電針對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織中mTOR磷酸化水平的影響

龍軼映 張亮 祁芳 唐麗亞 曹佳男 艾坤 劉梨

〔摘要〕 目的 觀察電針對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR） 磷酸化的影響，探索電針治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法 將48只SD大鼠按隨機(jī)法分為4組：空白組、模型對(duì)照組、電針組、甲氨蝶呤組，每組12只。除空白組外，其余3組于大鼠右后足跖關(guān)節(jié)處皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑（Freund’s complete

adjuvant， FCA）（0.1 mL/只）進(jìn)行造模，空白組則同法注射生理鹽水。造模后第3天，電針組予以電針“足三里”“關(guān)元”和“阿是穴”，隔日1次，共16次;甲氨蝶呤組予以甲氨蝶呤（0.1 μg/kg）灌胃給藥，每周1次，共4次。造模后第3、24天測量足跖容積。干預(yù)結(jié)束后第2天使用ELISA法對(duì)各組大鼠血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）表達(dá)量進(jìn)行檢測，Western blot法檢測大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織p-mTORC1、mTORC1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 相比于空白組，模型對(duì)照組大鼠雙側(cè)足跖容積、踝關(guān)節(jié)滑膜組織中p-mTORC1蛋白表達(dá)均增多（P<0.05或P<0.01），且血清中TNF-α含量顯著增多（P<0.01）;相比于模型對(duì)照組，電針組、甲氨蝶呤組大鼠雙側(cè)足跖容積、踝關(guān)節(jié)滑膜組織p-mTORC1蛋白表達(dá)均降低（P<0.05或P<0.01），且大鼠血清中TNF-α含量顯著降低（P<0.01）。結(jié)論 電針可能通過抑制mTORC1蛋白磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，緩解炎癥反應(yīng)。

〔關(guān)鍵詞〕 佐劑性關(guān)節(jié)炎;電針;mTOR;細(xì)胞自噬;足跖容積;腫瘤壞死因子-α

〔中圖分類號(hào)〕R245 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.12.012

Effect of Electroacupuncture on mTOR Phosphorylation Lever of Synovial Tissues of

Adjuvant-induced Arthritis Rats

LONG Yiying1， ZHANG Liang1， QI Fang1， TANG Liya1， CAO Jia’nan1， AI Kun1*， LIU Li2*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective To research the effects of electroacupuncture on the phosphorylation of mammalian target of rapamycin （mTOR） in the synovial tissue of ankle joint of adjuvant-induced arthritis rats， and explore the mechanism of electroacupuncture in treating ?rheumatic arthritis. Methods 48 SD rats were randomly divided into four groups： blank group， model control group， electroacupuncture group， methotrexate group， with 12 rats in each group. Except blank group， the other three groups were intradermal injected with Freund’s complete adjuvant （0.1 mL in each rat） at the foot pad of the right posterior ankle joint for modeling， while the blank group was injected with saline solution in the same way. Three days after the molding， the electroacupuncture group was given electroacupuncture at “Zusanli” （ST36）， “Guanyuan” （BL26） and “Ashi” （experience acupoint） once of everyday， a total of 16 times. Methotrexate group was given methotrexate （0.1 μg/kg） by intragastric administration， once a week for 4 times. Plantar volume was measured before and on day 3 and 24 after modeling. On the second day after intervention， the levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） in serum of rats were measured by ELISA， the protein expression levels of p-mTORC1 and mTORC1 in the synovium tissue were identified by Western blot. Results Compared with blank group， the plantar volume both sides and p-mTORC1 protein expression in synovial tissue of ankle joint were increased （P<0.05， P<0.01）， and the content of TNF-α in serum was significantly increased （P<0.01） in model control group. Compared with model control group， bilateral plantar volume and the expression of p-mTORC1 protein in synovial tissue of ankle joint of rats in electroacupuncture group and methotrexate group were decreased （P<0.05， P<0.01）， and the content of TNF-α in serum was significantly decreased （P<0.01）. Conclusion Electroacupuncture

may induce autophagy and alleviate inflammatory response by inhibiting phosphorylation of mTORC1 protein.

