四川引種甜葉菊的糖苷含量變異及優(yōu)良單株篩選

楊文婷，蔡乾蓉，徐應(yīng)文，劉 千，吳 衛(wèi)

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，雅安 625014）

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni），簡稱甜菊，為菊科甜葉菊屬多年生草本植物，原產(chǎn)南美巴拉圭一帶，1976年在我國引種試種成功[1]。甜葉菊富含糖苷類物質(zhì)，其糖苷具有高甜度（為蔗糖250～450倍）、低熱量（僅為蔗糖的1/300）的特點(diǎn)，被譽(yù)為繼甘蔗、甜菜之后的世界第三大糖源。甜葉菊還具有一定的藥理作用，對糖尿病、心臟病和高血壓等有較好的療效，逐漸引起人們的關(guān)注和重視，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于保鍵飲料、低熱量食品和醫(yī)藥行業(yè)中。

一般認(rèn)為甜葉菊中含有8種以上糖苷成分[2]，其中，Stevioside（簡稱St苷）和Rebaudioside（簡稱RA苷）占80%以上。St苷的甜度為蔗糖的250～300倍，有后苦味，而RA苷的甜度為蔗糖350～450倍，且味質(zhì)好，口感最接近于蔗糖，因而RA苷含量高的甜葉菊原料備受青睞；同時(shí)，如果原料中RA和St苷含量接近會給工業(yè)生產(chǎn)中的分離純化帶來困難，提高成本，所以目前甜葉菊育種工作主要聚焦于高RA苷含量、高RA/St比例的優(yōu)質(zhì)的RA型糖用品種的培育。但近年來國外有研究表明，St苷具有降低Ⅱ型糖尿病血糖濃度和控制高血壓的作用[3、4]，并且St苷還具有很好的抗癌活性[5]，有望開發(fā)成為新一代天然抗癌制劑，因此高St含量的藥用型甜葉菊良種的選育也應(yīng)是甜葉菊育種工作的一個(gè)潛在方向。

甜葉菊為自交不親和的異花授粉植物，采用種子繁殖后代性狀分離嚴(yán)重，因而生產(chǎn)上多采用無性扦插繁殖。近年來，四川開始大面積引種甜葉菊，但引種的RA型甜葉菊良種經(jīng)1～2年的扦插繁殖后，田間植株在葉形、葉色及株形長勢上表現(xiàn)出明顯差異，出現(xiàn)RA苷普遍下降，RA/St比例偏小等問題。本文對引種至四川的甜葉菊無性繁殖材料，在田間隨機(jī)選擇46個(gè)單株（按其田間表型特征分可為6類）進(jìn)行了RA和St糖苷含量測定，并進(jìn)行了聚類分析，一方面旨在探討RA和St糖苷含量與甜葉菊植株的田間表型特征的關(guān)聯(lián)；另一方面試圖篩選出高RA苷含量、高RA/St比例的糖用型或高St苷含量的藥用型甜葉菊單株材料，為不同用途的甜葉菊新品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、儀器與試劑

材料：甜葉菊無性繁殖種苗由成都華高集團(tuán)提供，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)吳衛(wèi)教授鑒定為菊科甜葉菊屬甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni）。于2008年3月扦插育苗，4月移栽至四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研農(nóng)場，株行距20cm×40cm，2008年10月割去地上部分，田間自然越冬，次年繼續(xù)萌芽生長，加強(qiáng)田間管理，于現(xiàn)蕾初期田間隨機(jī)選取46份甜葉菊單株材料，考察植株上部第4～7葉的葉長和葉寬（葉片最寬處測量值），每株各測定30片葉。并采集其植株上部第4～7位的鮮葉在120℃下殺青10min，后80℃烘干、粉碎待用。

46份甜葉菊單株材料按葉形、葉色、植株被毛情況等表型特征可分為A、B、C、D、E和F 6類，見表1。其中，倒披針形的葉長/葉寬為2.5～3.4，細(xì)柳葉形葉長/葉寬為4.0～5.5，闊橢圓形葉長/葉寬為2.1～2.8，長橢圓形葉長/葉寬為 2.7～3.9。

儀器設(shè)備：上海一恒科技有限公司HWS 28型電熱恒溫水浴鍋、Thermo BR4i型冷凍離心機(jī)、Sartorius CP225 D型電子天平、HS6150 D型超聲清洗器、Millipore Mill-Q型超純水系統(tǒng)、Agilent公司1100型高效液相色譜儀（含脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動進(jìn)樣器進(jìn)樣、柱溫箱、DA D檢測器）等。

