?0 g/L以下時，發(fā)酵結(jié)束。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉發(fā)酵過程在線參數(shù)分析

為了了解黑曲霉發(fā)酵葡萄糖酸鈉過程中，在線生理參數(shù)OUR、CER伴隨殘?zhí)菨舛?、葡萄糖酸濃度變化而波動的?guī)律，進行了不同攪拌轉(zhuǎn)速條件下的3組分批發(fā)酵試驗，結(jié)果見圖2、圖3和圖4。試驗組1：維持恒定轉(zhuǎn)速250 r/min；試驗組2：維持恒定轉(zhuǎn)速350 r/min；試驗組3：維持恒定轉(zhuǎn)速450 r/min。

在通氣量、溫度、壓力都一定的情況下，可以通過提高轉(zhuǎn)速改善供氧，了解發(fā)酵過程中底物葡萄糖濃度、產(chǎn)物葡萄糖酸鈉濃度和在線生理參數(shù)OUR、CER及RQ在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律。從圖2可以看出，黑曲霉經(jīng)過短暫延滯期后進入對數(shù)生長期，葡萄糖消耗速率和葡萄糖酸鈉生成速率都逐漸加快并達到較穩(wěn)定值。隨著發(fā)酵的進行，OUR逐漸增大并在對數(shù)生長期結(jié)束的時候逐漸達到一個穩(wěn)定值，CER在對數(shù)生長期結(jié)束時達到最大值，然后緩慢降低。從圖2可以看出，隨著發(fā)酵攪拌轉(zhuǎn)速提高，供氧能力增強[15]，底物葡萄糖消耗速率和產(chǎn)物葡萄糖酸鈉生成速率明顯增大。而從圖3和圖4可以看出，250 r/min 試驗組OUR和CER最高分別在28.5 mmol/（h·L）和 3.1 mmol/（h·L） 左右，350 r/min試驗組OUR和CER最高分別在37.6 mmol/（h·L）和3.6 mmol/（h·L）左右，450 r/min試驗組OUR和CER最高分別在 45.2 mmol/（h·L） 和4.2 mmol/（h·L）左右，同時第3組試驗OUR和CER增長速率明顯快于前2組試驗。供氧能力提升導致耗糖速率和產(chǎn)酸速率的升高與OUR的增長有一致性。與此同時，供氧的改變并未導致3組試驗發(fā)酵末期CER有太大的差異，這主要是因為CER受菌濃度和菌體自身代謝所影響，發(fā)酵末期菌體增長基本停止，CER僅僅受菌體維持代謝強度影響。而3組試驗最高菌濃度分別為4.78、4.96、4.82 g/L，差別非常小。從試驗穩(wěn)定期計算所得的RQ看，第1組試驗穩(wěn)定期RQ為0.1左右，第2組試驗穩(wěn)定期RQ為0.08左右，第3組試驗穩(wěn)定期RQ為0.06左右。3組試驗穩(wěn)定期間的產(chǎn)物得率分別為78.9%、843%和88.6%。即RQ降低的同時伴隨著底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的得率在升高。同時OUR和RQ的變化是在一定范圍內(nèi)的，黑曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的實際發(fā)酵過程中，OUR一般為0～80 mmol/（h·L），RQ一般為0.04～0.2。

2.2 基于在線參數(shù)的宏觀動力學的建立

2.2.1 底物消耗動力學 發(fā)酵過程中，底物消耗主要用于以下3個方面：一是菌體的生長消耗，二是用于產(chǎn)物的合成，三是用于菌體基本生命活動的維持。因此傳統(tǒng)的底物消耗動力學模型可以用如下方程來表示[16]：

-dSdt=1YX/S×dXdt+1YP/S×dPdt+mX。（3）

式中：S為葡萄糖質(zhì)量濃度（g/L）；t為時間（h）；YX/S為葡萄糖用于菌體生長的得率常數(shù)；X為菌體濃度（g/L）；YP/S為葡萄糖用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)；P為葡萄糖酸鈉濃度（g/L）；m為維持常數(shù)。該方程雖然可以較好地描述葡萄糖酸鈉的發(fā)酵過程，但在實際發(fā)酵過程中，由于產(chǎn)物得率和菌體維持所用底物消耗并不為常數(shù)，得率和維持系數(shù)會隨著發(fā)酵條件的改變而改變。而且該方程用到的物理量如菌濃度X難以快速檢測，因此該方程在指導工藝優(yōu)化的過程中作用十分有限。經(jīng)過上述分析我們知道底物消耗和攝氧率（OUR）有密切的關(guān)系，我們提出如下經(jīng)驗公式來描述黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸鈉過程中底物的消耗：