〔Keywords〕 adjuvant-induced arthritis; electricacupuncture; mTOR; autophagy; plantar volume; tumor necrosis factor-α

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種病因不明的系統(tǒng)性免疫性疾病。臨床研究[1-3]表明，電針可以有效減輕關(guān)節(jié)炎癥，減少RA患者晨僵時(shí)間、緩解關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，改善患者日常生活質(zhì)量。目前認(rèn)為，電針治療RA的機(jī)制可能與多方面因素密切相關(guān)[4]。關(guān)節(jié)滑膜炎癥是RA早期最主要病理特征，這一過程與細(xì)胞自噬密切相關(guān)，促進(jìn)自噬可以有效緩解RA炎性反應(yīng)[5]。有研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）與RA滑膜細(xì)胞自噬存在相關(guān)性，mTORC1作為自噬的啟動(dòng)關(guān)鍵負(fù)性調(diào)控因子，其活性降低可以促進(jìn)自噬啟動(dòng)[8-9]，緩解炎癥。本課題組前期研究[10-11]證實(shí)，電針治療佐劑關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis， AA）模型大鼠“足三里”“關(guān)元”能明顯緩解大鼠足跖腫脹程度，改善局部炎癥[12-13]。但目前從細(xì)胞自噬角度探討電針治療RA生物學(xué)機(jī)制的研究較少，因此，本研究擬采用電針“足三里”“關(guān)元”和“阿是穴”干預(yù)AA模型大鼠，以mTORC1為切入點(diǎn)，探討電針干預(yù)AA大鼠中mTORC1與炎癥之間的關(guān)系及其效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠48只，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供（許可證號(hào)：110727201100882974），體質(zhì)量（190±10） g。48只大鼠以3只一籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)室溫度（25.0±1） ℃，濕度（60±10）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白組、模型對(duì)照組、電針組、甲氨蝶呤組，每組12只。實(shí)驗(yàn)全程均遵從《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》其中的動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)規(guī)定（2006年版）[14]。

1.2 ?主要試劑與儀器

完全弗氏佐劑（Freund’s complete adjuvant， FCA）（美國Sigma公司，型號(hào)：SLBW7430）;BCA試劑盒（美國Thermo Scientific公司，型號(hào)：QB214754）;PVDF膜（美國Amersham Pharmacia GE公司，型號(hào)：K5NA8023B）;大鼠抗mTOR抗體（美國Proteintech公司，型號(hào)：20657-1）;大鼠抗 p-mTOR抗體（英國Abcam公司，型號(hào)：Ab109286）;SDS-PAGE制膠試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：072319190723）;rabbit二抗（美國Proteintech公司，型號(hào)：SA00001）;TNFα試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，型號(hào)：E-EL-R2856c）。

GloMax酶標(biāo)儀（美國Promega公司，型號(hào)：GM3030）;高速低溫離心機(jī)（美國SCILOGEX公司，型號(hào)：D3024R）;振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：10RTEX-5）;電泳儀（美國BIO-RAD公司，型號(hào)：041BR126545）;水浴鍋（廈門精藝興業(yè)科技有限公司，型號(hào)：SB-1100）;電熱恒溫槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司，型號(hào)：DK-8D）;移液槍（德國Eppendorf公司，型號(hào)：3120000267）電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品有限公司，型號(hào)：華佗牌SDZ-Ⅱ型）;足跖容積測量儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：YLS-7C）。

1.3 ?模型制備

取高溫（80 ℃）滅活1 h后的液狀的卡介苗160 mg，將其與比值為2∶1的液體石蠟、羊毛脂共16 mL混合后高壓滅菌，致混合液含菌濃度變?yōu)?0 mg/mL，隨后利用超聲波細(xì)胞粉碎儀乳化20 min。疾病動(dòng)物采用AA模型，75%酒精消毒大鼠右足跖部后皮內(nèi)注射FCA（0.1 mL/只）致炎。大鼠免疫后第3天出現(xiàn)足爪急性紅腫，全身性關(guān)節(jié)繼發(fā)癥狀出現(xiàn)，造模后9～12 d關(guān)節(jié)腫脹明顯加重，其余關(guān)節(jié)也出現(xiàn)癥狀，大鼠食欲減退、體質(zhì)量減輕和皮溫變高為模型制備成功的標(biāo)志[15-16]。

1.4 ?干預(yù)方法

空白組、模型對(duì)照組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，均以仰臥位純固定于鼠板20 min;電針組選取“足三里”“關(guān)元”和“阿是穴”，所有穴位均采用直刺，大鼠清醒以仰臥位固定于鼠板上，各穴均使用1寸針，以一側(cè)“足三里”和“關(guān)元”配穴，另一側(cè)“足三里”與同側(cè)“阿是穴”配穴，進(jìn)針后接電針治療儀，波形選擇疏密波（20/100 Hz），強(qiáng)度以觀察針身微微抖動(dòng)為據(jù)，每次電針20 min，造模第3天開始進(jìn)行干預(yù)，隔日1次，共16次。甲氨蝶呤組則采用甲氨蝶呤（0.1 μg/kg）灌胃給藥，每周1次，總共治療4周。

