甜菜SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物兩種不同檢測(cè)方法的比較

吳則東,王華忠，韓 英

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080）

分子生物學(xué)的快速發(fā)展，使基于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的分子標(biāo)記技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用，如品種純度的鑒定[1]、QTL定位[2]、分子標(biāo)記輔助育種、植物遺傳圖譜構(gòu)建[3]、遺傳多樣性評(píng)價(jià)[4,5,6]、基因定位、雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)以及比較基因組學(xué)[7]等方面。目前的分子標(biāo)記技術(shù)方法有許多，常使用的有RAPD、AFLP、SSR和SRAP。RAPD作為一種較早的分子標(biāo)記方法，因其操作簡(jiǎn)便而得到了快速的應(yīng)用，但是由于其穩(wěn)定性、重復(fù)性差，產(chǎn)率低等缺點(diǎn)而限制了其發(fā)展應(yīng)用。而SSR是一種由2～5個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛分布于整個(gè)真核生物基因組的不同座位上，在真核生物中大約每隔10～50 kb就存在1個(gè)微衛(wèi)星。SSR擴(kuò)增得到的多為共顯性標(biāo)記，但是其引物的開發(fā)費(fèi)時(shí)昂貴而在一定程度上限制了它的發(fā)展。AFLP結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點(diǎn)，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性，AFLP以其精確有效得到了廣泛的應(yīng)用，但此技術(shù)操作復(fù)雜，受到專利保護(hù)，而且試劑盒價(jià)格昂貴，對(duì)樣品DNA質(zhì)量要求嚴(yán)格，而使其應(yīng)用受到限制；而SRAP[8]是一種基于PCR的新型標(biāo)記，由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li和Quiros于2001年在研究蕓薹屬作物中開發(fā)的，SRAP與其他基于PCR的分子標(biāo)記相比，獨(dú)特之處就在于它的引物設(shè)計(jì)。SRAP引物是針對(duì)基因組成的一些特點(diǎn)而設(shè)計(jì)，即外顯子一般位于富含GC區(qū)域，在不同個(gè)體中通常是保守的，而內(nèi)含子、啟動(dòng)子則處于富含AT區(qū)域，在不同物種甚至不同個(gè)體間變異很大。因此正向引物針對(duì)序列相對(duì)保守的外顯子，使用“CCGG”序列就可以特異擴(kuò)增出含這些組分的序列；反向引物針對(duì)變異大的內(nèi)含子、啟動(dòng)子和間隔序列，使用“AATT”序列以特異結(jié)合富含AT區(qū)。因此，該標(biāo)記通過獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)優(yōu)先擴(kuò)增基因組內(nèi)的開放閱讀框（ORFs）。正、反向引物分別與外顯子和啟動(dòng)子（或內(nèi)含子）區(qū)域配對(duì)，因不同物種、不同個(gè)體的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不等而產(chǎn)生多態(tài)性[9]。該標(biāo)記具有簡(jiǎn)便高效、產(chǎn)率高、共顯性高、重復(fù)性好、易測(cè)序、便于克隆目標(biāo)片段的特點(diǎn)而得到了廣泛的應(yīng)用，SRAP主要包括模板制備、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測(cè)幾個(gè)主要步驟。就產(chǎn)物檢測(cè)而言，目前主要用大板變性聚丙烯酰胺凝膠（4%～6%，含8mol/L尿素）電泳分離，采用銀染顯色。也可用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，但可分辨的條帶較少[10]，有的研究者也采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，進(jìn)行銀染檢測(cè)[11]。本研究通過對(duì)6種甜菜二倍體的SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物變性及非變性膠的檢測(cè)進(jìn)行比較，以期找到一種省時(shí)、高效、分辨率高、重復(fù)性好的檢測(cè)方法，為將來SRAP在甜菜屬的大量應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

甜菜二倍體品系 6 個(gè)，代號(hào)為 TB001、TB002、TB003、TB004、TB005、TB006，均由黑龍江大學(xué)甜菜遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室多倍體課題組提供。2006年4月29日播種，7月8日上午取樣，各材料分別選取5株生長(zhǎng)健壯的個(gè)體，選取甜菜的中心嫩葉，然后放于小袋中。用冷凍真空干燥機(jī)（modnlyo D型）進(jìn)行干燥，待樣品充分干燥后取出，用離心管密封保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取每個(gè)樣品的干粉，采用CTAB法提取基因組DNA。提取的DNA樣品經(jīng)含有0.5μg/L溴化乙錠的 0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè) （每個(gè)孔道加 1μL樣品 DNA、4μL ddH2O、1μL 6×Loading Buffer），結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)（凝膠成像儀由Bio-RAD公司生產(chǎn)），最后根據(jù)和λDNA檢測(cè)濃度的結(jié)果比對(duì)，將樣品DNA濃度稀釋為40ng/μL，用于SRAP分析。

1.2.2 SRAP-PCR擴(kuò)增 SRAP引物采用Li等[8]已發(fā)表的引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。通過篩選采用了Me2與Em1的組合，其中正向引物Me2序列為:5'-TGAGTCCAAACCGGAGC-3'，反向引物Em1序列為:5'-GACTGCGTACGAATTAAT-3'。PCR（PCR儀為PTC-100）反應(yīng)程序?yàn)?，?0μL SSRPCR 反應(yīng)體系中， 加入 2.5mmol/L 的 dNTP 1μL，5U/μL Taq DNA 聚合酶 0.1μL，50ng/μL 的引物各 0.8μL，40ng模板DNA，10×PCR Buffer 2μL，最后用重蒸水調(diào)整體系使終體積為20μL，最后加1滴滅菌的石蠟油，蓋上蓋板。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸 10min，4℃保存。

