南方紅豆杉假種皮變異品系的鑒定及生理生化特性

徐敏　王忠　秦亞龍　何樹蘭　朱波風(fēng)　 陸波　仲秀林　彭峰

摘要：以假種皮自然變異為黃色的南方紅豆杉及其原種為對象，結(jié)合ITS序列分析變異品系與近緣類群的親緣關(guān)系，并對變異品系和原種的部分生理生化指標(biāo)進(jìn)行比較。ITS序列比對結(jié)果顯示，變異品系和原種的遺傳距離最近，且在遺傳進(jìn)化樹上聚為一類，表明黃色假種皮的南方紅豆杉由紅色假種皮的南方紅豆杉自然變異而來。除可溶性糖含量外，變異品系葉片中紫杉醇和丙二醛的含量，SOD、CAT、POD、PAL等酶的活性均顯著或極顯著高于原種，其中變異品系中紫杉醇的含量是原種的1.7倍。研究結(jié)果可為紅豆杉屬植物品種的鑒定以及紅豆杉新品種的選育提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：南方紅豆杉；原種；變異品系；生理生化特性

中圖分類號：S791.490.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0193-04

南方紅豆杉別稱美麗紅豆杉，是亞熱帶常綠闊葉林、常綠與落葉闊葉混交林的特征種，為我國特有的樹種且是分布面積最廣的紅豆杉[1-2]。南方紅豆杉木材結(jié)構(gòu)細(xì)膩且堅(jiān)實(shí)耐腐[3]；種子出油率高且含大量蛋白質(zhì)、脂肪、總糖等，可作工業(yè)用途[4]；其枝、葉、根均可提取紫杉醇等生物原料，對卵巢癌、肺癌等癌癥有較好的療效[5]；此外，南方紅豆杉外觀造型獨(dú)特，是四季常青的鮮艷綠色，種子成熟時鮮紅飽滿，鮮紅色的假種皮與綠葉相映成趣，美觀異常，是不可多得的高檔綠化樹種和盆栽植物材料[6]?？梢哉f南方紅豆杉是集藥用、材用、觀賞于一身的重要資源植物和珍稀樹種，具有極高的開發(fā)利用價值。

紅豆杉屬植物有9個種[7]，雖然其原種數(shù)量有限，但由于栽培歷史悠久，目前世界范圍內(nèi)已選育200余個品種。其中，歐洲紅豆杉的栽培品種最多，有近100種，另外雜種紅豆杉的栽培品種也比較多，有50余種，剩余9種紅豆杉的栽培品種之和有50余種，很多紅豆杉種沒有選育出栽培品種[8]。與世界各國相比，我國紅豆杉屬植物的新品種選育進(jìn)程緩慢，可以說在紅豆杉屬植物的品種選育研究方面我國尚屬空白。筆者所在的課題組在江蘇無錫近2 000 hm2的南方紅豆杉群體中發(fā)現(xiàn)一自然變異品系，該品系成熟后的假種皮為金黃色，經(jīng)過多年觀察發(fā)現(xiàn)該性狀表現(xiàn)穩(wěn)定。因此，筆者對其進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，以期為南方紅豆杉的新品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

紅色及黃色假種皮的南方紅豆杉試材取自江蘇省無錫市紅豆杉生物科技股份有限公司紅豆杉種質(zhì)資源圃，所取試材的變異品系與原種南方紅豆杉有相同的生境和株齡；其他紅豆杉樹種（包括曼地亞紅豆杉、須彌紅豆杉、密葉紅豆杉、歐洲紅豆杉、東北紅豆杉）的試材均取自南京中山植物園紅豆杉種質(zhì)資源圃。

