水熱預(yù)處理工藝參數(shù)對玉米秸稈組分與酶解效率的影響

李梓木，于艷玲,，孫嘉星，李冬梅，馮玉杰

（1 哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150090；2 哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

引 言

利用玉米秸稈等木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)燃料乙醇具有減輕化石能源環(huán)境污染、保證能源安全、避免與人爭糧等優(yōu)點[1-2]。由于木質(zhì)纖維素材料中纖維素被木質(zhì)素和半纖維素包裹纏繞且具有很高的結(jié)晶度[3]，纖維素直接酶解效率很低，通常不會超過20%[4]。因此，必須通過預(yù)處理解除半纖維素和木質(zhì)素對纖維素的封閉，甚至瓦解纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，增加纖維素酶與纖維素的接觸面積，才能提高纖維素的酶解效率。

目前所應(yīng)用的預(yù)處理方法中，稀酸預(yù)處理是木質(zhì)纖維素預(yù)處理研究得最深入的方法，目前仍被很多人認(rèn)為是最接近實用化的預(yù)處理技術(shù)，但是該方法對后續(xù)的酶解和發(fā)酵設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，成為規(guī)?；瘧?yīng)用的瓶頸之一[5-7]；蒸汽爆破方法對設(shè)備腐蝕小，但對設(shè)備要求高，處理效果不穩(wěn)定[8]。水熱預(yù)處理（liquid hot water pretreatment）是利用高溫條件下（120～260℃）通過壓力將水保持在液態(tài)，但水的離子積增加、水呈現(xiàn)酸性的原理進(jìn)行預(yù)處理的一種方法。在預(yù)處理過程中，半纖維素中的乙?；粩啾凰鉃橐宜?，乙酸作為催化劑與溶劑水共同催化半纖維素水解[9]。由于水在常溫條件下是中性的，因此水熱預(yù)處理同時兼具稀酸預(yù)處理和蒸汽爆破預(yù)處理的優(yōu)點，是一種很有前景的木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法[10]。

水熱預(yù)處理反應(yīng)裝置主要有間歇式和流動式兩種[11-12]。流動式水熱預(yù)處理能夠?qū)崟r將半纖維素、木質(zhì)素分解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到反應(yīng)裝置之外，解除了產(chǎn)物抑制作用，以及在一定程度上避免木質(zhì)素分解產(chǎn)物對反應(yīng)的阻礙作用，但流動式水熱預(yù)處理對裝置要求較高，放大較困難，必須配備能夠提供較高壓力的輸液泵，制作成本較高。間歇式水熱預(yù)處理方法不能將半纖維素和木質(zhì)素的分解產(chǎn)物實時轉(zhuǎn)移至裝置之外，但設(shè)備成本較低，易于放大。間歇式水熱預(yù)處理目前已應(yīng)用于甘蔗渣[13]、柳枝稷[14]、大豆秸稈[15]、油菜秸稈[16]等原料。Yu 等[17]采用兩步法的間歇式水熱預(yù)處理桉木后進(jìn)行酶解，第一階段水熱預(yù)處理在180℃下進(jìn)行20 min，木糖得率為86.4%，第二階段200℃進(jìn)行20 min，預(yù)處理后的纖維素酶解96.63%。Mosier 等[18]為減少木糖在酸性條件下分解采用控制pH 的間歇式水熱預(yù)處理方式控制單糖降解。Kim 等[19]通過200℃，15 min 的間歇式水熱預(yù)處理楊木，添加40 FPU·(g 纖維素)-1的纖維素酶使酶解率從未處理的3%提高到67%。Negro等[20]也以楊木為原料，設(shè)定230℃為反應(yīng)溫度，溫度升高到反應(yīng)溫度即將反應(yīng)器冷卻至室溫以結(jié)束預(yù)處理，經(jīng)酶解反應(yīng)[纖維素酶添加量為15 FPU·(g底物)-1]獲得酶解率70%。