試劑：RA苷標(biāo)準(zhǔn)品為日本和光純藥業(yè)株式會社制，其純度≥97.4%；St苷標(biāo)準(zhǔn)品為成都曼思特對照品制，其純度≥95.5%；乙腈為色譜純；乙醇、Ca（OH）2、FeSO·7H2O 等為分析純。

表1 甜葉菊單株材料的表型類型及性狀表現(xiàn)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單株糖苷提取方法 稱取甜葉菊粉末1g于50mL離心管中，加入蒸餾水40mL，蓋緊離心管蓋，80℃下恒溫水浴浸提 3h，每隔 1h攪拌 1次。 后按 5∶3的比例加入 Ca（OH）2和 FeSO4·7H2O[6]，80℃下靜置沉淀 2h，再3000r/min離心10min，取上清液定容至50mL，過0.45μm濾膜，待測。每單株兩次重復(fù)。

1.2.2 甜葉菊糖苷種類和含量的檢測 甜葉菊糖苷種類和含量的檢測采用高效液相色譜（HPLC）法。甜葉菊RA和St糖苷的含量通過HPLC外標(biāo)定量法計(jì)算，RA和St糖苷的量分別以RA和St糖苷占干葉重的百分?jǐn)?shù)表示。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別稱取RA苷標(biāo)準(zhǔn)品1.100g和St苷標(biāo)準(zhǔn)品1.020g于10mL容量瓶中，用V乙腈∶V水=75∶25定容至刻度，再超聲5min中，得RA苷和St苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。

色譜條件：色譜柱：Phenomenex Luna NH2 柱，4.6×250mm；流動相：V乙腈∶V水=75∶25；流速：1.2mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：205nm；進(jìn)樣量：10μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

由色譜工作站計(jì)算樣品中RA和St糖苷含量。在此基礎(chǔ)上，計(jì)算St苷和RA苷總量St+RA，RA苷占總苷的比值RA/（St+RA），St苷占總苷的比值St/（St+RA）以及RA苷與St苷的比值RA/St，所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Excel軟件進(jìn)行。并根據(jù)RA和St糖苷含量，利用DPS v7.05統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用歐式遺傳距離，WPGMA聚類分析重建46個(gè)甜菊單株材料的分類關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別取RA和St苷標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、15、20、25μL進(jìn)樣。由色譜工作站處理數(shù)據(jù)，以RA和St苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制得兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，RA和St苷相應(yīng)的回歸方程分別為y=0.0003x+0.0084，r2=0.9999；y=0.0005x+0.0539，r2=0.9997。 RA、St苷對照品色譜圖見圖 1 A、B。

2.1.2 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取RA和St苷標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測得RA和St苷相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.98%、1.24%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取RA和St苷標(biāo)準(zhǔn)溶液及試驗(yàn)樣品10μL，分別在6、12、24、48、72 h進(jìn)樣測定，標(biāo)準(zhǔn)品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.13%、1.56%；樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.69%。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品及樣品在72 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.1.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一份甜葉菊材料，按1.2.1的提取方法分別同時(shí)配制6份，樣液精密進(jìn)樣10μL，測得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.53%，表明該方法的重現(xiàn)性較好。

2.2 甜葉菊單株RA和St糖苷含量

甜葉菊單株RA和St糖苷測定結(jié)果列于表2，HPLC色譜圖見圖1 C、D。從表中可以看出，甜葉菊單株間RA和St糖苷含量差異明顯。46個(gè)單株間RA糖苷含量的變幅為0～10.56%，St糖苷含量的變幅為2.90%～20.97%，St+RA 變幅為 4.72%～21.74%，RA/（St+RA）變幅為 0～0.758，St/（St+RA）變幅為 0.242～1.000，RA/St變幅為0～3.139。A、C和E表型的單株間RA和St苷含量變幅相對較小，B、D和F表型的單株間RA和St苷含量變幅相對較大，如B類表型的單株間RA和St苷含量變幅分別為1.82%～10.56%和2.90%～16.44%，說明田間表型特性相似的植株其RA和St糖苷的含量也可能存在較大差別，甜葉菊的表型類型分類并不能很好地反應(yīng)甜葉菊內(nèi)在糖苷含量的差異，甜葉菊類型的確定需根據(jù)其有用的糖苷類成分含量進(jìn)行劃分才更科學(xué)合理。

