拉曼光譜法檢測(cè)靈芝孢子油氧化酸敗

能 靜，項(xiàng)延楠，孫培龍*

（浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 杭州　　310014）

拉曼光譜法檢測(cè)靈芝孢子油氧化酸敗

能 靜，項(xiàng)延楠，孫培龍*

（浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 杭州310014）

采用拉曼光譜法直接監(jiān)測(cè)靈芝孢子油中氧化酸敗過(guò)程中不飽和雙鍵特征峰的變化規(guī)律，研究了特征峰的強(qiáng)度與孢子油氧化酸敗程度的關(guān)系。結(jié)果表明，特征峰強(qiáng)度隨孢子油酸值、過(guò)氧化值的增加而下降，特征峰的面積與孢子油酸值之間存在著良好的線性關(guān)系，并進(jìn)一步測(cè)定了靈芝孢子油氧化酸敗的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。建立了用拉曼光譜快速檢測(cè)靈芝孢子油氧化酸敗度的新方法。對(duì)該方法的有效性進(jìn)行評(píng)估，并用該方法篩選出有效的靈芝孢子油抗氧化劑。

拉曼光譜法；靈芝孢子油；氧化酸敗；快速檢測(cè)

靈芝又稱靈芝草，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株，自古以來(lái)就被推崇為中藥上品，在《神農(nóng)本草經(jīng)》等中醫(yī)藥典籍就早有記載。經(jīng)數(shù)十年的現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，靈芝對(duì)于增強(qiáng)人體免疫力、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)血糖、控制血壓、輔助化療、保肝護(hù)肝，促進(jìn)睡眠等方面均具有顯著療效［1］。靈芝孢子是靈芝的有性生殖細(xì)胞，一般呈淡褐色至黃褐色，卵形，大小一般在（8.5～11.2） μm×（5.2～6.9） μm（長(zhǎng)×寬）之間，內(nèi)含靈芝孢子油。靈芝孢子油集中了靈芝有效成分的精華，富含三萜類靈芝酸、靈芝多糖、核苷、氨基酸、飽和與不飽和脂肪酸、有機(jī)鍺以及其他微量元素等多種活性成分［2］。眾多研究已經(jīng)表明，靈芝孢子油具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫、增強(qiáng)NK細(xì)胞活性、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等功能，能直接抑殺腫瘤干細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡［3-5］，抗氧化［6］和減輕膀胱堵塞［7］，以及抗艾滋病毒的活性的能力［8-9］。同時(shí)由于其不飽和脂肪酸含量很高，更具有改善心腦血管疾病、抗動(dòng)脈硬化、降血脂、降膽固醇的作用［10］。

由于靈芝孢子油功效顯著，價(jià)格昂貴，所以市場(chǎng)上相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重影響了消費(fèi)者的利益。靈芝孢子油富含不飽和雙鍵，孢子油在儲(chǔ)存、運(yùn)輸過(guò)程中，尤其在高溫、高濕的條件下極易氧化，主要發(fā)生由活性氧自由基攻擊雙鍵引起降解，產(chǎn)生多種醛、酮、醇、酸及羥酸等有害氧化物、過(guò)氧化物，生成強(qiáng)烈的刺激性氣味（氧化酸?。?1］。這些氧化物、過(guò)氧化物被人體攝取后，將破壞機(jī)體正常的生理生化功能（如引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低機(jī)體免疫功能、導(dǎo)致小腸、肝臟等器官肥大等），嚴(yán)重?fù)p害身體健康［12］。