-dSdt=kOUR+h（8≤OUR≤80）。

即OUR在8～80范圍內(nèi)，耗糖速率和OUR接近于線性關(guān)系，實際發(fā)酵過程中，OUR也在這個范圍內(nèi)，為了進一步縮小方程造成的計算誤差，用如下二次項方程代替線性方程，可以取得更精確的計算值。

-dSdt=αOUR2+βOUR+λ。（4）

式中：S為葡萄糖濃度（mmol/L），OUR為攝氧率（mmol/L），α、β、λ均為為常數(shù)。

2.2.2 RQ與得率的相關(guān)性分析 如上所述，底物葡萄糖一部分用于產(chǎn)物葡萄糖酸鈉的合成，一部分用于菌體的生成，一部分用于菌體維持，葡萄糖生成葡萄糖酸是一個不生成CO2的過程，也就是說是一個RQ為0的反應(yīng)過程。菌體量的增加和菌體的維持伴隨著CO2的釋放，葡萄糖酸鈉發(fā)酵過程中的RQ是葡萄糖3個代謝去向的共同結(jié)果，呼吸熵RQ就可以在一定程度上表征得率的高低?？梢杂萌缦路匠虂砻枋霭l(fā)酵過程中RQ和得率的關(guān)系：

Yield=δRQ2+γRQ+（0.05≤RQ≤0.18）。（5）

式中，δ、γ、φ均為常數(shù)。

2.2.3 產(chǎn)物生成動力學 傳統(tǒng)發(fā)酵動力學認為，黑曲霉生產(chǎn)葡萄糖酸鈉是一個生長偶聯(lián)型，用如下方程來描述[17]：

dPdt=αdXdt+βX。（6）

式中：P為葡萄糖酸鈉濃度（g/L）；α、β為動力學參數(shù)；αdXdt為與菌體生長率相關(guān)的產(chǎn)物形成率；βX為非伴隨菌體生長的產(chǎn)物形成率。該模型與傳統(tǒng)底物消耗動力學模型類似，在實際過程中也存在α、β為變量，菌濃度難以快速測定導致無法快速了解發(fā)酵過程產(chǎn)物生成的情況。因此根據(jù)式（6）又可進行如下描述：

dPdt=Yield×dSdt。（7）

將式（4）、式（5）帶入式（7）得，發(fā)酵過程中葡萄糖酸鈉生成動力學方程如下：

dPdt=（αOUR2+βOUR+γ）（δRQ2+γRQ+）。（8）

式中，P為葡萄糖酸鈉濃度（mmol/L）。

2.2.4 模型參數(shù)的求解 根據(jù)實際測得的數(shù)據(jù)，應(yīng)用Origin軟件，采用通用全局優(yōu)化算法，根據(jù)不同批次分批發(fā)酵的OUR和分別對應(yīng)底物消耗速率曲線和得率與RQ相關(guān)性曲線進行非線性曲線擬合，得到擬合曲線，并得到參數(shù)最優(yōu)估計值（表1）。

根據(jù)表1數(shù)據(jù)，得到黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖酸鈉過程中動力學模型分別為：底物消耗動力學模型： -dSdt=-0.099 4OUR2+2.830 9OUR-10.893 5；發(fā)酵過程中得率模型：Yield=-6.093 2RQ2-1.603 3RQ+1.0161（0.04≤RQ≤0.2）；產(chǎn)物合成動力學模型：dPdt=（-0.009 4OUR2+2.830 9OUR-10.893 5）（-6.093 2RQ2-1.603 3RQ+1.016 1）。

表1 葡萄糖酸鈉發(fā)酵動力學模型參數(shù)估計

參數(shù)αβλδγφ

估計值-0.009 42.830 9-10.893 5-6.093 2-1.603 31.016 1

圖5為不同OUR下的分批發(fā)酵過程中底物消耗曲線，圖6為不同RQ下得率變化曲線，其相關(guān)系數(shù)分別為0.994 8、0990 8。可見這2個模型能很好地描述葡萄糖酸鈉發(fā)酵過程中的底物消耗、產(chǎn)物生成得率情況。

2.2.5 發(fā)酵動力學模型誤差檢驗 為了驗證模型的準確性，在相同的培養(yǎng)基條件下進行分批發(fā)酵的重復試驗，轉(zhuǎn)速設(shè)為450 r/min，通氣量為300 L/h，對分批發(fā)酵試驗過程中底物消耗速率和產(chǎn)物生成速率的實際測量值和模型計算值進行比較，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，0 h種子剛接入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)， 由于處