玉米秸稈是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中剩余的一種重要生物質(zhì)資源，年產(chǎn)量約為2.1 億噸，且具有不斷增長的趨勢[21-24]。不同產(chǎn)地玉米秸稈由于纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及抽提物含量具有差異，其水熱預(yù)處理的工藝條件也有所不同。多元線性回歸分析是建立在大量觀測值基礎(chǔ)上進(jìn)行建模的較為有效和簡潔的統(tǒng)計學(xué)方法，目前尚無應(yīng)用于水熱預(yù)處理的因素顯著性檢驗和模型構(gòu)建的文獻(xiàn)報道。通過多元線性回歸分析不但能夠通過統(tǒng)計運算確定處理溫度和處理時間對半纖維素移除率等預(yù)處理結(jié)果影響的顯著性，還可以通過擬合模型對整個工藝條件范圍內(nèi)，實驗設(shè)計未覆蓋到的工藝條件結(jié)果進(jìn)行預(yù)測。本文應(yīng)用間歇式水熱預(yù)處理產(chǎn)地為黑龍江的高抽提物含量玉米秸稈，對比預(yù)處理前后玉米秸稈主要成分（半纖維素，木質(zhì)素，纖維素）的質(zhì)量變化，并采用多元線性回歸分析處理溫度和處理時間對預(yù)處理效果的影響（方程擬合度不佳時改為二次方程擬合）。同時考察預(yù)處理之后纖維素酶解情況，探討預(yù)處理對纖維素酶解率的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

玉米秸稈（取自黑龍江省綏化市）經(jīng)粉碎后全部過孔徑2 mm 篩，選取粒度為420～250 μm 的顆粒儲存于聚乙烯容器-20℃保存。玉米秸稈成分見表1。成分測定均采用美國可再生能源實驗室標(biāo)準(zhǔn)分析方法（National Renewable Energy Laboratory LAP standard analytical procedure）進(jìn)行。所有測定實驗均進(jìn)行兩次，表中數(shù)據(jù)為測定結(jié)果平均值。

表1 玉米秸稈組成成分Table 1 Composition of corn stover (dry mass basis)

1.2 處理溫度和處理時間對水熱預(yù)處理效果的影響

水熱預(yù)處理是在不銹鋼水熱合成反應(yīng)釜(型號：316 L；內(nèi)徑2.54 cm×不銹鋼厚0.165 cm，長度11.43 cm) 中進(jìn)行。反應(yīng)釜通過油?。℉H-S 油浴鍋）加熱。反應(yīng)釜內(nèi)添加3 g 秸稈（粒徑：420～250 μm，含水率4.4%）再加入27 ml 去離子水。反應(yīng)釜溫度達(dá)到目標(biāo)溫度時開始計時。通過將反應(yīng)釜浸入室溫水中快速冷卻終止預(yù)處理。處理溫度范圍設(shè)定為180～220℃，處理時間范圍設(shè)定為10～25 min。預(yù)處理后的固液混合物通過抽濾分離，殘留固體以200 ml 熱去離子水(80～90℃)洗滌，35℃烘干24 h，保存于-20℃用于成分測定及酶解。

1.3 X 射線衍射分析

實驗儀器（德國Brucker D8-Advance 型X 射線衍射儀）采用Cu 靶，石墨單色器，加速電壓40 kV，電流40 mA，掃描步長0.02°，掃描速度0.075(°)·s-1，衍射角2θ的旋轉(zhuǎn)范圍為10°～30°。木質(zhì)纖維素物料的相對結(jié)晶度CrI(%)通過下式計算[25]

