• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    犬細(xì)小病毒病DNA疫苗的研究進(jìn)展

    2015-08-20 02:59:06吳植曹斌王安平王永娟吳鵬朱建華
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年7期
    關(guān)鍵詞:細(xì)小抗原質(zhì)粒

    吳植 曹斌 王安平 王永娟 吳鵬 朱建華

    摘要:犬細(xì)小病毒病是犬的一種具有高度接觸性的烈性傳染病。近年來,在犬細(xì)小病毒新型疫苗研究方面取得了新的進(jìn)展,特別是DNA疫苗,筆者就犬細(xì)小病毒DNA疫苗的作用機(jī)理、抗原基因、載體選擇、分子佐劑的研究進(jìn)展方面進(jìn)行系列論述。

    關(guān)鍵詞:犬;細(xì)小病毒;DNA疫苗

    中圖分類號: S858.292.265+.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2015)07-0231-03

    犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的一種急性傳染病,該病毒屬細(xì)小病毒科,細(xì)小病毒屬[1]。病毒經(jīng)消化道感染健康犬后,主要攻擊2種細(xì)胞,一是腸上皮細(xì)胞,二是心肌細(xì)胞,分別表現(xiàn)出血性腸炎型和非化膿性心肌炎型,心肌炎以幼犬多見[2-3]。CPV自1978年被首次分離以來[4],已在世界范圍內(nèi)迅速傳播。目前,該病主要通過弱毒苗預(yù)防,但免疫效果不理想[5-6],因此,新型基因工程疫苗逐漸成為研究的熱點(diǎn),特別是DNA疫苗倍受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。

    1 作用機(jī)理

    DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗,是20世紀(jì)90年代Wolff等首創(chuàng)的新型疫苗[7],把主要抗原基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上,然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注入動(dòng)物體內(nèi),使外源基因通過宿主細(xì)胞合成抗原蛋白,進(jìn)而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答[8-9]。

    DNA疫苗接種機(jī)體后,質(zhì)粒被周圍的組織細(xì)胞(如肌細(xì)胞)抗原遞呈細(xì)胞(APC)或其他炎性細(xì)胞攝取,被吸收的質(zhì)粒在機(jī)體啟動(dòng)子作用下合成mRNA,并被細(xì)胞質(zhì)中的酶復(fù)合物-蛋白酶體所降解,形成氨基酸肽段,然后經(jīng)抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔進(jìn)一步修飾成氨基酸短肽[10]。這些短肽片段在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔與新合成的MHC-Ⅰ分子的抗原結(jié)合槽相結(jié)合,形成抗原肽-MHC-分子復(fù)合物,并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面作為免疫原信號肽供 CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)所識別,導(dǎo)致其活化、增值并分化為具有殺傷能力的效應(yīng) CTL,誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)[11]。

    另一部分蛋白抗原從分泌它們的APC的細(xì)胞膜上進(jìn)入MHC-Ⅱ類型途徑,DNA疫苗基因表達(dá)的抗原蛋白未經(jīng)加工被釋放出去由專職的APC攝取后,在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過吞噬體和溶酶體作用后被降解成具有抗原特異性的多肽,這些多肽同細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生的 MHC-Ⅱ分子相結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上,被CD4+輔助性T細(xì)胞(Th)的受體識別。Th細(xì)胞分泌淋巴因子,刺激B 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞,產(chǎn)生抗體,誘導(dǎo)了抗原特異型的體液免疫應(yīng)答[12]。

    DNA疫苗具有許多優(yōu)點(diǎn):可同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫、可將含有不同抗原基因的質(zhì)粒混合起來聯(lián)合免疫、可在同一載體上插入多種基因、可持續(xù)表達(dá)外源蛋白、易于構(gòu)建和制備、穩(wěn)定性好。近年來,在犬細(xì)小病毒病新型疫苗的研發(fā)中也顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢。