因此，檢測(cè)靈芝孢子油氧化酸敗度是靈芝孢子油質(zhì)量控制的一個(gè)關(guān)鍵。目前，業(yè)內(nèi)通常采用食用油的質(zhì)量監(jiān)控指標(biāo)即過(guò)氧化值、酸值作為孢子油的主要質(zhì)量監(jiān)控指標(biāo)［13］。測(cè)定靈芝孢子油酸值、過(guò)氧化值的傳統(tǒng)方法主要是標(biāo)準(zhǔn)酸堿滴定和氧化還原滴定，但滴定法多少存在以下缺陷：如操作繁雜，需專業(yè)人員在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析；耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)需數(shù)小時(shí)完成；不便攜，難以戶外現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；靈敏度不夠高，消耗樣品量多（5～10 g），檢測(cè)成本高。如根據(jù)中國(guó)藥典一部中對(duì)酸敗法測(cè)定的規(guī)定［14］以及GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》［15］，每次滴定操作需消耗靈芝孢子油0.5 g和1.5 g來(lái)分別測(cè)定其酸值和過(guò)氧化值，3 次重復(fù)滴定至少消耗孢子油6.0 g。因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、樣品消耗量少、檢測(cè)成本低的孢子油酸值和過(guò)氧化值檢測(cè)新技術(shù)對(duì)保障靈芝孢子油的生產(chǎn)質(zhì)量、規(guī)范靈芝孢子油銷售市場(chǎng)、開發(fā)新的靈芝深加工產(chǎn)品都具有十分重要的意義。

近年來(lái)引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注的拉曼光譜技術(shù)為開發(fā)靈芝孢子油氧化酸敗檢測(cè)新技術(shù)提供了契機(jī)。拉曼光譜是1928年印度物理學(xué)家拉曼發(fā)現(xiàn)的一種分子振動(dòng)光譜，傳統(tǒng)高效液相色譜、核磁共振波譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、熒光光譜等方法相比，拉曼光譜技術(shù)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如能夠直接對(duì)樣品無(wú)損傷的定量、定性分析，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜預(yù)處理，樣品用量少，操作簡(jiǎn)便，測(cè)定時(shí)間短，靈敏度高，譜峰尖銳，可明顯表征特定分子的結(jié)構(gòu)等，因而近年來(lái)拉曼光譜技術(shù)已廣泛用于食品分析［16-22］、環(huán)境監(jiān)測(cè)［23］、藥物分析［24-25］、醫(yī)學(xué)鑒定等領(lǐng)域［26-28］。為此，本實(shí)驗(yàn)將利用拉曼光譜技術(shù)建立一種靈芝孢子油氧化酸敗的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)方法以及靈芝孢子油酸值、過(guò)氧化值的快速檢測(cè)新技術(shù)，并利用該方法測(cè)定靈芝孢子油氧化酸敗的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，篩選出高效的靈芝孢子油抗氧化劑。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

靈芝孢子油樣品浙江金華壽仙谷醫(yī)藥股份有限公司。

茶多酚、生育酚（VE）、特丁基對(duì)苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）、鄰苯二甲酸氫鉀、重鉻酸鉀（均為分析純）阿拉丁試劑（上海）有限公司；酚酞、淀粉、碘化鉀、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、無(wú)水碳酸鈉、乙醇、乙醚、氯仿、冰醋酸（均為分析純）華東醫(yī)藥試劑股份有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

DeltaNu?Advantage 785型近紅外拉曼光譜儀（波長(zhǎng)785 nm、激光功率120 mW、分辨率4 cm－1、帶NuScope數(shù)字顯微鏡和XYZ三維載物臺(tái)）美國(guó)DeltaNu公司；MK-20干式恒溫器（控溫范圍：－10～100 ℃）杭州奧盛儀器有限公司；RCT磁力攪拌器德國(guó)IKA?RCT Basic公司；BSA224S型電子天平德國(guó)Sartorius AG公司。

1.3方法

1.3.1靈芝孢子油酸值的檢測(cè)

根據(jù)GB/T 5009.37—2003，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定法測(cè)靈芝孢子油酸值：在250 mL錐形瓶中事先加入乙醇、乙醚各25.0 mL混合，精確稱取靈芝孢子油樣品0.500 g加入錐形瓶中，振蕩使其完全溶解。用氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）滴定至粉紅色并連續(xù)30 s不褪色，讀取消耗氫氧化鈉滴定液體積（mL）。

酸值的計(jì)算見公式（1）：

式中：AV為酸值/（mg NaOH/g）；A為消耗氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）的體積/mL；W為試樣取樣量/g；5.61為每毫升氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）相當(dāng)于氫氧化鈉的毫克數(shù)，可根據(jù)標(biāo)定后氫氧化鈉滴定液的準(zhǔn)確濃度進(jìn)行校正。

乙醚和乙醇的混合物配制：取乙醇、乙醚各25.0 mL于250 mL錐形瓶混勻，臨用前先加0.5%的酚酞指示液1 mL，搖勻，滴加氫氧化鈉滴定液適量，調(diào)至微顯粉紅色。