2.3 聚類分析

根據(jù)甜葉菊單株St和RA苷含量對46份甜葉菊材料采用WPGMA法聚類，由系統(tǒng)聚類圖可以看出，46個(gè)甜葉菊單株可明顯地分為兩支。第一支以SR1-1～SR1-8、SR9-1～SR9-3等為主，所有單株的RA/St值均小于1，是St苷含量高于RA苷含量的類型；第二支以SR3-1～SR3-9及SR2-1、SR2-2等為主，其除SR2-4和SR27之外，所有單株的RA/St值均大于1，是RA苷含量高于St苷含量的類型。

以遺傳距離3.21為閾值時(shí)，可以將46份甜葉菊單株材料分為9類（Ⅰ～Ⅸ），見圖左邊的標(biāo)識。其中，Ⅰ和Ⅲ類材料與其表型類別有一定關(guān)系，分別與基于表型劃分的A和E類材料相對應(yīng)（見表1、圖2）；Ⅶ類材料包括了表型類別上的C類所有單株，另外還包括SR2-3、SR27、SR2-5；其余基于表型為B，D和F的材料與基于RA和St含量的聚類結(jié)果關(guān)系不明顯，無特定規(guī)律地分布在Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅷ和Ⅸ類中。值得一提的是，SR2-1、SR2-2、SR24及SR25聚為Ⅷ類，這些植株的RA苷含量＞9.55%，是46份單株材料中RA苷含量和RA/ST比例最高的類型；Ⅵ類則只包括SR5和SR6，二者均只含St苷，且St苷含量分別高達(dá)20.97%和20.38%。

3 小結(jié)與討論

甜葉菊基于RA和St糖苷含量的聚類結(jié)果與依據(jù)甜葉菊田間表型特征的分類不盡一致，即田間表型性狀相似的單株其RA和St糖苷含量卻不盡相同，甚至相差甚遠(yuǎn)，提示甜葉菊RA和St糖苷的代謝與其植株的葉形、葉色等表型特征可能無直接關(guān)聯(lián)，在甜葉菊良種選育的過程中進(jìn)行單株RA和St糖苷的測定是必要的，不能簡單依據(jù)植株表型特征來優(yōu)選單株。

錢愉等的研究表明RA型良種單株無性系的葉片大小和含苷量均存在顯著差異，RA含量變幅為4.5%～12.2%，并從RA含量為9.10%的良種單株無性系中選出RA含量為10.15%～12.15%的單株[7]；韓玉林等從3個(gè)甜葉菊優(yōu)良品系的自然輔助人工授粉結(jié)實(shí)得到的13株單株中篩選得到2個(gè)優(yōu)良單株，RA苷的含量分別為13.34%和12.30%[8]。本試驗(yàn)對引種至四川的甜葉菊材料隨機(jī)選擇46個(gè)單株進(jìn)行RA和St糖苷含量測定，發(fā)現(xiàn)RA苷含量的變幅為0～10.56%，略低于已有的報(bào)道，估計(jì)與試驗(yàn)材料有關(guān)，也可能與四川的氣候環(huán)境與前述研究所處環(huán)境不盡相同有關(guān)。

黃應(yīng)森提出的甜葉菊分型標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為RA型甜葉菊的RA/St值應(yīng)大于1.8[9]，本試驗(yàn)中符合RA/St＞1.8的RA 型甜葉菊單株材料共有 4 份，即 SR2-1、SR2-2、SR3-4、SR25。 除 SR3-4 之外，SR2-1、SR2-2、SR25 的 RA苷含量為9.55%～10.56%，SR3-4的RA苷含量也高達(dá)7.55%，比平均高出2.41%。46份單株中未發(fā)現(xiàn)只含RA苷不含St苷的RA型單株。但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了完全檢測不到RA苷的St型甜葉菊，如SR5和SR6單株，且其含量分別高達(dá)20.97%和20.38%。接下來我們將對SR2-1、SR2-2、SR25及SR5、SR6這5個(gè)優(yōu)良單株進(jìn)行進(jìn)一步的擴(kuò)繁選育，以期篩選出適合四川地區(qū)種植的優(yōu)良RA型糖用或St型藥用甜葉菊新品系。

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