    2 抗原基因

    CPV基因組主要編碼VP1和VP2 2種結(jié)構(gòu)蛋白。VP2基因全長1 755 nt,編碼的584 氨基酸殘基組成的蛋白是構(gòu)成衣殼的主要蛋白,約有60 個(gè)拷貝,VP2上的幾個(gè)關(guān)鍵堿基和氨基酸的變化就會改變抗原特性和宿主范圍[13],表位圖譜試驗(yàn)表明,結(jié)合中和抗體的全部抗原決定基因都在VP2中[14]。VP1基因全長2 256 bp,包含VP2基因的完整閱讀框架,2者的3′端完全重疊。VP1、VP2的序列基本相同,只是VP1的氨基端比VP2多一段氨基序列,這段序列中含有T細(xì)胞識別表位,能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫,而細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)是基因免疫誘導(dǎo)機(jī)體抵抗病原攻擊的一個(gè)重要機(jī)制。因此VP1、VP2都可以作為DNA疫苗的主要抗原基因。

    Parrish等用含CPV VP1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒免疫犬,攻毒保護(hù)試驗(yàn)證明基因疫苗能夠保護(hù)犬不被CPV感染[15]。Jiang W等構(gòu)建了表達(dá)CPV VP1蛋白的真核表達(dá)載體pGT36VP1[16],將5只9月齡的犬分別接種不同劑量的pGT36VP1,結(jié)果顯示免疫1周后,血清中可檢測到抗體IgG,2周左右達(dá)到峰值,約14周后抗體消失,所有免疫pGT36VP1疫苗的犬均能抵抗 CPV強(qiáng)毒的攻擊,而生理鹽水的對照組全部發(fā)病,證實(shí)了接種CPV VP1核酸疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗CPV的特異性免疫反應(yīng)。邱薇等構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES VP1重組質(zhì)粒也能抵抗 CPV強(qiáng)毒的攻擊[17]。

    Gupta等含CPV VP2 DNA質(zhì)粒表達(dá)載體免疫家犬獲得了較好的免疫反應(yīng)[18]。韓冬梅等利用DNAstar軟件對CPV VP2基因以及編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析,確定了VP2蛋白抗原表位基因(VP2蛋白第490~559位氨基酸)[19],即 VP2-70 構(gòu)建了融合的真核表達(dá)載體pcDNACD5sp-LTB-VP2-70,也能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體IgG2a和IgG1,引起淋巴細(xì)胞增殖。

    3 載體選擇

    構(gòu)建基因疫苗之前,載體的選擇十分重要。在CPV DNA疫苗中,常用的載體主要有invitrogen公司的pcDNA系列、pVAX1和Clontech公司的pIRES載體。pcDNA系列載體是常用的真核表達(dá)載體,其啟動(dòng)子和增強(qiáng)子都源于巨細(xì)胞病毒(CMV),含有牛生長激素(BGH)轉(zhuǎn)錄終止序列,不同程度提高了目的基因的表達(dá),但要注意的是插入的片段序列必須自帶ATG起始密碼子和TAG(或TGA、TAA)終止密碼子。pVAX1是在載體pcDNA3.1的基礎(chǔ)上改建而成的一種新型真核表達(dá)載體,是由美國食品和藥品管理委員會(FDA)推薦的唯一可以應(yīng)用于人體試驗(yàn)的核酸疫苗載體。謝之景等利用pVAX1載體構(gòu)建了CPV DNA疫苗的真核表達(dá)質(zhì)粒pVCPV能夠有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗CPV的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫[20]。pIRES載體由于IRES元件的存在,可以同時(shí)表達(dá)2個(gè)基因。Patial等將狂犬病病毒的糖蛋白基因與犬細(xì)小病毒VP2基因連接到pIRES載體,構(gòu)建了能同時(shí)表達(dá)2種抗原蛋白的雙順反子DNA疫苗,同時(shí)分別構(gòu)建了2種抗原的單順反子 pIRES疫苗[21]。將雙順反子DNA疫苗免疫小鼠,并與單順反子疫苗的免疫效果進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),2種DNA疫苗分別對狂犬病病毒和細(xì)小病毒的抗體中和反應(yīng)效果相同,并能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù),證明該雙順反子DNA疫苗作犬用疫苗能夠有效誘導(dǎo)對狂犬病病毒和犬細(xì)小病毒的病毒中和反應(yīng)。