0.1 mol/L氫氧化鈉滴定液的配制：先配制氫氧化鈉飽和溶液，稱取過(guò)量氫氧化鈉固體溶于蒸餾水中，其中氫氧化鈉固體溶解度為111 g（20 ℃），移液管準(zhǔn)確移取上清液1.4 mL于250 mL容量瓶中用新煮沸冷卻的無(wú)二氧化碳蒸餾水定容。

氫氧化鈉滴定液的標(biāo)定：精確稱取在105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀約0.600 g，加新沸過(guò)的冷水50.0 mL振搖，使其盡量溶解；加0.5%酚酞指示液2 滴，用本液滴定至溶液顯粉紅色。每1 mL的氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）相當(dāng)于20.42 mg的鄰苯二甲酸氫鉀。標(biāo)定濃度（C）結(jié)果的計(jì)算見公式（2）：

式中：W為鄰苯二甲酸氫鉀的稱樣量/g；V為標(biāo)定時(shí)消耗氫氧化鈉滴定液的體積/mL。

0.5%酚酞溶液的配制：稱取0.50 g酚酞，溶解于100 mL 95%的乙醇溶液中，無(wú)需加水。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次并計(jì)算其平均值。

1.3.2靈芝孢子油過(guò)氧化值的檢測(cè)

在250 mL干燥碘瓶中加入1.500 g的靈芝孢子油，之后混入按調(diào)制的氯仿-冰醋酸（1∶1，V/V）的混合液30.0 mL，通過(guò)不斷振蕩搖勻樣品。待充分搖勻后加入約1.0 mL新配制的碘化鉀飽和溶液，加入后輕輕搖動(dòng)半分鐘時(shí)間，待搖勻后放置于暗處?kù)o置5 min。隨后向碘瓶?jī)?nèi)加水80.0 mL，使之混勻，然后用標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉滴定液（0.1 mol/L）滴定，先滴定至溶液呈現(xiàn)淺黃色，然后加入淀粉溶液，作為反應(yīng)指示劑，滴定至藍(lán)色消失，此時(shí)達(dá)到的即為滴定終點(diǎn)。以硫代硫酸鈉溶液的體積消耗數(shù)，計(jì)算油脂的過(guò)氧化值。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次并計(jì)算其平均值。計(jì)算見公式（3）：

式中：POV為過(guò)氧化值/（mmol/kg）；V1為樣品消耗的標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉體積/mL；V2為空白實(shí)驗(yàn)消耗的標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉體積/mL；M為樣品質(zhì)量/g。

硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液配制：稱取硫代硫酸鈉26.0 g，與無(wú)水碳酸鈉0.20 g，加新沸過(guò)的冷水溶解成1 000 mL，搖勻，放置1 個(gè)月，過(guò)濾后備用。

硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液的標(biāo)定：精確稱取在120 ℃干燥至質(zhì)量恒定的基準(zhǔn)重鉻酸鉀0.150 g，放置于碘量瓶中。加水50 mL溶解，加碘化鉀2.0 g，輕輕振搖溶解，加稀硫酸40 mL，搖勻，在暗處放置10 min，加水250 mL稀釋，用本液滴定近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液3 mL，繼續(xù)滴定到藍(lán)色消失而顯亮綠色，并將滴定的結(jié)果用空白實(shí)驗(yàn)校正。每1 mL的 硫代硫酸鈉滴定液（0.1 mol/L）相當(dāng)于4.903 mg的重鉻酸鉀。根據(jù)本液消耗量與重鉻酸鉀的用量，算出本液的準(zhǔn)確質(zhì)量濃度（F），計(jì)算見公式（4）：（4）

式中：Ms為重鉻酸鉀的質(zhì)量/g；V為滴定所耗硫代硫酸鈉滴定液的體積/mL；V0為空白實(shí)驗(yàn)所耗硫代硫酸鈉滴定液的體積/mL。

1.3.3靈芝孢子油拉曼光譜檢測(cè)

