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    犬細(xì)小病毒病DNA疫苗的研究進(jìn)展

    2015-08-20 02:59:06吳植曹斌王安平王永娟吳鵬朱建華
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年7期
    關(guān)鍵詞:細(xì)小抗原質(zhì)粒

    吳植 曹斌 王安平 王永娟 吳鵬 朱建華

    摘要:犬細(xì)小病毒病是犬的一種具有高度接觸性的烈性傳染病。近年來,在犬細(xì)小病毒新型疫苗研究方面取得了新的進(jìn)展,特別是DNA疫苗,筆者就犬細(xì)小病毒DNA疫苗的作用機(jī)理、抗原基因、載體選擇、分子佐劑的研究進(jìn)展方面進(jìn)行系列論述。

    關(guān)鍵詞:犬;細(xì)小病毒;DNA疫苗

    中圖分類號: S858.292.265+.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2015)07-0231-03

    犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的一種急性傳染病,該病毒屬細(xì)小病毒科,細(xì)小病毒屬[1]。病毒經(jīng)消化道感染健康犬后,主要攻擊2種細(xì)胞,一是腸上皮細(xì)胞,二是心肌細(xì)胞,分別表現(xiàn)出血性腸炎型和非化膿性心肌炎型,心肌炎以幼犬多見[2-3]。CPV自1978年被首次分離以來[4],已在世界范圍內(nèi)迅速傳播。目前,該病主要通過弱毒苗預(yù)防,但免疫效果不理想[5-6],因此,新型基因工程疫苗逐漸成為研究的熱點(diǎn),特別是DNA疫苗倍受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。

    1 作用機(jī)理

    DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗,是20世紀(jì)90年代Wolff等首創(chuàng)的新型疫苗[7],把主要抗原基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上,然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注入動(dòng)物體內(nèi),使外源基因通過宿主細(xì)胞合成抗原蛋白,進(jìn)而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答[8-9]。

    DNA疫苗接種機(jī)體后,質(zhì)粒被周圍的組織細(xì)胞(如肌細(xì)胞)抗原遞呈細(xì)胞(APC)或其他炎性細(xì)胞攝取,被吸收的質(zhì)粒在機(jī)體啟動(dòng)子作用下合成mRNA,并被細(xì)胞質(zhì)中的酶復(fù)合物-蛋白酶體所降解,形成氨基酸肽段,然后經(jīng)抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔進(jìn)一步修飾成氨基酸短肽[10]。這些短肽片段在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔與新合成的MHC-Ⅰ分子的抗原結(jié)合槽相結(jié)合,形成抗原肽-MHC-分子復(fù)合物,并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面作為免疫原信號肽供 CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)所識別,導(dǎo)致其活化、增值并分化為具有殺傷能力的效應(yīng) CTL,誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)[11]。

    另一部分蛋白抗原從分泌它們的APC的細(xì)胞膜上進(jìn)入MHC-Ⅱ類型途徑,DNA疫苗基因表達(dá)的抗原蛋白未經(jīng)加工被釋放出去由專職的APC攝取后,在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過吞噬體和溶酶體作用后被降解成具有抗原特異性的多肽,這些多肽同細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生的 MHC-Ⅱ分子相結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上,被CD4+輔助性T細(xì)胞(Th)的受體識別。Th細(xì)胞分泌淋巴因子,刺激B 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞,產(chǎn)生抗體,誘導(dǎo)了抗原特異型的體液免疫應(yīng)答[12]。

    DNA疫苗具有許多優(yōu)點(diǎn):可同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫、可將含有不同抗原基因的質(zhì)粒混合起來聯(lián)合免疫、可在同一載體上插入多種基因、可持續(xù)表達(dá)外源蛋白、易于構(gòu)建和制備、穩(wěn)定性好。近年來,在犬細(xì)小病毒病新型疫苗的研發(fā)中也顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢。