    4 分子佐劑

    犬細(xì)小病毒病DNA疫苗與其他DNA病毒疫苗一樣,存在著免疫原性較弱,免疫動(dòng)物后常常不能產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)性免疫反應(yīng)。為了提高DNA疫苗的免疫效果,研究者們選用了不少分子佐劑來增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性,如CpG、熱應(yīng)激蛋白(HSP)、白細(xì)胞介素類(IL)、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)、集落刺激因子(GM-CSF)等[22-25]。

    王璐等將pcDNA-VP2和pcDNA-cIL-2共免疫小鼠,35 d后血清中VP2的抗體水平(1 ∶5 120)極顯著高于單免疫組;淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明,單免疫組和共免疫組刺激指數(shù)均極顯著高于陰性對照組,共免疫組刺激指數(shù)又顯著高于單免疫組;共免疫組γ-干擾素的表達(dá)水平極顯著高于陰性對照組和單免疫組,cIL-2可顯著提高CPV VP2 DNA疫苗的應(yīng)答水平[26]。孫巖等將pcDNA-CD5-VP2和pcDNA-cIL-7共免疫小鼠,結(jié)果表明,小鼠血清的抗體滴度和中和抗體效價(jià)分別極顯著和顯著高于單免疫組,對IgG2a和IgG1抗體的產(chǎn)生有明顯的促進(jìn)作用;淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和γ-干擾素表達(dá)水平也顯著高于單免疫組,cIL-7可增強(qiáng)小鼠對VP2 DNA疫苗的免疫應(yīng)答[27]。陳慧慧等研究表明,cIL-7和cIL-2對VP2 DNA疫苗免疫原性的增強(qiáng)作用具有協(xié)同效應(yīng)[28]。潘素敏等研究表明,IL-12可顯著提高VP2 DNA疫苗的免疫應(yīng)答水平[29]。

    韓冬梅等研究證明,無論通過LTB基因表達(dá)載體與VP2抗原表達(dá)載體共免疫小鼠或利用LTB與抗原融合基因表達(dá)載體免疫小鼠,LTB基因均可明顯提高小鼠對VP2基因疫苗的體液免疫應(yīng)答水平,但以LTB與VP2融合基因免疫效果明顯[19]。賈啟恒等研究證明,犬GM-CSF可明顯提高小鼠對VP2 DNA疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫的應(yīng)答水平[30]。

    5 展望

    DNA疫苗是新興的一種疫苗,以其獨(dú)特地誘發(fā)機(jī)體高水平細(xì)胞免疫反應(yīng)而倍受研究者關(guān)注,但是DNA疫苗在安全性的方面尚有爭議,如遺傳毒性作用即質(zhì)粒DNA與宿主基因組整合的問題、表達(dá)抗原的載體自身可能有其他生物活性、致腫瘤性、自身免疫疾病等[31]。近年來,研究出的自殺性DNA疫苗,主要以甲病毒(主要是SFV和SINV)復(fù)制子為載體在基因免疫中得到廣泛應(yīng)用[32-33]。實(shí)踐證明,這種以復(fù)制子為基礎(chǔ)的DNA疫苗優(yōu)于常規(guī)DNA疫苗[34]。自殺性DNA疫苗的裂解性表達(dá)消除了DNA疫苗的動(dòng)物機(jī)體內(nèi)長期存在所帶來的各種隱患[35]。目前,犬細(xì)小病毒DNA疫苗的研究雖然道路曲折,但經(jīng)過大量的實(shí)踐研究,仍然認(rèn)為是可行的,DNA疫苗是新的發(fā)展方向,隨著科學(xué)研究的不斷深入,DNA疫苗在犬細(xì)小病毒病的免疫預(yù)防中一定會發(fā)揮更重要的作用。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Langeveld J P,Casal J I,Vela C,et al. B-cell epitopes of canine parvovirus:distribution on the primary structure and exposure on the viral surface[J]. Journal of Virology,1993,67(2):765-772.

    [2]Arker J S,Parrish C R. Cellular uptake and infection by canine parvovirus involves rapid dynamin-regulated clathrin-mediated endocytosis,followed by slower intracellular trafficking[J]. J Virology,2000,74(4):1919-1930.

    [3]Smith J R,Johnson R H. Observations on the use of an inactivated canine parvovirus vaccine[J]. The Veterinary Record,1986,118(14):385-387.