取200 μL孢子油置于200 μL樣品管中，放入拉曼光譜儀樣品池中，激光強(qiáng)度選擇高檔，激光聚焦點(diǎn)為樣品管中心，激光照射時(shí)間設(shè)定為10 s，儀器自動(dòng)環(huán)境雜散光校準(zhǔn)和基線校正。每個(gè)樣品由儀器連續(xù)掃描5 次，儀器自動(dòng)平均后得到靈芝孢子油的拉曼光譜圖。儀器可以自動(dòng)連續(xù)測(cè)定樣品，從而可以對(duì)樣品進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

1.3.4靈芝孢子油氧化酸敗的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

影響靈芝孢子油酸值和過(guò)氧化值的重要因素是溫度、光線、空氣，且溫度的影響大于空氣和光線的影響［29］。參照Schaal烘箱加速法［30］，準(zhǔn)確稱取5 份靈芝孢子油，一份置于冰箱中密封避光條件下做為對(duì)照樣保存，其他4 份分別置于10、35、50、70 ℃恒溫器中避光敞口保存，每隔24 h攪拌一次混勻，定期取樣，用拉曼光譜儀測(cè)定靈芝孢子油的拉曼光譜圖，并根據(jù)中國(guó)藥典一部［14-15］中對(duì)油脂測(cè)定的規(guī)定測(cè)定各自的酸值和過(guò)氧化值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次并計(jì)算其平均值。

1.3.5抗氧化劑對(duì)靈芝孢子油穩(wěn)定性的影響

根據(jù)GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定，TBHQ在油脂中的最大許可使用量為0.02%，所以本實(shí)驗(yàn)選擇TBHQ、VE、茶多酚3 種抗氧化劑并分別按0.02%的劑量添加。參照Schaal烘箱加速法［30］，準(zhǔn)確稱取4 份靈芝孢子油，一份不添加抗氧劑做為對(duì)照樣，其他3 份分別添加TBHQ、VE和茶多酚，置于70 ℃恒溫器中避光敞口保存，每隔24 h攪拌一次混勻，定期取樣，用拉曼光譜儀測(cè)定靈芝孢子油的拉曼光譜圖。并根據(jù)中國(guó)藥典一部［14］中對(duì)油脂測(cè)定的規(guī)定測(cè)定各自的酸值和過(guò)氧化值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次并計(jì)算其平均值。

2　　結(jié)果與分析

2.1靈芝孢子油的拉曼光譜分析

圖 1　　靈芝孢子油的拉曼光譜圖Fig.1　　Raman spectrum of Ganoderma lucidum spore oil

如圖1所示，根據(jù)參考文獻(xiàn)［31-32］，對(duì)其中的主要特征峰對(duì)應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)官能團(tuán)指認(rèn)如下。1 745.6 cm－1對(duì)應(yīng)于分子中羰基C=O的伸縮振動(dòng)峰，1 654.5 cm－1對(duì)應(yīng)于不飽和雙鍵的伸縮振動(dòng)峰，1 439.2 cm－1對(duì)應(yīng)于烴基碳?xì)滏ICH剪式振動(dòng)峰，1 300.9 cm－1對(duì)應(yīng)于烴基的變形振動(dòng)峰。在拉曼光譜中，碳-碳雙鍵通常以很強(qiáng)的特征峰出現(xiàn)，峰的強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與雙鍵的濃度呈正比關(guān)系，當(dāng)雙鍵發(fā)生氧化降解酸敗時(shí)，峰的強(qiáng)度下降，從而可以通過(guò)測(cè)定碳-碳雙鍵的特征拉曼峰強(qiáng)度來(lái)直接檢測(cè)碳-碳雙鍵的降解程度。根據(jù)文獻(xiàn)［11，33-34］研究，不飽和油脂、植物油及靈芝孢子油等氧化酸敗的本質(zhì)主要是其中含有的不飽和雙鍵發(fā)生氧化降解酸敗的結(jié)果［11］。孢子油拉曼譜圖中1 655 cm－1雙鍵伸縮振動(dòng)峰的強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與雙鍵濃度呈比例關(guān)系，所以可以通過(guò)檢測(cè)1 655 cm－1的雙鍵峰強(qiáng)度來(lái)對(duì)靈芝孢子油的氧化酸敗進(jìn)行定量分析。

