雞腿菇原生質(zhì)體制備與再生研究

盧月霞　鄭素月　柳煥章

摘要：以雞腿菇雙核菌絲為材料，利用溶壁酶制備原生質(zhì)體，采用單因素試驗(yàn)確定最佳條件。結(jié)果表明，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高的條件是取菌齡為5 d的液體靜置培養(yǎng)的菌絲體，以0.6 mol/L蔗糖為滲穩(wěn)劑，在酶解溫度30 ℃、酶濃度 20 g/L、菌絲量20 g/L的條件下酶解3 h，制備的原生質(zhì)體量為 2.5×107個(gè)/mL。將制備的原生質(zhì)體稀釋并涂布于再生培養(yǎng)基，再生率為10.9%，研究為雞腿菇原生質(zhì)體融合及優(yōu)良品種選育提供研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞腿菇；原生質(zhì)體；制備；再生

中圖分類號(hào)： S646.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0260-02

雞腿菇別稱毛頭鬼傘（Coprinus comotus），是一種具有營(yíng)養(yǎng)保健功能的珍稀食用菌，是人工開(kāi)發(fā)的具有商業(yè)潛力的珍稀食用菌新品，被譽(yù)為“菌中新秀”。雞腿菇生長(zhǎng)周期短，生物轉(zhuǎn)化率較高，易于栽培，具有降血糖、降血脂、提高免疫活性、抗腫瘤、抑菌等一系列生物活性[1]，深受消費(fèi)者歡迎。

近年來(lái)，原生質(zhì)體技術(shù)成為了研究蕈菌生理、生化、遺傳等基礎(chǔ)理論和改良菌種的一種重要方法和有效手段[2]。該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交、擴(kuò)大遺傳物質(zhì)的重組范圍以及基因轉(zhuǎn)化和定向誘變，獲得具有突出優(yōu)良性狀的新類型，產(chǎn)生更豐富的遺傳變異[3]。在國(guó)內(nèi)，食用菌原生質(zhì)體融合正在廣泛地開(kāi)展，進(jìn)行原生質(zhì)體融合，首先必須獲得大量有活力的原生質(zhì)體，因此必須對(duì)原生質(zhì)體的分離和再生條件做深入研究[4]。迄今為止，關(guān)于雞腿菇原生質(zhì)體制備和再生的研究在國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，本研究探索雞腿菇原生質(zhì)體制備及再生的較適條件，旨在為雞腿菇新品種選育及基因工程研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 雞腿菇1號(hào)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所提供，為ACCC編號(hào)菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）PDA綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 1 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。（2）MYG培養(yǎng)基：麥芽糖10 g，葡萄糖4 g，酵母膏4 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。（3）MYG再生培養(yǎng)基：麥芽糖10 g，葡萄糖4 g，酵母膏4 g，0.6 mol/L蔗糖，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 原生質(zhì)體制備條件研究

將雙核菌絲接種于PDA平板中，于25 ℃培養(yǎng)10 d，再將活化菌絲接種于PDA液體培養(yǎng)基中，于25 ℃靜置培養(yǎng)6～7 d。取新鮮的雞腿菇菌絲用無(wú)菌濾網(wǎng)過(guò)濾，再用無(wú)菌蒸餾水于3 500 r/min洗滌5 min，洗滌2次。無(wú)菌濾紙吸干菌絲水分，分別研究酶解時(shí)間、滲穩(wěn)劑種類、菌絲量、菌齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生量的影響。在優(yōu)化條件下30 ℃酶解完畢后，采用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾法過(guò)濾除去殘留菌絲，濾液于8 000 r/min 洗滌10 min，棄上清液、收集沉淀，適量稀釋后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.2 原生質(zhì)體再生研究

原生質(zhì)體用滲穩(wěn)劑稀釋至 104個(gè)/mL 左右，取0.1 mL涂布于再生培養(yǎng)基上，接種后在恒溫箱25 ℃遮光培養(yǎng)，用無(wú)菌接種針在顯微鏡下挑取單個(gè)原生質(zhì)體菌落，轉(zhuǎn)至PDA試管斜面上，25 ℃再擴(kuò)大培養(yǎng)10 d；最后，根據(jù)單核菌絲無(wú)鎖狀聯(lián)合的特點(diǎn)鏡檢確定挑取的單菌落是否為單核體，舍棄有鎖狀聯(lián)合的個(gè)體，獲取再生菌落，觀察計(jì)數(shù)。再生率=（再生培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)-PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)）/接種數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體制備條件研究

