慢性氟中毒對公雞睪丸組織細胞周期的影響

郭全海　趙耀光

摘要：通過研究慢性氟中毒對公雞生精細胞細胞周期的影響，探討慢性氟中毒對公雞睪丸組織造成損害的機制。試驗將36羽160日齡的三黃公雞隨機均分為染氟組、對照組，并進行常規(guī)飼養(yǎng)，對照組飲用自來水，染氟組飲用含量為3.25 g/L的NaF水。飼喂80 d后，采用流式細胞儀檢測各組公雞睪丸生精細胞的細胞周期變化。與對照組相比，染氟組公雞睪丸生精細胞于S期數(shù)量減少，并于G0/G1期數(shù)量增多，且G1期與S期的細胞數(shù)量呈顯著負相關關系。試驗結果表明，染氟組公雞睪丸生精細胞的細胞周期發(fā)生了顯著改變。

關鍵詞：氟中毒；公雞；睪丸組織；細胞周期

中圖分類號： S858.317.29 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0234-02

收稿日期：2014-10-29

基金項目：河南省商丘市科技計劃（編號：20122023）。

作者簡介：郭全海（1980—），男，河南淮陽人，碩士，講師，主要從事分子生物學、免疫學、動物疫病防治等方面的研究。E-mail：guohan611@163.com。

氟是動物機體必需的微量元素，但其化學性質(zhì)活潑，安全范圍窄，過量攝入可引起氟中毒[1]。長期以來，人們對氟的研究主要集中于其對骨骼、牙齒等骨相組織的損害，而非骨相方面的研究卻很少。近年來有學者指出，慢性氟中毒可對機體非骨相組織造成很大損傷，已引起人們重視[2]。細胞從一次分裂結束到下一次分裂結束的時間稱為細胞周期，大量研究表明，氟化物可引起細胞周期的改變。采用細胞培養(yǎng)的方法觀察氟對二倍體成纖維細胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)氟對不同細胞非同步化培養(yǎng)的敏感性不同[3]。Hayashi等研究發(fā)現(xiàn)，細胞對氟的敏感性與細胞所處周期的不同時期有關[4]。氟可誘導嚙齒類動物細胞染色體絲裂和斷裂，表明氟對嚙齒類動物細胞周期中的G2期敏感。氟可使大鼠卵巢、小鼠卵巢及子宮的DNA、RNA含量減少。體外細胞培養(yǎng)氟可抑制DNA的合成，表明氟可影響核酸、蛋白質(zhì)的代謝[5]。國內(nèi)外關于氟對機體影響的研究多集中于體外培養(yǎng)細胞、小鼠、大鼠等，而氟對公雞睪丸組織細胞周期的影響尚未見報道。本研究在細胞生物學水平上探討氟對睪丸組織細胞周期的影響，為相關疾病的治療及研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

36羽160日齡雄性三黃雞購于商丘市梁園區(qū)某養(yǎng)雞場，該雞群曾對新城疫、傳染性法氏囊炎、傳染性支氣管炎進行防疫，并對雞球蟲進行過防治。

1.2 主要試劑及儀器

氟化鈉、75%乙醇、PI染液等購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，自配PBS溶液。電子天平（上海天普分析儀器有限公司）、（江蘇國勝實驗儀器廠）、Epics-prolie型流式細胞儀（Coulter公司）、恒溫水浴箱、低速離心機、渦旋振蕩混合器、200目尼龍濾網(wǎng)、手術剪刀、鑷子等。

1.3 試驗動物模型建立

試驗用公雞經(jīng)飼養(yǎng)觀察無病后，隨機分為試驗組、對照組，每組18羽。2組均自由采食全價飼料（購于正大集團公司，含氟量符合國家標準）飼養(yǎng)。試驗組自由飲用NaF含量為3.25 g/L的水；對照組自由飲用自來水（含氟量符合國家標準）。所有試驗雞均采用單籠飼養(yǎng)，試驗期為80 d。

1.4 取樣及單細胞懸液的制備

飼養(yǎng)第80天將試驗雞剖殺，于4 ℃環(huán)境下取出睪丸，剔除周圍結締組織，取每羽公雞右側(cè)睪丸采樣，制備單細胞懸液，用于不同周期細胞比例的檢測。剪取大小約為0.5 cm3的睪丸組織塊，用眼科組織剪剪為1～2 mm大小的碎片，置于含3 mL PBS溶液（pH值為7.4）的試管內(nèi)，于渦旋振蕩混合器混合3 min后，用200目尼龍濾網(wǎng)過濾至另一試管內(nèi)。將睪丸組織單細胞懸液以1 500 r/min離心5 min后棄上清，加入3 mL PBS溶液并混勻1 min，于同樣條件重復洗滌離心2次即制成單細胞懸液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 睪丸組織細胞周期的測定