2.2靈芝孢子油氧化酸敗過(guò)程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

靈芝孢子油氧化酸敗的本質(zhì)是其中含有的不飽和雙鍵發(fā)生氧化的結(jié)果［11］。孢子油拉曼譜圖中位于1 655 cm－1的雙鍵伸縮振動(dòng)峰的強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與雙鍵的濃度呈正比，所以可以通過(guò)檢測(cè)1 655 cm－1的雙鍵峰強(qiáng)度來(lái)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)孢子油的氧化酸敗過(guò)程。相比于其他監(jiān)測(cè)孢子油氧化酸敗的技術(shù)手段（如核磁、高效液相色譜、質(zhì)譜等），拉曼光譜技術(shù)更具有簡(jiǎn)單、直接、快捷，受氧化中間產(chǎn)物（如醛、酮）的影響小，樣品無(wú)需復(fù)雜預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)。

在恒溫50 ℃條件下，靈芝孢子油暴露在空氣中，于5、7、14、2、28、35 d取樣時(shí)的拉曼光譜圖如圖2所示?？梢钥闯觯?0 ℃時(shí)靈芝孢子油從第7天起就發(fā)生了明顯的氧化酸敗，14 d后大約2/3的不飽和雙鍵酸已經(jīng)破壞，說(shuō)明50 ℃溫度條件下靈芝孢子油氧化酸敗的速度很快。

圖 2　靈芝孢子油在50 ℃時(shí)長(zhǎng)時(shí)間氧化酸敗的拉曼光譜監(jiān)測(cè)圖Fig.2　Raman spectra showing the oxidative rancidity ofGanoderma lucidum spore oil at 50 ℃

以拉曼光譜圖中雙鍵峰的積分強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖得到靈芝孢子油隨時(shí)間變化的酸敗曲線，將不同反應(yīng)溫度條件下（10、35、50、70 ℃）得到酸敗曲線繪于圖3a中，可以看出，溫度對(duì)孢子油氧化酸敗的速度影響十分明顯，10 ℃時(shí)靈芝孢子油經(jīng)過(guò)20 d氧化酸敗也很少，而70 ℃時(shí)經(jīng)過(guò)數(shù)小時(shí)大部分孢子油即發(fā)生了酸敗。由酸敗曲線的斜率求出初始反應(yīng)速率常數(shù)，根據(jù)阿倫尼烏斯定律，以反應(yīng)速率常數(shù)（lnk）對(duì)溫度的倒數(shù)（1/T）作圖，如圖3b所示，計(jì)算得到氧化酸敗反應(yīng)的表觀活化能為?E = 44.35 kJ/mol。

圖 3　　反應(yīng)溫度對(duì)靈芝孢子油氧化酸敗反應(yīng)的影響Fig.3　　Effect of temperature on the oxidative rancidity of Ganoderma lucidum spore oil

2.3靈芝孢子油抗氧化劑的篩選

圖 4　　添加不同抗氧化劑的靈芝孢子油氧化酸敗隨時(shí)間變化曲線Fig.4　　Time courses of oxidative rancidity of Ganoderma lucidum spore added with different antioxidants

由于采用拉曼光譜技術(shù)可以簡(jiǎn)單、快捷、直接地監(jiān)測(cè)靈芝孢子油氧化酸敗過(guò)程，從而可以通過(guò)高溫加速實(shí)驗(yàn)進(jìn)行孢子油抗氧化劑的快速篩選。如圖4所示，在70 ℃條件下，監(jiān)測(cè)添加0.02%抗氧劑和不加抗氧劑孢子油的氧化酸敗速率，很顯然，不加抗氧劑的孢子油數(shù)小時(shí)內(nèi)很快被氧化，抗氧化效果：VE＞茶多酚＞TBHQ，添加VE

的孢子油6 d后（雙鍵峰強(qiáng)度下降約5%）才出現(xiàn)輕微氧化酸敗。根據(jù)前面得到活化能數(shù)據(jù)（?E = 44.35 kJ/mol），可以計(jì)算出在室溫條件下（20 ℃）靈芝孢子油貨架期可達(dá)90 d左右。在密閉低溫的環(huán)境中，增加VE用量，可進(jìn)一步顯著延長(zhǎng)孢子油的貨架期。

2.4靈芝孢子油酸值、過(guò)氧化值的快速檢測(cè)