    [4]Appel J G,Scott F W,Carmichae L E,et al. Isolation and immunization studies of a canine parvo-like virus form dogs with haemorrhagic enteritis[J]. The Veterinary Record,1979(105):156-159.

    [5]Pollock R V,Carmichael L E. Use of modified live feline panleukopenia virus vaccine to immunize dogs against canine parvovirus[J]. American Journal of Veterinary Research,1983,44(2):169-175.

    [6]Moore D J. Canine parvovirus immunoprophylaxis:a review[J]. Journal of the South African Veterinary Association,1983,54(4):259-264.

    [7]Wolff J A,Malone R W,Wiliams P,et al. Direct gene transfer into muscle in vivo[J]. Science,1990,247:1465-1468.

    [8]韓 岳,王希良. DNA疫苗的免疫機(jī)制及其優(yōu)化策略[J]. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2005,2(2):143-146.

    [9]Leclerc C. New approaches in vaccine development[J]. Comp Immuol Infect Dis,2003,26:329-341.

    [10]Pasetti M F,Barry E M,Losonsky G,et al. Attenuated salmonella enterica serovar typhi and shigella flexneri 2a strains mucosally deliver DNA vaccines encoding measles virus hemagglutinin,inducing specific immune responses and protection in cotton rats[J]. Journal of Virology,2003,77(9):5209-5217.

    [11]倪 兵,吳玉章. DNA疫苗與CTL[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,22(10):1012-1015.

    [12]Whitton J L,Rodriguez F,Zhang J,et al. DNA immunization:mechanistic studies[J]. Vaccine,1999,17(13/14):1612-1619.

    [13]楊 玲,徐向明,殷 俊,等. CPV分離株VP2基因的克隆與序列分析[J]. 揚(yáng)州大學(xué)報(bào),2002,23(3):12-13.

    [14]López de Turiso J A,Cortés E,Ranz A,et al. Fine mapping of canine parvovirus B cell epitopes[J]. Journal of General Virology,1991,72(10):2445-2456.

    [15]Parrish C R,Oconnell P H,Evermann J F,et al. Natural variation of canine parvovirus[J]. Science,1985,230(4729):1046-1048.

    [16]Jiang W,Baker H J,Swango L J,et al. Nucleic acid immunization protects dogs against challenge with virulent canine parvovirus[J]. Vaccine,1998,16(6):601-607.

    [17]邱 薇,范泉水,李作生,等. 犬細(xì)小病毒核酸疫苗制備及免疫試驗(yàn)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(3):78-81.

    [18]Gupta P K,Rai A,Rai N,et al. Cloning of canine parvovirus VP2 gene and its use as DNA vaccine in dogs[J]. Current Science,2005,88(5):778-782.

    [19]韓冬梅,仲 飛,李秀錦,等. 大腸桿菌LTB亞基基因表達(dá)載體對犬細(xì)小病毒VP2 DNA疫苗免疫應(yīng)答的增強(qiáng)作用[J]. 微生物學(xué)報(bào),2011,51(1):91-97.

    [20]謝之景,夏咸柱,扈榮良,等. 犬細(xì)小病毒核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫小鼠檢測[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2006,14(4):503-506.

    [21]Patial S,Chaturvedi V K,Rai A,et al. Virus neutralizing antibody response in mice and dogs with a bicistronic DNA vaccine encoding rabies virus glycoprotein and canine parvovirus VP2[J]. Vaccine,2007,25(20):4020-4028.

    [22]Pan C H,Chen H W,Tao M H. Modulation of immune responses to DNA vaccines by codelivery of cytokine genes[J]. Journal of the Formosan Medical Association,1999,98(11):722-729.

    [23]Davis H L. Use of CpG DNA for enhancing specific immune responses[J]. Current Topics in Microbiology and Immunology,2000,247:171-183.

    [24]Chow Y H,Huang W L,Chi W K,et al. Improvement of hepatitis B virus DNA vaccines by plasmids coexpressing hepatitis B surface antigen and interleukin-2[J]. Journal of Virology,1997,71(1):169-178.

    [25]Kim J J,Ayyavoo V,Bagarazzi M L,et al. In vivo engineering of a cellular immune response by coadministration of IL-12 expression vector with a DNA immunogen[J]. Journal of Immunology,1997,158(2):816-826.