采用流式細胞儀PI染色法測定睪丸組織細胞周期。用PBS溶液沖洗單細胞懸液2次，將細胞濃度調(diào)整為106個/mL，加入75%乙醇于4 ℃固定1 h，使用PBS溶液沖洗2次后，每管依次加入PBS溶液100 μL、PI染液300 μL，置于4 ℃避光環(huán)境中反應30 min。采用Epics-prolie型流式細胞儀檢測細胞周期，計算不同倍體細胞亞二倍體峰所占的比例。

2 結果與分析

2.1 鑒定慢性氟中毒試驗模型

試驗第28天，試驗組公雞開始出現(xiàn)雞冠變紫、頭下耷、精神委頓、食欲不振、羽毛粗糙等癥狀；試驗第73天左右，試驗組大量公雞臥地不起，表明雞慢性氟中毒模型建立成功。

2.2 睪丸組織不同周期細胞的比例

分別將試驗組、對照組的公雞隨機均分為6個小組，每組3羽，計算各組平均值并比較不同周期細胞的比例（表1、圖1）。

經(jīng)t檢驗，對于G1期、S期、G2期，試驗組與對照組的差異均極顯著（P<0.01）。

由圖1可知，試驗組G1期細胞比例高于對照組，而G2期、S期細胞比例均低于對照組。由表1可知，試驗組G1期與S期細胞比例呈顯著負相關關系，而對照組則未表現(xiàn)出此關系。

3 討論與結論

關于氟對細胞周期的影響已有很多報道。Sato等采用細胞培養(yǎng)的方法觀察氟對二倍體成纖維細胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)氟同步化培養(yǎng)S期細胞8 h后，DNA合成被抑制[3]。Hayashi等發(fā)現(xiàn)，人二倍體成纖維細胞各氟染毒組S期細胞數(shù)明顯高于對照組[4]。余日安等研究發(fā)現(xiàn)，投氟組S期腎組織細胞數(shù)明顯增加，G0/G1期、G2/M期細胞數(shù)無明顯變化[6]。一些學者則持相反意見。張桂珍等研究小鼠腦、肝、腎等組織并指出，氟對腦神經(jīng)細胞的影響主要作用于S期（DNA合成期），它可減少進入S期的細胞數(shù)，從而使S期、G2/M期細胞數(shù)均減少；氟對肝細胞周期的影響主要作用于G1期和G2期，它可使G1期、G2期細胞數(shù)量顯著增加；過量氟對腎細胞周期的作用主要是抑制細胞凋亡，而當氟濃度達到100 mg/L時，可引發(fā)睪丸細胞凋亡[7]。有研究表明，長期飲用氟污染的水將使睪丸間質(zhì)細胞受到嚴重損壞，且血漿睪丸酮會明顯降低[8-10]。本試驗結論為試驗組G1期細胞比例顯著高于對照組，G2期、S期細胞比例顯著低于對照組，且G1期與S期細胞比例呈顯著負相關關系，這與張桂珍等對腦組織的研究結論一致。而本試驗結論與其他學者的結論仍存在差異，主要是由試驗動物及所研究細胞種類的不同而造成的。以往大多數(shù)試驗均在大鼠、小鼠等動物機體中進行，或?qū)⒎c作用于人工培養(yǎng)的細胞，而本研究的試驗動物則為公雞；其他學者主要以肝、腎、骨等組織細胞進行試驗，而本試驗選用的是睪丸組織的生精細胞，由于睪丸存在血睪屏障，對氟化鈉的進入有一定影響，可能導致試驗結果有差異。張桂珍等的試驗部位是小鼠腦部神經(jīng)組織，而存在于腦部的血腦屏障也可對氟化鈉的進入產(chǎn)生影響，這可能是本試驗結論與張桂珍等的結論一致而不同于其他學者的主要原因。

氟對睪丸組織生精細胞的細胞周期產(chǎn)生影響，主要通過抑制S期DNA的合成及修復過程，以影響細胞從S期到G2/M期過渡的準備工作，從而使S期細胞減少，同時對S期細胞進入G2期的過程產(chǎn)生抑制作用，并對細胞進入G1期產(chǎn)生較強的促進作用。本研究在細胞生物學水平上探討了氟對睪丸組織生精細胞產(chǎn)生影響的機制，為家禽氟病的防治提供理論參考。氟對動物細胞周期的影響與試驗動物、組織器官的種類均有關，氟對同一動物不同組織，或不同動物相同、不同組織的影響均可能相同或有差異。

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