式中，I002為校正后結(jié)晶區(qū)強度（2θ=22.5°）；Iam為校正后無定形區(qū)強度（2θ=18.7°）。

1.4 纖維素酶解實驗及酶解率測定

纖維素酶(Celluclast 1.5 L)和β-葡萄糖苷酶(Novozyme 188)購自Sigma 公司（中國，上海）。酶解實驗在含有40 μg·ml-1四環(huán)素和30 μg·ml-1放線菌酮的0.05 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.8)中進(jìn)行。50 ml 酶解反應(yīng)緩沖液，0.01 g 纖維素·(ml緩沖液)-1的酶解底物及纖維素酶和β-葡萄糖苷酶[兩酶用量均為15 U·(g 纖維素)-1]置于125 ml 錐形瓶，50℃，150 r·min-1，酶解72 h。酶解結(jié)束后取1 ml 酶解樣品10000 r·min-1離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后放入-4℃冰箱保存待測。酶解率以原料秸稈中的纖維素質(zhì)量為基準(zhǔn)進(jìn)行計算（不考慮固體得率），計算公式如下

預(yù)處理后固體葡萄糖得率考慮預(yù)處理后固體得率，以預(yù)處理后固體質(zhì)量為基準(zhǔn)進(jìn)行計算，即每100 g 預(yù)處理后固體經(jīng)酶解可獲得葡萄糖的質(zhì)量，計算公式如下

1.5 分析方法

實驗中單糖及纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量的測定依照美國可再生能源實驗室標(biāo)準(zhǔn)分析方法進(jìn)行，應(yīng)用具備示差檢測器的高效液相色譜（Shimadzu LC-10A）進(jìn)行測定。色譜柱為 BioRad Aminex HPX-87P。色譜條件：去離子水為流動相，流速為0.6 ml·min-1，柱溫及檢測器的溫度設(shè)定為80℃。

1.6 統(tǒng)計分析

處理溫度和處理時間以及實驗結(jié)果（半纖維素移除率，木質(zhì)素移除率，纖維素?fù)p失率）應(yīng)用SPSS（21.0.0.0）進(jìn)行多元線性回歸及方差分析或應(yīng)用Design expert (8.0.6)進(jìn)行模型擬合(模型擬合度不佳時)。選取200℃，10～25 min 以及180～220℃，20 min 為變量變化范圍，通過敏感性分析比較處理溫度和處理時間對評價指標(biāo)（半纖維素移除率和纖維素?fù)p失率）的影響。木質(zhì)素移除率受處理溫度和處理時間影響的敏感度大小通過擬合曲面進(jìn)行分析。

2 實驗結(jié)果與討論

表2（數(shù)據(jù)均為平均值）中列出了不同條件水熱預(yù)處理后玉米秸稈的半纖維素移除率（以木糖計）、木質(zhì)素移除率（以酸不溶木質(zhì)素計）和纖維素?fù)p失率。半纖維素移除率（hemicellulose removal，HR）、木質(zhì)素移除率（lignin removal，LR）和纖維素?fù)p失率（cellulose loss，CL）分別以原料秸稈的木聚糖、酸不溶木質(zhì)素及纖維素質(zhì)量為基準(zhǔn)計算（不考慮固體得率），計算公式如下

HR=(原料秸稈中木聚糖質(zhì)量-預(yù)處理后秸稈中木聚糖質(zhì)量)/ 原料秸稈中木聚糖質(zhì)量×100%

LR=(原料秸稈中木質(zhì)素質(zhì)量-預(yù)處理后秸稈中木質(zhì)素質(zhì)量)/ 原料秸稈中木質(zhì)素質(zhì)量×100%

CL=(原料秸稈中纖維素質(zhì)量-預(yù)處理后秸稈中纖維素質(zhì)量)/ 原料秸稈中纖維素質(zhì)量×100%

2.1 水熱預(yù)處理工藝條件對秸稈中半纖維素移除的影響

從表2中可知，玉米秸稈中半纖維素移除率隨預(yù)處理條件的劇烈程度增大而增大，經(jīng)210℃，25 min 水熱預(yù)處理后半纖維素移除率最大為86.0%。多元線性回歸分析獲得模型表達(dá)式為