1.5 ?取材方法

干預(yù)結(jié)束后第2天，予以20%烏拉坦溶液10 mL/kg注射到大鼠腹腔，進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血后、離心取上清液;在無菌工作臺(tái)下取大鼠左后足踝關(guān)節(jié)滑膜，用甲醛-乙酸-乙醇固定液進(jìn)行灌注固定，包埋，切片，厚度為5 μm。

1.6 ?指標(biāo)檢測

1.6.1 ?后足跖容積測量 ?用防酒精、防水洗記號(hào)筆標(biāo)識(shí)大鼠雙側(cè)后足足跖關(guān)節(jié)作為測量標(biāo)線，注意全部測量大鼠標(biāo)記位置不能有差異，將足跖容積測量儀校零，往量杯中倒入適量純凈水，按序?qū)⒋笫箅p側(cè)后肢放入量杯中，標(biāo)識(shí)線應(yīng)與液面平行，測量3次，記錄讀數(shù)。在造模后第3、24天分別測量各組大鼠足跖容積并記錄。

1.6.2 ?血清TNF-α含量檢測 ?采用ELISA法，按ELISA試劑盒使用說明進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備、將不同濃度的100 μL標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)孔中，放置37 ℃烘箱溫育、加酶等操作后，加入終止液后，以450 nm的波長測量每個(gè)孔的吸光度（OD值）。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)血清中TNF-α的含量。

1.6.3 ?滑膜組織中mTORC1、p-mTORC1蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測 ?采用Western blot 法測量蛋白含量，稱取100 mg的滑膜組織，再加500 μL RIPA裂解緩沖液，裂解30 min后，離心20 min，使用移液搶精密吸取上清，使用BCA法測出蛋白濃度;移液槍抽取30 μg樣品液后進(jìn)行電泳，然后電轉(zhuǎn)，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上、使用脫脂奶粉室溫封閉1 h后加入一抗（mTORC1稀釋度1∶1000、p-mTORC1稀釋度1∶500），4 ℃保存過夜，隔天將膜清洗3次;然后加入二抗（稀釋度：1∶10 000），37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育1 h。清洗3次后在膜上滴加顯影液顯影2 min，然后在暗室曝光。最后通過ImageJ軟件分析灰度值，將數(shù)據(jù)結(jié)果與其相應(yīng)的內(nèi)參對(duì)比，每組數(shù)據(jù)都通過與其對(duì)應(yīng)的對(duì)照組相比進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算滑膜組織中p-mTORC1、mTORC1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 8.0.2軟件制作圖表。全部數(shù)據(jù)都用“x±s”表示，且均符合正態(tài)分布，方差齊，使用多元因素方差分析法;方差不滿足正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?各組大鼠一般情況

空白組一般情況良好;模型對(duì)照組大鼠于造模后第3天出現(xiàn)不均勻足跖紅腫，全身性繼發(fā)癥狀出現(xiàn)，飲食減少，體質(zhì)量減輕，癥狀高峰期于造模后第15～18天。甲氨蝶呤組和電針組飲食正常，體質(zhì)量較模型組高，且足跖腫脹程度較模型對(duì)照組明顯減輕。

2.2 ?各組大鼠足跖容積比較

造模后第3天，相比于空白組，其余3組大鼠足跖肉眼可見明顯紅腫，足跖容積明顯增大（P<0.01）。造模后第24天，相對(duì)于空白組，其余3組大鼠足跖容積依舊明顯增大（P<0.01）;相比于模型對(duì)照組，甲氨蝶呤組與電針組足跖容積明顯減?。≒<0.01）;而甲氨蝶呤組與電針組大鼠足跖容積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.3 ?各組大鼠TNF-α含量比較

相比于空白組，模型對(duì)照組TNF-α含量明顯增高（P<0.01），提示模型制備成功;相比于模型對(duì)照組，甲氨蝶呤組與電針組TNF-α含量明顯降低（P<0.01）;甲氨蝶呤組與電針組TNF-α含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.4 ?各組大鼠p-mTORC1、mTORC1蛋白含量比較

與空白組相比，模型對(duì)照組大鼠滑膜組織mTORC1蛋白表達(dá)量無明顯變化（P>0.05），p-mTORC1蛋白表達(dá)量上升（P<0.05）;與模型對(duì)照組相比，電針組、甲氨蝶呤組大鼠滑膜組織mTORC1蛋白表達(dá)量無明顯變化（P>0.05），p-mTORC1蛋白表達(dá)量下降（P<0.05）;甲氨蝶呤組與電針組大鼠滑膜組織mTORC1、p-MTORC1蛋白表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1、表3。