在延滯期的初始階段，OUR和CER值都很低，此時葡萄糖消耗速率和葡萄糖酸鈉產(chǎn)物生成速率都非常低，難以有效測出，同時經(jīng)過模型計算所得耗糖速率和產(chǎn)物生成速率為負值。這主要是因為此時的OUR已經(jīng)不在模型的適用范圍之內(nèi)所致，但這并不妨礙該模型的實用性，因為在用黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖酸鈉的實際過程中，除了延滯期的初始階段會有較低水平的OUR外，其他階段的OUR水平都在該模型使用范圍之內(nèi)。除了0 h的數(shù)據(jù)誤差較大外，發(fā)酵周期內(nèi)的其他時間葡萄糖消耗速率和葡萄糖酸鈉合成速率的實際測量值與模型計算值誤差都保持在10%以內(nèi)。

3 結(jié)論與討論

微生物發(fā)酵是一個非常復雜的過程，菌體的生長，底物的消耗和產(chǎn)物的生成往往受多種因素的影響。通過將黑曲霉分批發(fā)酵葡萄糖酸鈉過程尾氣分析所得的OUR、CER及RQ等在線參數(shù)與發(fā)酵過程相關(guān)聯(lián)，本研究認為OUR越高，其發(fā)酵過程耗糖速率就越高，發(fā)酵周期相應(yīng)越短；RQ越低，發(fā)酵過程得率就會越高。并根據(jù)此種關(guān)聯(lián)，提出了底物消耗速率、得率及產(chǎn)物生成速率與在線參數(shù)RQ、OUR相關(guān)的數(shù)學模型。相比于傳統(tǒng)的底物消耗模型和產(chǎn)物生成模型，該模型在實際發(fā)酵過程中可以很好地描述底物的消耗、發(fā)酵過程中得率的高低及產(chǎn)物生成速率而不用去考慮菌體量的多少。該模型優(yōu)點在于方程變量可以通過計算機迅速得到，從而為發(fā)酵過程中工藝的優(yōu)化提供有實際意義的指導。

參考文獻：

[1]Ramachandran S，F(xiàn)ontanille P，Pandey A，et al. Gluconic acid：properties，applications and microbial production[J]. Food Technology and Biotechnology，2006，44（2）：185-195.

[2]Anastassiadis S，Morgunov I G. Gluconic acid production[J]. Recent patents on biotechnology，2007， 1（2）：167-180.

[3]Singh O V，Kumar R. Biotechnological production of gluconic acid：future implications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2007， 75（4）：713-722.

[4]姜菲菲，李丕武，馬春玲，等，產(chǎn)葡萄糖酸鈉黑曲霉培養(yǎng)條件優(yōu)化研究[J]. 中國釀造，2009，28（10）：61-63.

[5]Blom R H，Pfeifer V F，Moyer A J，et al. Sodium gluconate production. Fermentation with Aspergillus niger[J]. Industrial & Engineering Chemistry，1952，44（2）：435-440.

[6]黃道震，余麗秀.葡萄糖酸鈉的生產(chǎn)工藝及研究動態(tài)[J]. 河南化工，1999（5）：35-36.

[7]黃騰華. 葡萄糖酸鈣和葡萄糖酸鈉發(fā)酵[J]. 發(fā)酵科技通訊，2006，35（3）：22-23.

[8]蔡 皓，余 超，李 慶. 黑曲霉葡萄糖酸發(fā)酵的工藝控制方法[J]. 化學與生物工程，2008，25（6）：63-66.

[9]張 靜. 黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的研究[D]. 無錫：江南大學，2008：7-10.

[10]周玉平，周 潔. 微生物連續(xù)發(fā)酵模型及其應(yīng)用綜述[J]. 微生物學通報，2010，37（2）：269-273.

[11]儲 炬，李友榮，俞俊棠. 葡萄糖氧化酶發(fā)酵動力學的研究[J]. 華東理工大學學報，1997（6）：303-309.

[12]王然明，王澤建，田錫煒，等. 生物過程尾氣質(zhì)譜儀在乳酸發(fā)酵工藝控制中的應(yīng)用[J]. 華東理工大學學報 ：自然科學版，2013（3）：10-15.

[13]Wang Z J，Wang H Y，Li Y L，et al. Improved vitamin B12 production by step-wise reduction of oxygen uptake rate under dissolved oxygen limiting level during fermentation process[J]. Bioresource technology，2010，101（8）：2845-2852.

[14]張嗣良，儲 炬. 多尺度微生物過程優(yōu)化[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2003：97-150.

[15]溫 玲，路 飛，王澤建，等. 供氧水平對黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的影響[J]. 食品工業(yè)科技，2014，35（7）：154-157.

[16]張小昊，童群義. 黑曲霉生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的分批發(fā)酵動力學模型[J]. 食品工業(yè)科技，2010，31（12）：221-223.

[17]Liu J Z，Weng L P，Zhang Q L，et al. A mathematical model for gluconic acid fermentation by Aspergillus niger[J]. Biochemical Engineering Journal，2003，14（2）：137-141.