1.2 ITS序列的分離與分析

總DNA提取采用植物基因組快速提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司），1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 ITS序列的分離與測定 PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積 20 μL，反應(yīng)體系為：10 ng DNA模板、50 ng正反向引物、2.5 mmol/L dNTPs、10×PCR buffer、0.25 U/μL Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃保溫。引物為上海生物工程技術(shù)有限公司合成的ITS通用引物，ITS-5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Biotek多功能 DNA純化回收試劑盒純化后送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.2.2 ITS序列比對 測序結(jié)果通過軟件MEGA 5.05分子進(jìn)化遺傳分析軟件中的CLUSTALW 對序列進(jìn)行排列并人工校正，采用鄰接法構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹，其中各個分支的置信度用自展檢驗(yàn)法檢驗(yàn)，共進(jìn)行2 000次循環(huán)，評價各分支系統(tǒng)學(xué)意義與可靠性。以紅豆杉科穗花杉為外類群（GenBank 序列號為AF259285.1）進(jìn)行分析。

1.3 生理指標(biāo)的測定

參考王學(xué)奎的方法[9]進(jìn)行SOD、POD、CAT活性和MDA含量的測定，參照李乃偉等的方法[10]進(jìn)行可溶性糖和紫杉醇含量的檢測，參照Yuan等的方法[11]測定PAL活性。以上各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測定均進(jìn)行3次重復(fù)，取平均值，數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 5.0軟件分析作圖完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于ITS序列分析變異品系與近緣類群的親緣關(guān)系

取樣品的新鮮枝葉提取總DNA，用ITS的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1）。由電泳結(jié)果可以看出，所得到的ITS區(qū)長度在1 200 bp左右（包括全部的ITS1、ITS2、5.8S rDNA和部分18S rDNA、28S rDNA）。根據(jù)GenBank中已報道的須彌紅豆杉rDNA的ITS序列（GenBank中編號為EF660577.1）確定各個紅豆杉ITS序列（ITS1、5.8S、ITS2）的邊界。ITS1區(qū)長727～730 bp、5.8S區(qū)長162 bp、ITS2區(qū)長224～225 bp。其中，ITS1含有21個可變位點(diǎn)，5.8S區(qū)高度保守，ITS2區(qū)含有

15個可變位點(diǎn)。綜合考慮到ITS1區(qū)的信息量較大，因此最終用ITS1區(qū)構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹，并計算各個種之間的遺傳距離。

從表1可以看出，紅豆杉科紅豆杉屬內(nèi)的遺傳距離較小，與外類群穗花杉的遺傳距離較大。其中，黃色假種皮南方紅豆杉與南方紅豆杉原種的遺傳距離為0，與中國紅豆杉遺傳距離為0.010，與須彌紅豆杉遺傳距離較遠(yuǎn)，其次是曼地亞紅豆杉。從圖2的NJ聚類圖中可以看出，黃色假種皮與紅色假種皮南方紅豆杉分支的置信度高達(dá)98%。以上分析結(jié)果均表明，黃色假種皮南方紅豆杉系由南方紅豆杉原種自然變異而成。

2.2 生理分析

2.2.1 紫杉醇及可溶性糖含量的比較 紫杉醇是Wani等首次從短葉紅豆杉樹皮中分離得到的一種重要的次生代謝產(chǎn)物[12]。臨床可用于治療卵巢癌、肺癌、膀胱癌、子宮癌及AIDS相關(guān)的Karposis肉瘤等，是目前應(yīng)用最廣泛的天然抗癌藥物之一[5]。筆者用HPLC方法測定了新鮮葉片中紫杉醇的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉變異品系的紫杉醇含量是南方紅豆杉原種中紫杉醇含量的1.7倍（圖3）。

可溶性糖在植物體內(nèi)屬于初級代謝產(chǎn)物，對細(xì)胞膜和原生質(zhì)膠體有穩(wěn)定作用，也是合成某些有機(jī)溶質(zhì)的碳架和能量來源，還可在細(xì)胞內(nèi)無機(jī)離子濃度高時起保護(hù)酶類的作用[13]。植物進(jìn)行光合作用合成可溶性糖等有機(jī)物質(zhì)，首先在植物葉片中積累，為自身營養(yǎng)物質(zhì)的形成做準(zhǔn)備。在本研究中，南方紅豆杉原種中可溶性糖的含量是變異品系的1.6倍，達(dá)到了極顯著的差異水平。