    [26]王 璐,李秀錦,韓云珍,等. 白細(xì)胞介素-2基因表達(dá)質(zhì)粒對犬細(xì)小病毒VP2 DNA疫苗在小鼠的免疫增強(qiáng)作用[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,32(11):1634-1639,1644.

    [27]孫 巖,仲 飛,李秀錦,等. 犬白細(xì)胞介素-7基因?qū)θ?xì)小病毒DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(10):2058-2066.

    [28]陳慧慧,仲 飛,李秀錦,等. IL-2與IL-7基因?qū)θ?xì)小病毒VP2 DNA疫苗在小鼠的免疫增強(qiáng)作用[J]. 微生物學(xué)報(bào),2012,52(11):1392-1399.

    [29]潘素敏,李秀錦,仲 飛,等. 白細(xì)胞介素-12對犬細(xì)小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,32(2):196-201.

    [30]賈啟恒,溫潔霞,王利月,等. 犬GM-CSF基因?qū)θ?xì)小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,33(5):664-669.

    [31]徐 進(jìn),孫世琪,曹隨忠,等. 犬細(xì)小病毒病基因工程疫苗的研究進(jìn)展[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué),2012,42(5):541-544.

    [32]Dubensky T J,Driver D A,Polo J M,et al. Sindbis virus DNA-base expression vectors:utility for in vitro and in vivo gene transfer[J]. Journal of Virology,1996,70(1):508-519.

    [33]Berglund P,Smerdou C,F(xiàn)leeton M N,et al. Enhancing immune responses using suicidal DNA vaccines[J]. Nature Biotechnology,1998,16(6):562-565.

    [34]Deng Y,Meng X,Xu H L,et al. A comparative study on SFV-base DNA vaccine and the conventional DNA vaccine[J]. Chin J Virol,2002,18(4):328-330.

    [35]向 菁,王紅寧,鮮凌瑾,等. “自殺性”DNA疫苗研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,28(5):83-87.