    2 抗原基因

    CPV基因組主要編碼VP1和VP2 2種結(jié)構(gòu)蛋白。VP2基因全長1 755 nt,編碼的584 氨基酸殘基組成的蛋白是構(gòu)成衣殼的主要蛋白,約有60 個(gè)拷貝,VP2上的幾個(gè)關(guān)鍵堿基和氨基酸的變化就會改變抗原特性和宿主范圍[13],表位圖譜試驗(yàn)表明,結(jié)合中和抗體的全部抗原決定基因都在VP2中[14]。VP1基因全長2 256 bp,包含VP2基因的完整閱讀框架,2者的3′端完全重疊。VP1、VP2的序列基本相同,只是VP1的氨基端比VP2多一段氨基序列,這段序列中含有T細(xì)胞識別表位,能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫,而細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)是基因免疫誘導(dǎo)機(jī)體抵抗病原攻擊的一個(gè)重要機(jī)制。因此VP1、VP2都可以作為DNA疫苗的主要抗原基因。

    Parrish等用含CPV VP1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒免疫犬,攻毒保護(hù)試驗(yàn)證明基因疫苗能夠保護(hù)犬不被CPV感染[15]。Jiang W等構(gòu)建了表達(dá)CPV VP1蛋白的真核表達(dá)載體pGT36VP1[16],將5只9月齡的犬分別接種不同劑量的pGT36VP1,結(jié)果顯示免疫1周后,血清中可檢測到抗體IgG,2周左右達(dá)到峰值,約14周后抗體消失,所有免疫pGT36VP1疫苗的犬均能抵抗 CPV強(qiáng)毒的攻擊,而生理鹽水的對照組全部發(fā)病,證實(shí)了接種CPV VP1核酸疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗CPV的特異性免疫反應(yīng)。邱薇等構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES VP1重組質(zhì)粒也能抵抗 CPV強(qiáng)毒的攻擊[17]。

    Gupta等含CPV VP2 DNA質(zhì)粒表達(dá)載體免疫家犬獲得了較好的免疫反應(yīng)[18]。韓冬梅等利用DNAstar軟件對CPV VP2基因以及編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析,確定了VP2蛋白抗原表位基因(VP2蛋白第490~559位氨基酸)[19],即 VP2-70 構(gòu)建了融合的真核表達(dá)載體pcDNACD5sp-LTB-VP2-70,也能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體IgG2a和IgG1,引起淋巴細(xì)胞增殖。

    3 載體選擇

    構(gòu)建基因疫苗之前,載體的選擇十分重要。在CPV DNA疫苗中,常用的載體主要有invitrogen公司的pcDNA系列、pVAX1和Clontech公司的pIRES載體。pcDNA系列載體是常用的真核表達(dá)載體,其啟動(dòng)子和增強(qiáng)子都源于巨細(xì)胞病毒(CMV),含有牛生長激素(BGH)轉(zhuǎn)錄終止序列,不同程度提高了目的基因的表達(dá),但要注意的是插入的片段序列必須自帶ATG起始密碼子和TAG(或TGA、TAA)終止密碼子。pVAX1是在載體pcDNA3.1的基礎(chǔ)上改建而成的一種新型真核表達(dá)載體,是由美國食品和藥品管理委員會(FDA)推薦的唯一可以應(yīng)用于人體試驗(yàn)的核酸疫苗載體。謝之景等利用pVAX1載體構(gòu)建了CPV DNA疫苗的真核表達(dá)質(zhì)粒pVCPV能夠有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗CPV的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫[20]。pIRES載體由于IRES元件的存在,可以同時(shí)表達(dá)2個(gè)基因。Patial等將狂犬病病毒的糖蛋白基因與犬細(xì)小病毒VP2基因連接到pIRES載體,構(gòu)建了能同時(shí)表達(dá)2種抗原蛋白的雙順反子DNA疫苗,同時(shí)分別構(gòu)建了2種抗原的單順反子 pIRES疫苗[21]。將雙順反子DNA疫苗免疫小鼠,并與單順反子疫苗的免疫效果進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),2種DNA疫苗分別對狂犬病病毒和細(xì)小病毒的抗體中和反應(yīng)效果相同,并能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù),證明該雙順反子DNA疫苗作犬用疫苗能夠有效誘導(dǎo)對狂犬病病毒和犬細(xì)小病毒的病毒中和反應(yīng)。