3 討論

RA在中醫(yī)學(xué)中屬于“痹癥”范疇，多為“正氣不足、復(fù)感外邪”所致，臨床上多遵循扶正祛邪、標(biāo)本兼治原則，實(shí)現(xiàn)辨證、辨病相結(jié)合，療效明顯[17-18]。針刺有著扶正固本、免疫調(diào)節(jié)等療效。研究所選“關(guān)元”為元?dú)庵煞稣灾钚敖獗?，“足三里”有著溫陽扶正、補(bǔ)益之功，對(duì)痹癥有一定效果，是針灸治療RA的常用穴位。本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組大鼠足跖容積明顯增加（P<0.01），電針“足三里”“關(guān)元”和“阿是穴”后明顯減?。≒<0.01）;模型對(duì)照組血清TNF-α明顯增加（P<0.01），電針后明顯降低（P<0.01）;模型對(duì)照組滑膜組織中p-mTORC1明顯增加（P<0.05），電針后明顯降低（P<0.05）。

滑膜炎癥是RA早期主要病理特征，在臨床治療過程當(dāng)中，抗炎是最主要的治療手段。針灸針對(duì)RA的抗炎效應(yīng)已多次被證實(shí)[19-21]。本課題組前期研究[12-13，22]也發(fā)現(xiàn)，針刺治療AA大鼠能明顯緩解大鼠足跖腫脹程度，降低血漿內(nèi)白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素2、TNF-α，下調(diào)滑膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1、核因子κB（nuclear factor kappa-B， NF-κB）表達(dá)，發(fā)揮其抗炎作用。與這些研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)中模型大鼠經(jīng)電針干預(yù)后足跖容積明顯降低，血清TNF-α明顯降低，再次驗(yàn)證針灸對(duì)RA有很好的抗炎作用。

自噬是指細(xì)胞通過自身細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)外界刺激用來維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的活躍生物過程，在RA的發(fā)生轉(zhuǎn)歸中有著重要影響。最新研究進(jìn)展顯示，自噬在調(diào)控炎癥的發(fā)生發(fā)展方面起著非常重要的作用[23-25]。Cao等[26-27]研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以通過清除炎性聚集體等結(jié)構(gòu)以及下調(diào)相關(guān)促炎性細(xì)胞因子對(duì)抗炎癥反應(yīng)。蛋白mTOR是自噬關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)控因子[28]。

mTOR有mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合物形式，分別接受不同產(chǎn)物信號(hào)，其中，mTORC1參與了促炎和抗炎細(xì)胞因子水平的差異調(diào)節(jié)，mTORC1被磷酸化后可以通過介導(dǎo)ULK1特定位點(diǎn)磷酸化抑制ULK1-FIP200-Atg13-Atg101復(fù)合物形成，抑制自噬體膜的形成從而抑制自噬啟動(dòng)[29-33]。研究[34-37]發(fā)現(xiàn)，針灸可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路與蛋白來促進(jìn)自噬去除病理產(chǎn)物，緩解炎癥。本研究也發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中p-mTORC1水平明顯增加（P<0.05），電針干預(yù)后，p-mTORC1水平顯著減少（P<0.05），提示電針降低了AA大鼠mTORC1磷酸化水平，抑制自噬啟動(dòng)的能力降低，滑膜組織自噬增加。因此，本研究認(rèn)為電針改善RA其作用機(jī)制可能與電針降低了mTORC1活性，從而促進(jìn)細(xì)胞自噬，進(jìn)而緩解炎性反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，電針的抗炎效應(yīng)可能是通過抑制mTORC1磷酸化、促進(jìn)自噬、下調(diào)TNF-α等致炎因子的表達(dá)，緩解炎性反應(yīng)，一定程度上平衡了局部關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)與自噬活動(dòng)的紊亂，緩解了骨與軟骨的侵蝕，從而減輕關(guān)節(jié)局部的炎癥，這為電針治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供了一定的證據(jù)基礎(chǔ)。

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〔收稿日期〕2021-07-26

〔基金項(xiàng)目〕國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81804204，82074565）;湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2020JJ5433）;長沙市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（KQ2007072）;湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX20210704）。

〔作者簡介〕龍軼映，女，在讀碩士研究生，研究方向：常見疾病的中西醫(yī)結(jié)合康復(fù)的機(jī)理與臨床研究。

〔通信作者〕*艾 ?坤，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：aikun650@qq.com;劉 ?梨，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：26134591@qq.com。