    猜你喜歡
    細(xì)小抗原質(zhì)粒
    豬細(xì)小病毒感染的防治
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    犬細(xì)小病毒病(CPV)的診斷與治療
    梅毒螺旋體TpN17抗原的表達(dá)及純化
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對其增殖的影響
    結(jié)核分枝桿菌抗原Lppx和MT0322人T細(xì)胞抗原表位的多態(tài)性研究
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    為善小 傳播愛——樂善好施從細(xì)小處開始
    海峽姐妹(2015年5期)2015-02-27 15:10:46
    APOBEC-3F和APOBEC-3G與乙肝核心抗原的相互作用研究
    BAG4過表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的鑒定
    91老司机精品| 99九九在线精品视频| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲国产精品999| 亚洲精品第二区| 丁香六月欧美| 男女国产视频网站| 久久久久精品国产欧美久久久 | 手机成人av网站| 一本综合久久免费| 亚洲色图综合在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产一区二区激情短视频 | 老汉色∧v一级毛片| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲,一卡二卡三卡| 在线观看国产h片| 91国产中文字幕| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 捣出白浆h1v1| 1024香蕉在线观看| 男人添女人高潮全过程视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 五月天丁香电影| 国产片内射在线| 美女主播在线视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| a级毛片黄视频| av网站免费在线观看视频| 97在线人人人人妻| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲av日韩在线播放| 少妇被粗大的猛进出69影院| av国产久精品久网站免费入址| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲av在线观看美女高潮| 人人澡人人妻人| 在线观看免费视频网站a站| 老司机亚洲免费影院| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产成人一区二区在线| 国产一区二区 视频在线| 岛国毛片在线播放| 99国产综合亚洲精品| 十八禁人妻一区二区| 精品久久久久久电影网| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲国产欧美在线一区| 国产成人av激情在线播放| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲成人免费电影在线观看 | 中国美女看黄片| 性少妇av在线| 黄片播放在线免费| 在线 av 中文字幕| 自线自在国产av| 少妇精品久久久久久久| 午夜久久久在线观看| 精品一区在线观看国产| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲成人免费av在线播放| 欧美精品高潮呻吟av久久| videos熟女内射| 中文字幕亚洲精品专区| 久久青草综合色| 国产国语露脸激情在线看| 久久av网站| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 日本wwww免费看| 国产主播在线观看一区二区 | www.av在线官网国产| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产成人一区二区在线| 精品少妇久久久久久888优播| 中文字幕人妻熟女乱码| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产精品国产av在线观看| 免费在线观看影片大全网站 | 夫妻午夜视频| 国产成人精品无人区| 久久久欧美国产精品| 男人添女人高潮全过程视频| 国产精品一区二区在线不卡| 国产亚洲精品第一综合不卡| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | a级毛片黄视频| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美日本中文国产一区发布| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲伊人久久精品综合| 色网站视频免费| 最近手机中文字幕大全| 香蕉丝袜av| 免费高清在线观看日韩| 91精品三级在线观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 老司机靠b影院| 精品一区在线观看国产| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美成人精品欧美一级黄| 一级黄色大片毛片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品久久久久成人av| 亚洲熟女毛片儿| 美女午夜性视频免费| 亚洲,欧美,日韩| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品一国产av| av一本久久久久| 中文字幕高清在线视频| 91麻豆av在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产精品 欧美亚洲| svipshipincom国产片| av又黄又爽大尺度在线免费看| 一级毛片 在线播放| 国产成人欧美在线观看 | 色94色欧美一区二区| 九草在线视频观看| 亚洲久久久国产精品| 国产一区二区激情短视频 | 91九色精品人成在线观看| av国产精品久久久久影院| 黄色a级毛片大全视频| 久久久国产一区二区| 国产97色在线日韩免费| 大码成人一级视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 一本色道久久久久久精品综合| 日韩制服骚丝袜av| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 久久综合国产亚洲精品| 欧美精品av麻豆av| 国产片内射在线| 亚洲精品国产一区二区精华液| 色综合欧美亚洲国产小说| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 777米奇影视久久| 男女之事视频高清在线观看 | 90打野战视频偷拍视频| 女性生殖器流出的白浆| 久久av网站| 男人舔女人的私密视频| 亚洲av综合色区一区| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 精品福利永久在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 99国产精品99久久久久| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 免费观看人在逋| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一本久久精品| 又紧又爽又黄一区二区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 老熟女久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 久久精品国产亚洲av高清一级| 成年美女黄网站色视频大全免费| 欧美精品一区二区大全| 国产男女超爽视频在线观看| 国产三级黄色录像| 久久精品国产亚洲av涩爱| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产91精品成人一区二区三区 | 一级毛片我不卡| 少妇粗大呻吟视频| 久久热在线av| 久久青草综合色| 国产成人啪精品午夜网站| 成人三级做爰电影| 91老司机精品| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲中文字幕日韩| 国产亚洲一区二区精品| 欧美精品亚洲一区二区| 嫩草影视91久久| 免费少妇av软件| 