    4 分子佐劑

    犬細(xì)小病毒病DNA疫苗與其他DNA病毒疫苗一樣,存在著免疫原性較弱,免疫動(dòng)物后常常不能產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)性免疫反應(yīng)。為了提高DNA疫苗的免疫效果,研究者們選用了不少分子佐劑來增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性,如CpG、熱應(yīng)激蛋白(HSP)、白細(xì)胞介素類(IL)、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)、集落刺激因子(GM-CSF)等[22-25]。

    王璐等將pcDNA-VP2和pcDNA-cIL-2共免疫小鼠,35 d后血清中VP2的抗體水平(1 ∶5 120)極顯著高于單免疫組;淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明,單免疫組和共免疫組刺激指數(shù)均極顯著高于陰性對照組,共免疫組刺激指數(shù)又顯著高于單免疫組;共免疫組γ-干擾素的表達(dá)水平極顯著高于陰性對照組和單免疫組,cIL-2可顯著提高CPV VP2 DNA疫苗的應(yīng)答水平[26]。孫巖等將pcDNA-CD5-VP2和pcDNA-cIL-7共免疫小鼠,結(jié)果表明,小鼠血清的抗體滴度和中和抗體效價(jià)分別極顯著和顯著高于單免疫組,對IgG2a和IgG1抗體的產(chǎn)生有明顯的促進(jìn)作用;淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)和γ-干擾素表達(dá)水平也顯著高于單免疫組,cIL-7可增強(qiáng)小鼠對VP2 DNA疫苗的免疫應(yīng)答[27]。陳慧慧等研究表明,cIL-7和cIL-2對VP2 DNA疫苗免疫原性的增強(qiáng)作用具有協(xié)同效應(yīng)[28]。潘素敏等研究表明,IL-12可顯著提高VP2 DNA疫苗的免疫應(yīng)答水平[29]。

    韓冬梅等研究證明,無論通過LTB基因表達(dá)載體與VP2抗原表達(dá)載體共免疫小鼠或利用LTB與抗原融合基因表達(dá)載體免疫小鼠,LTB基因均可明顯提高小鼠對VP2基因疫苗的體液免疫應(yīng)答水平,但以LTB與VP2融合基因免疫效果明顯[19]。賈啟恒等研究證明,犬GM-CSF可明顯提高小鼠對VP2 DNA疫苗的體液免疫和細(xì)胞免疫的應(yīng)答水平[30]。

    5 展望

    DNA疫苗是新興的一種疫苗,以其獨(dú)特地誘發(fā)機(jī)體高水平細(xì)胞免疫反應(yīng)而倍受研究者關(guān)注,但是DNA疫苗在安全性的方面尚有爭議,如遺傳毒性作用即質(zhì)粒DNA與宿主基因組整合的問題、表達(dá)抗原的載體自身可能有其他生物活性、致腫瘤性、自身免疫疾病等[31]。近年來,研究出的自殺性DNA疫苗,主要以甲病毒(主要是SFV和SINV)復(fù)制子為載體在基因免疫中得到廣泛應(yīng)用[32-33]。實(shí)踐證明,這種以復(fù)制子為基礎(chǔ)的DNA疫苗優(yōu)于常規(guī)DNA疫苗[34]。自殺性DNA疫苗的裂解性表達(dá)消除了DNA疫苗的動(dòng)物機(jī)體內(nèi)長期存在所帶來的各種隱患[35]。目前,犬細(xì)小病毒DNA疫苗的研究雖然道路曲折,但經(jīng)過大量的實(shí)踐研究,仍然認(rèn)為是可行的,DNA疫苗是新的發(fā)展方向,隨著科學(xué)研究的不斷深入,DNA疫苗在犬細(xì)小病毒病的免疫預(yù)防中一定會發(fā)揮更重要的作用。

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