2.2.2 酶活性及MDA含量的分析 過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶一起構(gòu)成了生物體內(nèi)重要的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)，從而維護(hù)生物體內(nèi)正常的生理代謝和生化反應(yīng)[14]。苯丙氨酸解氨酶是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶，與植物體內(nèi)的木質(zhì)素、異黃酮類植保素和黃酮類色素等多種次生物質(zhì)的生物合成有密切關(guān)系[15]。而MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，它的含量可以反映脂膜過氧化作用水平和膜的受損情況[16]。在本研究中，南方紅豆杉原種的POD、CAT、SOD、PAL的活性和MDA的含量均明顯低于變異品系，其中PAL和POD的活性以及MDA的含量達(dá)到極顯著的差異水平。

3 結(jié)論與討論

紅豆杉屬植物成熟的種皮顏色一般為紅色，迄今為止，在紅豆杉屬下的11個種中僅在歐洲紅豆杉中發(fā)現(xiàn)了黃色假種皮的變異品種Taxus baccata var. lutea。筆者所在的課題組在近 2 000 hm2的南方紅豆杉種群中經(jīng)過多年的觀測，發(fā)現(xiàn)了6株黃色假種皮變異品系且其性狀穩(wěn)定。目前關(guān)于假種皮的研究多集中于姜、象牙參及擬豆蔻等作物上，且主要集中在解剖

學(xué)和組織化學(xué)層面，紅豆杉假種皮色素的研究尚未見有系統(tǒng)報道。在種皮的色素研究中，Theander等認(rèn)為影響種皮色澤的主要原因是可溶性花色素的積累，而凝聚多酚是引起黃籽、黑籽種皮差異的主要原因[17]；還有研究認(rèn)為，黃籽、黑籽種皮顏色的差異主要與多酚、類黃酮和花色素有關(guān)，而黑色素對成熟種子的種皮顏色有決定作用[18-20]；此外，梁銀等認(rèn)為，PAL、PPO、SOD是種皮呈現(xiàn)不同顏色的關(guān)鍵因素[21-22]。這些機(jī)理初步解釋了種皮色素差異的原因，但是否與紅豆杉假種皮色素的形成有關(guān)還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

ITS是核糖體rDNA中介于18S與5.8S之間的ITS1、5.8S 與28S之間的ITS2的非編碼轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，由于其片段長度適中、進(jìn)化速率快且在基因組不同重復(fù)單元間高度一致的特點(diǎn)，已被廣泛用作研究系統(tǒng)發(fā)育、進(jìn)化及分類鑒定的分子指標(biāo)來分析較低分類單元層次上的植物系統(tǒng)發(fā)育問題[23-24]。本研究以紅豆杉屬植物的7個種為材料，擴(kuò)增得到了其相應(yīng)的ITS序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，ITS的序列信息能很好地分辨出不同的紅豆杉樹種。遺傳進(jìn)化樹顯示，黃色假種皮與紅色假種皮南方紅豆杉分支的置信度最高，表明兩者親緣最近，從分子水平上進(jìn)一步證明其屬于同一個種，即黃色假種皮南方紅豆杉由南方紅豆杉原種自然突變而來。另外，須彌紅豆杉原變種與南方紅豆杉和紅豆杉并沒有聚為一類，這與經(jīng)典分類的結(jié)果不一致，須結(jié)合其他方法進(jìn)一步研究。