殘差的正態(tài)p-p圖（圖1）顯示數(shù)據(jù)分布近正態(tài)分布適用于多元線性回歸分析，R2=0.953 說明模型擬合度較好。常數(shù)項和兩個自變量系數(shù)的顯著性均小于0.05，說明處理溫度(T)和處理時間(t)對半纖維素移除率的影響均為顯著。即在水熱預(yù)處理過程中，處理溫度和處理時間均能夠顯著促進(jìn)半纖維素的自水解產(chǎn)生乙酸，催化半纖維素水解并溶解于水中，減少預(yù)處理之后固體中的半纖維素。另外，敏感度分析所選變量范圍內(nèi)，T和t的敏感度系數(shù)分別為βtemperature=0.032 和βtime=0.0061，說明在該范圍內(nèi)與處理時間相比，處理溫度的提高更能促進(jìn)半纖維素的自水解，減少固體中的半纖維素。例如：經(jīng)200℃，20 min 處理后半纖維素的移除率為61.2%；按5%的幅度提高預(yù)處理溫度至210℃后（210℃，20 min），半纖維素移除率提高到76.9%；而按25%的幅度延長預(yù)處理時間至 25 min 時（200℃，25 min），半纖維素移除率僅提高到74.8%。

圖1 半纖維素移除率多元線性回歸分析殘差的正態(tài)p-p 圖Fig.1 Normality p-p plot of residuals of hemicellulose removal multiple linear regression model

2.2 水熱預(yù)處理工藝條件對秸稈中木質(zhì)素移除的影響

在所選實驗條件預(yù)處理后秸稈中的木質(zhì)素質(zhì)量均未降低，且在預(yù)處理溫度較高時木質(zhì)素質(zhì)量反而有所增加（表2）。其原因可能是部分纖維素和半纖維素在酸性條件下經(jīng)過脫水、斷裂、重排、縮聚或聚合產(chǎn)生了酸不溶的物質(zhì)。這些物質(zhì)含有羰基、羧基、苯基及烴鏈等結(jié)構(gòu)，在測定酸不溶木質(zhì)素時常導(dǎo)致酸不溶木質(zhì)素測定含量偏高，因此被稱為假木質(zhì)素[26-29]。應(yīng)用Design expert (8.0.6)軟件采取逐步法進(jìn)行二次方程回歸分析，獲得R2=0.9283，p＜ 0.0001(significant)，Lack of fit=0.1381 (not significant) 的模型

表2 不同條件水熱預(yù)處理后秸稈中半纖維素移除率、木質(zhì)素移除率、纖維素?fù)p失率和固體得率Table 2 Hemicellulose removal,lignin removal,cellulose loss and solid recovery after LHW pretreatment

模型中T和t的p值均小于0.0001，說明處理溫度（T）和處理時間（t）對木質(zhì)素移除率（假木質(zhì)素生成）均具有顯著影響。由圖2可知，在所選實驗范圍內(nèi)，與處理時間相比處理溫度范圍內(nèi)等高線較密集，擬合曲面坡度較大，變化趨勢較劇烈，說明處理溫度對結(jié)果影響更大。即雖然提高處理溫度和提高處理時間均能促進(jìn)假木質(zhì)素的生成，但提高處理溫度促進(jìn)假木質(zhì)素生成的作用更強。另外，從圖2中可以看到處理溫度低于200℃時（180℃和190℃），擬合曲面較為平緩，坡度變化較小且木質(zhì)素增加量較少（表2）；處理溫度高于200℃時，擬合曲面坡度變化較大，等高線較密集且木質(zhì)素增加量較多（表2）。這種現(xiàn)象可能是由于較高的溫度（≥ 200℃）更能促進(jìn)部分纖維素和半纖維素的脫水、斷裂、重排、縮聚或聚合等化學(xué)反應(yīng)生成酸不溶的物質(zhì)（假木質(zhì)素）。