圖 5　孢子油氧化酸敗后產(chǎn)生的酸值（a）以及過(guò)氧化值（bb）與雙鍵拉曼峰的積分強(qiáng)度關(guān)系Fig.5　Plots of Raman peak intensity versus acid value （a） and peroxide value （b） for oxidative rancidity of Ganoderma lucidum spore oil added with different antioxidants

根據(jù)圖4的結(jié)果，以孢子油雙鍵拉曼峰的積分強(qiáng)度與用標(biāo)準(zhǔn)滴定法測(cè)出孢子油酸值作圖，如圖5a所示，可以看出，無(wú)論添加抗氧化劑與否，雙鍵拉曼峰的積分強(qiáng)度與其酸值都有十分良好的線性關(guān)系，表明可以利用拉曼光譜法對(duì)孢子油氧化酸敗過(guò)程中產(chǎn)生的酸值進(jìn)行快速定量檢測(cè)。根據(jù)文獻(xiàn)［35-36］的研究，傳統(tǒng)酸堿滴定法檢測(cè)油脂酸值具有如下局限性：1）酸堿滴定的終點(diǎn)依賴于指示劑顏色的微弱變化，不同個(gè)體間終點(diǎn)判斷差異較大，特別當(dāng)油脂帶有顏色時(shí)誤差更大；2）所需油脂樣品消耗量大（5～10 g），溶液配制、標(biāo)定、滴定耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)（幾小時(shí)）；3）該法所需化學(xué)試劑與藥品多，需要繁瑣配制標(biāo)定溶液，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。而拉曼光譜法無(wú)需人工終點(diǎn)判定與溶液配制標(biāo)定，檢測(cè)時(shí)間快（幾分鐘），樣品消耗量少（普通樣品管：0.2 mL，毛細(xì)樣品管：0.02 mL），操作簡(jiǎn)單便捷，可現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，從而使該檢測(cè)方法具有相當(dāng)大的實(shí)際應(yīng)用前景。

用同樣的方法，以孢子油雙鍵拉曼峰的積分強(qiáng)度與用滴定法測(cè)出孢子油過(guò)氧化值作圖，如圖5b所示。雖然拉曼強(qiáng)度與過(guò)氧化值不呈現(xiàn)線性關(guān)系，但仍然可以通過(guò)非線性 擬合（軟件：Origin 8.0，S擬合）通過(guò)內(nèi)插值的方式對(duì)靈芝孢子油的過(guò)氧化值進(jìn)行快速測(cè)定。

3　　結(jié) 論

綜上結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)利用拉曼光譜技術(shù)直接檢測(cè)靈芝孢子油中不飽和雙鍵來(lái)監(jiān)測(cè)不同溫度條件下的靈芝孢子油氧化酸敗過(guò)程，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)孢子油的氧化酸敗速率影響十分明顯，計(jì)算出氧化酸敗反應(yīng)表觀活化能為44.35 kJ/mol，通過(guò)高溫加速實(shí)驗(yàn)篩選出VE做為孢子油的有效抗氧化劑，在室溫開口的環(huán)境下使孢子油的貨架期達(dá)到90 d，在密閉低溫的環(huán)境中貨架期更長(zhǎng)。

通過(guò)與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)滴定法對(duì)比，發(fā)現(xiàn)雙鍵拉曼峰的積分強(qiáng)度與孢子油的酸值之間存在良好線性關(guān)系，從而可利用拉曼光譜法對(duì)孢子油氧化酸敗過(guò)程中產(chǎn)生的酸值進(jìn)行定量檢測(cè)。相比于傳統(tǒng)酸堿滴定，該方法簡(jiǎn)單、方便、快捷，用樣量少，成本低廉，具有實(shí)際應(yīng)用前景。

［1］葉錦先， 高鶴， 高煒， 等. 靈芝孢子的藥理和臨床療效［J］. 藥膳食療研究， 2000（1）: 3-5.

［2］胡瞬， 易有金， 熊興耀， 等. 靈芝孢子油的研究進(jìn)展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 38（17）: 9214-9215.

［3］GAO Pei， HIRANO T， CHEN Zhiqing， et al. Isolation and identification of C-19 fatty acids with anti-tumor activity from the spores of Ganoderma lucidum （reishi mushroom）［J］. Fitoterapia， 2012，83（3）: 490-499.