紫杉醇作為紅豆杉最重要的次生代謝產(chǎn)物，其研究在生物合成、代謝調(diào)控等方面取得了很多成果。研究已證實(shí)，在不同種的紅豆杉植株中紫杉醇含量存在差異。王玉震認(rèn)為，密葉紅豆杉枝葉的紫杉醇含量最高，其次為紅豆杉和東北紅豆杉，南方紅豆杉枝葉的紫杉醇含量最低[25]。但研究的結(jié)果也存在很多不同，主要是因?yàn)闃潺g、地理位置、環(huán)境條件以及測定方式的不同會直接影響到紫杉醇含量的差異。本研究結(jié)果顯示，黃色假種皮南方紅豆杉枝葉中的紫杉醇含量是南方紅豆杉原種中的1.7倍，這與前人研究曼地亞紅豆杉不同品種的紫杉醇含量有差異是一致的，但紫杉醇在植株體內(nèi)代謝的復(fù)雜性使得目前尚未能清楚解釋原因?？扇苄蕴窃谥参镏兄饕哉崽?、葡萄糖、果糖和半乳糖等形式存在，是植物進(jìn)行光合作用后的初級代謝產(chǎn)物。鮑思偉等研究發(fā)現(xiàn)，較高強(qiáng)度的光照有利于曼地亞紅豆杉葉片可溶性糖的積累，并增加植株體內(nèi)紫杉醇的含量[26]。但在本研究中，可溶性糖含量卻與紫杉醇含量剛好相反，這與李乃偉等“紫杉醇含量與可溶性糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)”的結(jié)果[27]一致。

植物體內(nèi)各種酶的活性在生長發(fā)育過程中是不斷發(fā)生變化的，酶活性的強(qiáng)弱直接反映了代謝能力及植株抗逆性能力的大小[28]。在油橄欖、梨樹、小麥等植物上已經(jīng)證實(shí)，不同的種和品種之間的酶活性存在差異，最終造成產(chǎn)量及抗性不同[16，29-30]。關(guān)于紅豆杉方面的研究主要是集中在不同光照強(qiáng)度、水肥條件及UV-B輻射處理后的酶活性變化上[13，26-27，31]，有關(guān)紅豆杉種和品種的酶活性比較尚未見報道。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假種皮自然變異為黃色的南方紅豆杉葉片的酶（包括POD、CAT、SOD、PAL）活性以及MDA含量均顯著或極顯著高于紅色假果皮南方紅豆杉，說明黃色假種皮南方紅豆杉的代謝速度快于紅色假種皮南方紅豆杉，并使得紫杉醇的含量也呈現(xiàn)較高水平。鮑思偉等研究發(fā)現(xiàn)，遮陰（70%透光率）條件下的紅豆杉幼苗葉片中的SOD、POD、CAT活性均較自然光高，紫杉醇的含量也高[26，32]；Hector等則認(rèn)為，PPO和POD的活性直接影響紫杉醇的代謝[33-34]；余龍江等發(fā)現(xiàn)，紫杉醇產(chǎn)量隨著PAL活性上升而相應(yīng)提高，PAL活性迅速升高可作為與紫杉醇是否被誘導(dǎo)大量合成的生理指標(biāo)[35]。本試驗(yàn)的結(jié)果與上述研究結(jié)果較一致，即酶的活性高，紫杉醇的含量也呈現(xiàn)較高的水平。但也有不同的研究結(jié)果顯示，紫杉醇含量與MDA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)[27]。UV-B 輻射處理后，紫杉醇含量顯著增加，SOD、POD活性不變，而CAT活性顯著減弱[31]。筆者推測，這是因?yàn)橛绊懼参矬w內(nèi)酶活性的因素較多，如酶易失活，提取檢測的方式方法的差異，外界環(huán)境因素如pH值條件、溫度等對酶的活性也有較大的影響。此外，這些結(jié)果也再次表明紫杉醇在植株體內(nèi)代謝步驟繁多且機(jī)理復(fù)雜。在后續(xù)的研究中，將集中在色素代謝途徑是否對紫杉醇代謝途徑有影響，這有助于從一個新的角度理解紫杉醇代謝的分子機(jī)理。

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