2.1.1 滲穩(wěn)劑種類及酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道，常用的滲穩(wěn)劑包括氯化鉀、硫酸鎂、甘露醇、蔗糖4種，且有機(jī)滲穩(wěn)劑比無(wú)機(jī)滲穩(wěn)劑效果好，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加硫酸鎂的培養(yǎng)基平板長(zhǎng)時(shí)間不凝固，添加氯化鉀的培養(yǎng)基凝固太快，來(lái)不及倒平板。因此，本試驗(yàn)選擇0.6 mol/L甘露醇、蔗糖2種滲穩(wěn)劑，分別取0.01 g菌絲放入酶濃度為 20 g/L 的以0.6 mol/L甘露醇、蔗糖為滲穩(wěn)劑的1 mL無(wú)菌酶解液中，30 ℃酶解5 h，每隔0.5 h取樣測(cè)原生質(zhì)體量。從圖1可以看出，以蔗糖作滲穩(wěn)劑產(chǎn)原生質(zhì)體量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甘露醇，而且隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，原生質(zhì)體量先呈上升趨勢(shì)，在3 h達(dá)到峰值8.1×106個(gè)/mL，隨后又呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)樵诿附獾拈_(kāi)始，菌絲逐漸解體，釋放原生質(zhì)體的速度加快，數(shù)量增多；3 h 后，酶活性降低，且釋放的原生質(zhì)體會(huì)隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而破裂，所以原生質(zhì)體量會(huì)減少。

2.1.2 菌絲量對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

分別稱取0.01、002、0.03、0.04、0.05 g菌絲放入酶濃度為20 g/L的以 0.6 mol/L 蔗糖為滲穩(wěn)劑的1 mL無(wú)菌酶解液中酶解3 h。由圖2可知，菌絲量為0.02 g的酶解液原生質(zhì)體量最高，達(dá)到8.8×106個(gè)/mL；之后隨著菌絲量的增多，原生質(zhì)體量呈下降趨勢(shì)。因此，菌絲量是否適合是影響原生質(zhì)體產(chǎn)量高低的重要因素。

2.1.3 菌齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

分別稱取3、4、5、6、7 d菌齡的純凈菌絲0.02 g，放入酶濃度為20 g/L的以0.6 mol/L蔗糖為滲穩(wěn)劑的1 mL無(wú)菌酶解液中酶解3 h。由圖3可知，5 d 菌齡的菌絲釋放的原生質(zhì)體量最高，而且活力強(qiáng)，多數(shù)含有細(xì)胞核，容易再生；少于或多于5 d菌齡的菌絲細(xì)胞過(guò)于幼嫩或老化，不易被酶解，因此原生質(zhì)體量較少，活力差。優(yōu)化條件下制備的原生質(zhì)體量為2.5×107個(gè)/mL，該條件下純化的原生質(zhì)體見(jiàn)圖4。

2.2 原生質(zhì)體再生研究

取0.1 mL稀釋到104個(gè)/mL的原生質(zhì)體懸液分別涂布以甘露醇、蔗糖為滲穩(wěn)劑的再生培養(yǎng)基平板，以不加滲穩(wěn)劑的PDA 平板作對(duì)照，25 ℃下恒溫培養(yǎng)，8 d后再生菌落肉眼可見(jiàn)，對(duì)照板無(wú)菌落出現(xiàn)，說(shuō)明原生質(zhì)體已經(jīng)純化。在不同滲穩(wěn)劑平板上原生質(zhì)體再生率明顯不同。其中蔗糖板再生率為10.9%，甘露醇板再生率為8%，可見(jiàn)雞腿菇再生培養(yǎng)基的最適滲穩(wěn)劑不是甘露醇，而是蔗糖。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，雞腿菇原生質(zhì)體產(chǎn)量最高的條件是取菌齡為5 d的液體靜置培養(yǎng)的菌絲體，以0.6 mol/L蔗糖為滲穩(wěn)劑，在酶解溫度30 ℃、酶濃度20 g/L、菌絲量20 g/L的條件下酶解 3 h，優(yōu)化條件下制備的原生質(zhì)體量為2.5×107個(gè)/mL。將純化的原生質(zhì)體稀釋并涂布于蔗糖板再生培養(yǎng)基，再生率為109%。

影響原生質(zhì)體產(chǎn)量高低的因素有很多，包括酶解溫度、酶濃度、酶解時(shí)間、菌齡、滲穩(wěn)劑種類等。本研究分析主要因素對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響，初步分析雞腿菇原生質(zhì)體制備和再生條件，為雞腿菇新品種選育提供研究基礎(chǔ)。

本研究通過(guò)對(duì)雞腿菇原生質(zhì)體制備及再生條件的初步研究，優(yōu)化了其制備條件，為進(jìn)一步開(kāi)展原生質(zhì)體技術(shù)研究及育種奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]何 文. 雞腿菇營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高開(kāi)發(fā)前景廣闊[J]. 資源開(kāi)發(fā)與利用，2000（4）：11-12.

[2]劉文芳，郭成金. 白靈菇原生質(zhì)體制備與再生研究[J]. 天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，32（1）：88-92.

[3]朱 堅(jiān)，張 鵬. 白靈菇原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（25）：153-157.

[4]廖漢泉，邱景蕓，吳月嫦. 香菇菌絲原生質(zhì)體分離與再生條件的研究[J]. 遺傳，1990，12（6）：8-11.

[5]劉玉霞，王 謙，陳瑞玲，等. 白靈菇原生質(zhì)體制備及再生的研究[J]. 食用菌，2009（4）：24-25.