圖2 木質(zhì)素移除率方程的擬合曲面Fig.2 Fitting surface of lignin removal equation

2.3 水熱預(yù)處理工藝條件對秸稈中纖維素?fù)p失的影響

隨著預(yù)處理條件劇烈程度的增大秸稈中纖維素?fù)p失也隨之增大，經(jīng)220℃、20 min 水熱預(yù)處理后纖維素?fù)p失率最大為15.3%（表2）。多元線性回歸分析獲得模型

模型p值為0.000，R2=0.818，殘差的正態(tài)p-p圖（圖3）顯示數(shù)據(jù)分布近正態(tài)分布適用于多元線性回歸分析。處理溫度(T)和處理時間(t)對半纖維素移除的影響均為顯著（顯著性均小于0.05）。敏感度分析所選變量范圍內(nèi)，T和t的敏感度系數(shù)分別為βtemperature=0.17 和βtime=0.016。這說明處理溫度和處理時間均能夠促進(jìn)秸稈中纖維素水解為葡萄糖，但相同幅度提高處理溫度更能促進(jìn)纖維素的水解，造成纖維素的損失。方差分析顯示，處理溫度升高到200℃以上時（含200℃）各溫度間纖維素?fù)p失率差異（200℃以上時p=0.000 ＜ 0.05，180 和190℃時p=0.28 ＞ 0.05）開始顯著。從表2中也可以看出，經(jīng)較低的溫度（180 和190℃）預(yù)處理后纖維素?fù)p失較少，但處理溫度和處理時間增大到一定值后，纖維素逐漸水解。這是由于與無定形的半纖維素相比，纖維素具有高度致密的結(jié)晶結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)自身不被水解。但處理溫度和處理時間增大到一定值（例如200℃、20 min）后，半纖維素自水解產(chǎn)生的乙酸等酸性物質(zhì)不但催化半纖維素水解也能夠催化纖維素的水解。

圖3 纖維素?fù)p失率多元線性回歸分析殘差的正態(tài)p-p 圖Fig.3 Normality p-p plot of residuals of cellulose loss multiple linear regression model

2.4 X 射線衍射分析

玉米秸稈經(jīng)水熱預(yù)處理后物料的X射線衍射圖譜如圖4所示，原料和預(yù)處理后樣品的衍射峰均在22.5°和16.3°為典型的纖維素圖譜。而在18.7°處的峰谷則代表了非結(jié)晶結(jié)構(gòu)的組分。水熱預(yù)處理后玉米秸稈在22.5°處衍射峰強度有明顯提高，且峰形變尖，半峰寬有所減少，說明纖維素的結(jié)晶度有一定程度的提高。從結(jié)晶度上（表3）也可看到這種變化。與氨纖維爆破等[30]預(yù)處理不同，水熱預(yù)處理并不能破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，隨著處理溫度和處理時間的增大結(jié)晶度反而有所增加（表3）。這是因為在水熱預(yù)處理過程中，無定形的半纖維素降解導(dǎo)致原料中纖維素比例增加。

圖4 玉米秸稈原料和水熱預(yù)處理后玉米秸稈的 X 射線衍射圖Fig.4 XRD spectra of untreated and liquid hot water pretreated corn stover

表3 玉米秸稈原料和不同水熱預(yù)處理條件下物料的結(jié)晶度Table 3 Crystallinity index of untreated and liquid hot water pretreated corn stover under different conditions

2.5 水熱預(yù)處理對秸稈纖維素酶解的影響

各條件預(yù)處理后的纖維素酶解率及預(yù)處理后固體葡萄糖得率如圖5所示。未經(jīng)預(yù)處理玉米秸稈的纖維素酶解率僅為9.9%。水熱預(yù)處理顯著提高了玉米秸稈纖維素的酶解率，各條件水熱預(yù)處理后纖維素的酶解率均有不同程度的提高。經(jīng)210℃、20 min 水熱預(yù)處理后玉米秸稈的纖維素酶解率最高為76.2%。預(yù)處理后固體葡萄糖得率趨勢與酶解率相似，同樣經(jīng)210℃、20 min 預(yù)處理后固體葡萄糖得率最高為52.6 g·(100 g)-1。