免费看不卡的av| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 十八禁网站网址无遮挡| 精品人妻一区二区三区麻豆| 激情视频va一区二区三区| 99久久人妻综合| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 美女视频免费永久观看网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 午夜视频精品福利| 在线观看人妻少妇| 欧美激情 高清一区二区三区| av有码第一页| 1024视频免费在线观看| 国产成人精品久久久久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 男女免费视频国产| 亚洲av欧美aⅴ国产| 波野结衣二区三区在线| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久九九热精品免费| 少妇人妻久久综合中文| av天堂久久9| 久久青草综合色| 免费在线观看日本一区| 黄色毛片三级朝国网站| 日本欧美视频一区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲天堂av无毛| 亚洲精品国产区一区二| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 波多野结衣av一区二区av| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产97色在线日韩免费| 一边摸一边抽搐一进一出视频| av不卡在线播放| 国产1区2区3区精品| av国产久精品久网站免费入址| 少妇 在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 免费少妇av软件| 国产又色又爽无遮挡免| 免费观看人在逋| 后天国语完整版免费观看| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲情色 制服丝袜| 久久人人爽人人片av| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 91字幕亚洲| 老司机靠b影院| h视频一区二区三区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 欧美大码av| 成人国产av品久久久| 在线观看免费日韩欧美大片| 午夜老司机福利片| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 搡老乐熟女国产| 9191精品国产免费久久| 一边摸一边做爽爽视频免费| 97在线人人人人妻| 国产不卡av网站在线观看| 在线天堂中文资源库| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 黄色片一级片一级黄色片| av天堂久久9| 老司机在亚洲福利影院| 精品人妻1区二区| 欧美黑人精品巨大| 看十八女毛片水多多多| 黄色片一级片一级黄色片| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 丝袜脚勾引网站| 久久久久久久国产电影| 一区福利在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 91九色精品人成在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品久久久av美女十八| 视频区欧美日本亚洲| 国产黄频视频在线观看| 日韩大片免费观看网站| 精品少妇久久久久久888优播| 一级黄片播放器| 亚洲精品一区蜜桃| 黄片小视频在线播放| 亚洲黑人精品在线| 成人国语在线视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲色图综合在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 蜜桃国产av成人99| 免费看不卡的av| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲综合色网址| 亚洲国产欧美网| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 18禁国产床啪视频网站| 久久久亚洲精品成人影院| 午夜老司机福利片| 欧美另类一区| 久久久精品区二区三区| 波野结衣二区三区在线| 欧美精品av麻豆av| 亚洲av综合色区一区| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品三级大全| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久精品国产a三级三级三级| 啦啦啦 在线观看视频| 国产色视频综合| 亚洲情色 制服丝袜| 久久久久久免费高清国产稀缺| 老汉色∧v一级毛片| 美女中出高潮动态图| 性色av乱码一区二区三区2| 老司机影院毛片| 亚洲伊人久久精品综合| 丝袜美足系列| 久久久久国产精品人妻一区二区| 91成人精品电影| 波野结衣二区三区在线| 午夜老司机福利片| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美 日韩 精品 国产| 久久精品国产亚洲av涩爱| 又大又黄又爽视频免费| 真人做人爱边吃奶动态| 女性被躁到高潮视频| av天堂在线播放| a级片在线免费高清观看视频| 大话2 男鬼变身卡| 国产麻豆69| 久久精品久久精品一区二区三区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲少妇的诱惑av| 日本黄色日本黄色录像| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久久久精品国产欧美久久久 | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 中文欧美无线码| 日韩大片免费观看网站| 日日爽夜夜爽网站| 欧美 日韩 精品 国产| 久久久久久久大尺度免费视频| 精品视频人人做人人爽| 亚洲av美国av| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲精品在线美女| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品一区在线观看国产| 亚洲专区国产一区二区| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 免费在线观看日本一区| 国产深夜福利视频在线观看| 视频区图区小说| 国产精品 欧美亚洲| 超碰97精品在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 成年人黄色毛片网站| 免费在线观看日本一区| 欧美 日韩 精品 国产| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲美女黄色视频免费看| 黄片播放在线免费| 黄色 视频免费看| 久久国产精品大桥未久av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产成人a∨麻豆精品| 男女午夜视频在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产精品人妻久久久影院| 老司机影院成人| 国产主播在线观看一区二区 | 99久久综合免费| av在线老鸭窝| 欧美xxⅹ黑人| 美女扒开内裤让男人捅视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产成人一区二区在线| 免费观看a级毛片全部| 一区二区三区四区激情视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产有黄有色有爽视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日韩一区二区三区影片| 十八禁高潮呻吟视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 黄色片一级片一级黄色片| 午夜福利影视在线免费观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 好男人视频免费观看在线| 亚洲精品国产av蜜桃| 午夜福利在线免费观看网站| 爱豆传媒免费全集在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 18禁国产床啪视频网站| 99热国产这里只有精品6| 国产成人免费无遮挡视频| 中文字幕亚洲精品专区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久精品国产综合久久久| 