［4］XIE Yizhen， LI Senzhu， YEE A， et al. Ganoderma lucidum inhibits tumour cell proliferation and induces tumour cell death［J］. Enzyme and Microbial Technology， 2006， 40（1）: 177-185.

［5］FU Yujie， LIU Wei， ZU Yuangang， et al. Breaking the spores of the fungus Ganoderma lucidum by supercritical CO2［J］. Food Chemistry，2009， 112（1）: 71-76.

［6］DEEPALAKSHMI K， MIRUNALINI S， KRISHNAVENI M， et al. In vitro and in vivo antioxidant potentials of an ethanolic extract of Ganoderma lucidum in rat mammary carcinogenesis［J］. Chinese Journal of Natural Medicines， 2013， 11（6）: 621-627.

［7］PATERSON R R M. Ganoderma: a therapeutic fungal biofactory［J］. Phytochemistry， 2006， 67（18）: 1985-2001.

［8］El-MEKKAWY S， MESELHY M R， NAKAMURA N， et al. Anti-HIV-1 and anti-HIV-1-protease substances from Ganoderma lucidum［J］. Phytochemistry， 1998， 49（6）: 1651-1657.

［9］MIN B S， NAKAMURA N， MIYASHIRO H， et al. Triterpenes from the spores of Ganoderma lucidum and their inhibitory activity against HIV-1 protease［J］. Chemical and Pharmaceutical Bulletin， 1998，46（10）: 1607-1612.

［10］ 李森柱， 謝意珍， 周靜文， 等. 靈芝孢子油主要活性成分及降血脂功能的研究［J］. 中國(guó)食用菌， 2006， 25（5）: 40-42.

［11］ 陳體強(qiáng)， 吳錦忠， 徐潔， 等. 靈芝孢子油脂肪酸組分的分析［J］. 菌物研究， 2005， 3（2）: 35-38.

［12］ 王改琴， 王恬. 油脂氧化酸敗對(duì)畜禽機(jī)體功能影響及其氧化防控措施［J］. 中國(guó)油脂， 2010， 35（7）: 46-49.

［13］ 何志平， 龐林江. 油脂氧化檢測(cè)方法研究進(jìn)展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010， 38（21）: 11460-11462.

［14］ 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典： 一部［M］. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010: 附錄54-57.

［15］ 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 5009.3—2003 食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法［S］. 2003.

［16］ ZHANG Yuanyuan， LAI Keqiang， ZHOU Jinglie， et al. A novel approach to determine leucomalachite green and malachite green in fish fillets with surface-enhanced Raman spectroscopy （SERS） and multivariate analyses［J］. Journal of Raman Spectroscopy， 2012， 43（9）: 1208-1213.

［17］ CHEUNG W， SHADI I， XU Yun， et al. Quantitative analysis of the banned food dye Sudan-1 using surface enhanced Raman scattering with multivariate chemometrics［J］. Journal of Physical Chemistry C，2010， 114（16）: 7285-7290.

［18］ LIN M， HE L， AWIKA J， et al. Detection of melamine in gluten， chicken feed， and processed foods using surface enhanced Raman spectroscopy and HPLC［J］. Journal of Food Science， 2008， 73（8）: 129-134.

［19］ 郝勇， 孫旭東， 耿響. 山茶油中脂肪酸的拉曼光譜定量分析［J］.食品科學(xué)， 2013， 34（18）: 137-140. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201318027.

［20］ WU Xiaomei， XU Chao， TRIPP R A， et al. Detection and differentiation of foodborne pathogenic bacteria in mung bean sprouts using fi eld deployable label-free SERS devices［J］. Analyst， 2013，138: 3005-3012.

［21］ 李言， 謝云飛， 錢和， 等. 表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測(cè)赤蘚紅［J］. 食品工業(yè)科技， 2013， 34（11）: 307-312.

［22］ 周紅武， 蔡志堅(jiān)， 吳建宏. 非法食品添加劑拉曼檢測(cè)中的熒光抑制［J］.中國(guó)激光， 2013， 40（9）: 223-228.