210℃、20 min 預(yù)處理與酶解的質(zhì)量平衡流程如圖6所示。100 g 玉米秸稈經(jīng)210℃、20 min 預(yù)處理后獲得固體65 g，其中含有37.1 g 纖維素，酶解后獲得葡萄糖34.2 g。100 g 玉米秸稈經(jīng)210℃、25 min 和220℃、20 min 預(yù)處理后固體中分別含有35.4 g 和34.2 g 纖維素，經(jīng)酶解分別獲得32.6 g 和31.0 g葡萄糖。雖然210℃、25 min 和220℃、25 min 預(yù)處理后半纖維素移除率更高（表2），空間阻礙和反饋抑制[31]更小，預(yù)處理后剩余固體中的纖維素水解（以預(yù)處理后固體中纖維素質(zhì)量計）也較多，但由于纖維素?fù)p失率較大（纖維素?fù)p失率分別為12.4%和15.3%），纖維素酶解率（以原料中纖維素質(zhì)量計）和預(yù)處理后剩余固體葡萄糖得率均沒有獲得最高值。

水熱預(yù)處理增大纖維素酶解效率主要是通過水解半纖維素、減少纖維素酶的空間阻礙和半纖維素的反饋抑制來實現(xiàn)。從圖7中可以看出玉米秸稈的酶解率與預(yù)處理后半纖維素的移除率具有一定的線性關(guān)系（R2=0.8468）。半纖維素移除率越高，纖 維素酶解率也隨之升高。經(jīng)水熱預(yù)處理的大豆稈及麥稈也具有相同的趨勢[32-33]。

圖5 各條件水熱預(yù)處理后纖維素酶解率及預(yù)處理后固體葡萄糖得率Fig.5 Cellulose digestibility and glucose yield in pretreated corn stover after liquid hot water pretreatment

圖6 玉米秸稈預(yù)處理與酶解過程質(zhì)量平衡流程（預(yù)處理條件：210℃，20 min）Fig.6 Flow chart of mass balance during pretreatment and cellulose digestibility for corn stover (pretreatment condition:210℃,20 min)

圖7 半纖維素移除率與酶解轉(zhuǎn)化率的相互關(guān)系Fig.7 Correlation between cellulose digestibility and hemicellulose removal

3 結(jié) 論

（1）擬合模型分析顯示：處理溫度和處理時間對半纖維素移除率和纖維素?fù)p失率均具有正向顯著影響，對木質(zhì)素移除率具有負(fù)向顯著影響。

（2）敏感度分析顯示：200℃、10～25 min 以及180～220℃、20 min 為變量變化范圍，處理溫度對半纖維素移除率和纖維素?fù)p失率的影響顯著性均大于處理時間。木質(zhì)素移除率擬合曲面分析顯示：處理溫度對木質(zhì)素移除率的影響顯著性大于處理時間。

（3）在所選實驗條件下，210℃、25 min 獲得最大半纖維素移除率86%，220℃、20 min 預(yù)處理后纖維素?fù)p失最大為15.3%，同時經(jīng)220℃、20 min預(yù)處理后木質(zhì)素測定質(zhì)量增加最大為7.8%。

（4）210℃，20 min 水熱預(yù)處理后纖維素酶解率最高為76.2%，預(yù)處理后固體葡萄糖得率最高為56.2 g·(100 g)-1，提高處理溫度和延長處理時間能夠使半纖維素移除率進(jìn)一步增加，但由于纖維素?fù)p失量增大導(dǎo)致纖維素酶解率和預(yù)處理后固體葡萄糖得率降低。

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