日韩视频在线欧美| 色网站视频免费| 最新的欧美精品一区二区| 一级毛片女人18水好多 | 国产成人精品无人区| 欧美久久黑人一区二区| 国产一级毛片在线| 国产成人精品在线电影| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产欧美日韩一区二区三 | 日韩视频在线欧美| 久久精品成人免费网站| 一区二区三区四区激情视频| 丁香六月天网| 天天操日日干夜夜撸| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲精品国产一区二区精华液| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲国产av影院在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产不卡av网站在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 欧美乱码精品一区二区三区| 在线观看免费视频网站a站| 久久九九热精品免费| netflix在线观看网站| 美女午夜性视频免费| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 日日爽夜夜爽网站| 国产又爽黄色视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久 成人 亚洲| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 男男h啪啪无遮挡| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 热re99久久国产66热| 日韩电影二区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 三上悠亚av全集在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| av网站在线播放免费| 在线观看www视频免费| 黑丝袜美女国产一区| 一级毛片电影观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 久久久久久久久久久久大奶| 脱女人内裤的视频| tube8黄色片| 国产精品一国产av| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 90打野战视频偷拍视频| 亚洲精品乱久久久久久| 国产成人欧美| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产成人免费无遮挡视频| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲综合色网址| 少妇精品久久久久久久| 日本wwww免费看| 三上悠亚av全集在线观看| 后天国语完整版免费观看| 超碰97精品在线观看| 香蕉国产在线看| 久久精品久久久久久久性| 亚洲av国产av综合av卡| 男人爽女人下面视频在线观看| 日本a在线网址| 99久久综合免费| 一二三四社区在线视频社区8| 男女高潮啪啪啪动态图| 老汉色∧v一级毛片| 国产成人精品无人区| 久久99热这里只频精品6学生| 午夜福利一区二区在线看| 在线av久久热| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久免费观看电影| 热99国产精品久久久久久7| 久久久久精品人妻al黑| svipshipincom国产片| 午夜免费成人在线视频| 欧美精品一区二区免费开放| 丝袜脚勾引网站| 黄频高清免费视频| 中文字幕高清在线视频| 尾随美女入室| 午夜久久久在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 亚洲中文字幕日韩| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品久久久久久精品电影小说| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产成人a∨麻豆精品| 老汉色av国产亚洲站长工具| 中文字幕色久视频| 久久精品久久久久久久性| 母亲3免费完整高清在线观看| av在线播放精品| 亚洲第一青青草原| 少妇的丰满在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 99久久综合免费| 90打野战视频偷拍视频| 人人澡人人妻人| 久久久欧美国产精品| 婷婷丁香在线五月| 91字幕亚洲| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品福利观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 不卡av一区二区三区| 老司机影院毛片| 男女国产视频网站| www.自偷自拍.com| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美日韩精品网址| 久久国产精品大桥未久av| 久久99热这里只频精品6学生| 赤兔流量卡办理| 黑人猛操日本美女一级片| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产极品粉嫩免费观看在线| 天堂俺去俺来也www色官网| 交换朋友夫妻互换小说| 午夜91福利影院| 美女高潮到喷水免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产免费又黄又爽又色| 日本vs欧美在线观看视频| 99热全是精品| 电影成人av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久青草综合色| 高清视频免费观看一区二区| 国产成人啪精品午夜网站| 国产日韩欧美在线精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产黄频视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产免费一区二区三区四区乱码| 十八禁网站网址无遮挡| 波多野结衣av一区二区av| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美亚洲日本最大视频资源| 超色免费av| 久热爱精品视频在线9| a级毛片在线看网站| www日本在线高清视频| 欧美激情高清一区二区三区| 9191精品国产免费久久| 国产精品.久久久| 国产成人av激情在线播放| 少妇被粗大的猛进出69影院| 婷婷丁香在线五月| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲av男天堂| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 精品久久久久久电影网| 久久久久久免费高清国产稀缺| 中文欧美无线码| 性色av一级| 只有这里有精品99| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 深夜精品福利| 日韩av免费高清视频| 青春草视频在线免费观看| 国产97色在线日韩免费| 国产在线观看jvid| 日韩大片免费观看网站| 乱人伦中国视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲中文字幕日韩| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久人人爽人人片av| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 无限看片的www在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 国产一区二区 视频在线| 久久亚洲国产成人精品v| av一本久久久久| 99re6热这里在线精品视频| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产免费现黄频在线看| 老司机深夜福利视频在线观看 | 欧美日韩综合久久久久久| 中文字幕精品免费在线观看视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 午夜视频精品福利| 国产成人91sexporn| 免费少妇av软件| 久久久久精品国产欧美久久久 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美xxⅹ黑人| 下体分泌物呈黄色| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美大码av| 考比视频在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事|