［23］ 龔繼來(lái)， 呂璞， 曾光明. 表面增強(qiáng)拉曼光譜在環(huán)境分析中的研究進(jìn)展［J］. 化學(xué)傳感器， 2009， 29（3）: 8-12.

［24］ LI Xiaozhou， YU Zhuang， YANG Tianyue， et al. Detection of organophosphorus pesticide residue on the surface of apples using SERS［J］. Spectroscopy and Spectral Analysis.， 2013， 33（10）: 2711-2714.

［25］ ZHU Yiqun， LI Mingqiang， YU Daoyang， et al. A novel paper rag as ‘D-SERS' substrate for detection of pesticide residues at various peels［J］. Talanta， 2014， 128: 117-124.

［26］ RAVINDRANATH S P， WANG Yuling， IRUDAYARAJ J. SERS driven cross-platform based multiplex pathogen detection［J］. Sensors and Actuators B: Chemical， 2011， 152（2）: 183-190.

［27］ NENG Jing， HARPSTER M H， ZHANG Hao， et al. A versatile SERS-based immunoassay for immunoglobulin detection using antigencoated gold nanoparticles and malachite green-conjugated protein A/ G［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2010， 26（3）: 1009-1015.

［28］ NENG Jing， HARPSTER M H， WILSON W C， et al. Surfaceenhanced Raman scattering （SERS） detection of multiple viral antigens using magnetic capture of SERS-active nanoparticles［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2013， 41: 316-321.

［29］ 王青青， 吳水生. 靈芝孢子油的氧化穩(wěn)定［J］. 福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011， 21（1）: 50-51.

［30］ 魏東. 微膠囊多不飽和脂肪酸粉末的氧化穩(wěn)定性研究［J］. 食品工業(yè)科技， 2007， 28（7）: 88-93.

［31］ 朱明華， 胡坪. 儀器分析［M］. 北京: 高等教育出版社， 2009: 330-332. ［32］ 齊川. 不同來(lái)源靈芝主要活性成分變異［D］. 杭州: 浙江農(nóng)林大學(xué)，2012: 24-27.

［33］ 金虎， 王衛(wèi)東， 耿梅艷， 等. 亞油酸的拉曼光譜分析［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 32（15）: 6827-6828.

［34］ FAN Ya， LI Shuang， XU Dapeng. Raman spectra of oleic acid and linoleic acid［J］. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2013， 33（12）: 3240-3243.

［35］ 李書國(guó)， 張惠， 薛文通， 等. 一種簡(jiǎn)捷、快速、準(zhǔn)確測(cè)定植物油酸值方法的研究［J］. 糧油加工， 2007（10）: 83-86.

［36］ 王勇， 劉寶林， 王欣， 等. 滴定法滴定稻米油酸值的影響分析［J］. 中國(guó)油脂， 2014， 39（11）: 79-81.

Rapid Detection of Oxidative Rancidity of Ganoderma lucidum Spore Oil by Raman Spectroscopy

NENG Jing， XIANG Yannan， SUN Peilong*
（Ocean College， Zhejiang University of Technology， Hangzhou310014， China）

In this work， Raman spectroscopy was employed to directly monitor the changes in the characteristic peaks of the unsaturated double bonds of Ganoderma lucidum spore oil during oxidative rancidity and the relationship between the peak intensity and oxidative rancidity was discussed. Raman scattering intensity decreased with increasing acid value and peroxide value and a linear correlation between acid value and the area of the characteristic peaks was determined. The kinetic parameters for the oxidative rancidity of Ganoderma lucidum spore oil were also determined. As a result， a new and fast approach for the detection of oxidative rancidity in Ganoderma lucidum spore oil by Raman spectroscopy was established. This method was further validated and used to measure the kinetic parameters of oxidative rancidity and screen antioxidants for Ganoderma lucidum spore oil.

Raman spectroscopy； Ganoderma lucidum spore oil； oxidative rancidity； rapid detection

TS207.3

A

1002-6630（2015）24-0200-05

10.7506/spkx1002-6630-201524037

2015-01-19

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301483）；浙江省食藥用菌產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟建設(shè)項(xiàng)目（2011LM201）；浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y201329221）

能靜（1985—），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。E-mail：nengjing@zjut.edu.cn

孫培龍（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與資源利用。E-mail：sun_pl@zjut.edu.cn