1.3 PAGE電泳檢測(cè)

1.3.1 變性PAGE電泳檢測(cè) （1）電泳：擴(kuò)增產(chǎn)物4μL加2μL 10倍上樣緩沖液（47.5mL甲酰胺、2.0mL的0.5M EDTA、溴酚藍(lán)0.125g、定容到50mL），95℃變性5min，取出后置于冰水混合物中迅速冷卻，用6%變性聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺 57.0g、甲叉雙丙烯酰胺 3.0g、10×TBE 100.0μL、尿素 420.42g、加水至 900mL，攪拌使其完全溶解，定容至1000mL）60mL，加入50μL的TEMED和300μL 10%的過硫酸銨混勻，然后灌膠，垂直板電泳槽和電泳儀由Bio-RAD公司生產(chǎn)；dNTP、Taq聚合酶、10×PCR Buffer購(gòu)自百泰克生物技術(shù)有限公司。

（2）銀染方法：①電泳結(jié)束后，輕輕取下長(zhǎng)板，將長(zhǎng)板放入2L 10%的醋酸溶液中，輕輕搖動(dòng)30min，蒸餾水中漂洗2次，每次3min；②染色（在2L蒸餾水中加入2g硝酸銀，3mL甲醛）30min；③染色完畢后在蒸餾水中迅速漂洗3～4s，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的碳酸鈉溶液中（其中含有3mL甲醛，400μL 10mg/mL的硫代硫酸鈉），在搖床上顯影至條帶清晰為止。

1.3.2 非變性PAGE電泳檢測(cè) （1）電泳：20μL體系中加入非變性的雙色上樣緩沖液（非變性指示劑100mL水中加入40g蔗糖，0.125g二甲苯菁，0.125g溴酚藍(lán)）6μL，PCR產(chǎn)物14μL，采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行灌膠，其中垂直板電泳槽是北京市六一儀器廠的，型號(hào)是DYCZ-30。電泳儀由Bio-RAD公司生產(chǎn)。

（2）非變性膠的銀染方法：電泳結(jié)束后，將膠輕輕剝下。①固定：將膠置于100mL固定液中（10%無水乙醇，0.5%冰乙酸），脫色搖床上緩慢搖動(dòng) 6min，2次。②銀染：倒去固定液，加入100mL 0.2%AgNO3溶液，脫色搖床上緩慢搖動(dòng) 12min。③清洗：倒去AgNO3溶液，用100mL ddH2O清洗30s。④降低背景：加入0.002%硫代硫酸鈉100mL，脫色搖床上緩慢搖動(dòng)30s后倒去。⑤顯色：加入100mL顯色液（1.5%氫氧化鈉，0.4%甲醛），脫色搖床上緩慢搖動(dòng)至肉眼看到清晰的DNA條帶。⑥照相：用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行記錄。

圖1 非變性膠

圖2 變性膠

2 結(jié)果與分析

比較圖1和圖2（其中的序號(hào)對(duì)應(yīng)甜菜樣品的序號(hào)）可知，二者均為銀染，雖然電泳過程不同，染色方法不同，但從圖中我們可以看出，二者在主帶上沒有差異，僅在一些弱帶上略有不同，其分辨率差異不大，但相比較而言，非變性膠可以在短時(shí)間內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，而且易操作。

3 討論

甜菜做為小作物，國(guó)內(nèi)在基礎(chǔ)方面的研究比較薄弱，尤其是在分子水平上的研究則更是較少，近年來，國(guó)家加大了甜菜科研的投資力度，國(guó)家甜菜產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)項(xiàng)目的大額投入使得甜菜分子生物學(xué)方面的進(jìn)一步研究成為可能，如甜菜品種純度的鑒定、QTL定位、分子標(biāo)記輔助育種以及甜菜遺傳圖譜的構(gòu)建等等，這些都需要利用分子標(biāo)記技術(shù)，而目前分子標(biāo)記技術(shù)實(shí)用性能較好的要數(shù)SRAP，過去科研工作者在做SRAP分子標(biāo)記的時(shí)候，經(jīng)常使用的是變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，用伯樂的垂直板灌膠，這種灌膠的方法需要涂親和與剝離，灌膠的過程也較為復(fù)雜，PCR的產(chǎn)物也需要變性處理，銀染的過程也較為復(fù)雜，需要使用搖床，整個(gè)流程下來需要1個(gè)多小時(shí)的時(shí)間，具有較高的專業(yè)性；而非變性膠的灌制則比較簡(jiǎn)單，只需要用瓊脂糖封底，凝固后稍微傾斜一下把配好的膠倒到兩個(gè)板子中間，再插上梳子，等待凝固，凝固后拔掉梳子，加緩沖液點(diǎn)樣即可，非變性膠的顯色過程也比較簡(jiǎn)單，因?yàn)槟z比較小，所以只需要一個(gè)小的搪瓷盤，大約在30min之內(nèi)即可完成。而通過對(duì)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的顯色發(fā)現(xiàn)，這兩種方法顯示的結(jié)果分辨率差異不大，但由于非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳具有灌膠簡(jiǎn)單易學(xué)，顯色時(shí)間短，節(jié)省藥品等特點(diǎn)，可以作為今后甜菜SRAP電泳及顯色的首選方法。

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