36 h睡眠剝奪對雄性小鼠性行為及精子質(zhì)量的影響

龍德彪，周 錦，徐鑫，鄭池樂，周東升

(衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南衡陽 421008)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，近年來越來越多的人受到不斷增加的工作和生活壓力，不同職業(yè)的人都可能處于不同程度的睡眠剝奪(Sleep deprivation，SD)狀態(tài)。研究表明，睡眠剝奪影響機(jī)體的代謝、免疫系統(tǒng)、應(yīng)激及神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等方面，與人體的各種疾病如心血管疾病，肥胖癥，精神焦慮，抑郁癥等的發(fā)生密切相關(guān)［1－3］。被動的睡眠剝奪已經(jīng)成為日益突出的醫(yī)療及公共衛(wèi)生問題。

目前，有關(guān)睡眠剝奪導(dǎo)致的雄性小鼠性行為及精子質(zhì)量的研究較為少見。研究表明，72 h的睡眠剝奪會造成雄性小鼠性行為異常和生殖系統(tǒng)的不良影響［4－5］，還有研究表明對小鼠進(jìn)行一定時間的睡眠剝奪后可引起雄性小鼠的生殖毒性效應(yīng)［6］。但是，中等時長(如36 h)的睡眠剝奪對雄性小鼠性行為及精子活力的影響仍缺乏深入明確的認(rèn)識。筆者采用輕微改良的輕柔刺激法研究36 h睡眠剝奪對雄性小鼠性行為及精子質(zhì)量的影響，以睡眠剝奪后捕捉次數(shù)、捕捉潛伏期、精子活率和精子畸變率為主要評價指標(biāo)，旨在為睡眠剝奪影響雄性動物生殖行為及精子質(zhì)量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 取雄性昆明小鼠24只，體重(26±4)g，實驗室內(nèi)飼養(yǎng)，12 h光照、12 h黑暗處理，室溫為(25±5)℃，所有小鼠均正常取食與給水。將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分成2組，每組12只，進(jìn)行試驗。

1.2 試驗分組 采用改良的輕柔刺激法［7］，實驗人員輪流值班，拍打小鼠籠發(fā)出聲音，從而使小鼠不能進(jìn)入睡眠狀態(tài)。如果小鼠長時間不睡眠而陷入不活躍狀態(tài)，則用棍狀物直接刺激小鼠使其無法進(jìn)入睡眠。對照組，不作睡眠剝奪(SD)處理;試驗組，第1天8:00到次日20:00SD處理36 h;正常飼喂與飲水。

1.3 方法

1.3.1 小鼠性行為。36 h SD處理后，保持實驗室安靜，將處理組和對照組的成熟雄性小鼠放入290 mm×178 mm ×160 mm的鼠籠中適應(yīng)5 min，接著與2只同批飼養(yǎng)的成熟雌性小鼠形成1∶2配對，觀察30 min。觀察指標(biāo)包括:①捕捉潛伏期(Capture incubation period，CIP):計算雌鼠投入到鼠籠直到雄鼠第1次捕捉雌鼠的時間。②捕捉次數(shù)(Capture times，CT):自雌鼠投入到鼠籠開始，雄鼠撲捉雌鼠的動作，主要是爬背或添陰動作次數(shù)。

1.3.2 精子活率。解剖小鼠后，將任意一側(cè)附睪用剪刀剪碎，然后放入1 ml的0.86%生理鹽水中，生理鹽水需要預(yù)熱至37℃，再水浴10 min，制成精子懸液。取1滴懸液，滴于載玻片，在顯微鏡(100×)暗視野下觀察，共觀察200個精子，使用計數(shù)器手動記錄下精子運動情況。將精子活力依據(jù)文獻(xiàn)分級:A.快速直線向前;B.慢速直線向前或轉(zhuǎn)動向前;C.原地顫動或轉(zhuǎn)動;D.不活動。精子活率=A+B+C/A+B+C+D［8］。

1.3.3 精子畸變率。取“1.3.2”的精子懸浮液進(jìn)行涂片，玻片干燥后用甲醇固定5 min。干后用2%伊紅(Eosin)水溶液染色1 h［9］。檢查精子形態(tài)，每只小鼠檢查完整的精子1 000條。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，首先對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗。符合正態(tài)分布和方差齊性則采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。試驗結(jié)果以SE表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 性行為觀察 從圖1可以看出，小鼠捕捉潛伏期在36 h SD處理后較對照組延長，與對照組存在極顯著差異(P＜0.01)，處理組捕捉潛伏期極顯著高于對照組(P＜0.01)。

圖1 SD處理對小鼠捕捉潛伏期的影響

從圖2可以看出，36 h SD處理后，處理組捕捉次數(shù)極顯著低于對照組(P＜0.01)。

圖2 SD處理對小鼠捕捉次數(shù)的影響

2.2 精子活率 從圖3可以看出，SD處理36 h后小鼠的精子活率比對照組(0 h)低，且存在顯著性差異(P＜0.05);對照組A級精子數(shù)明顯高于處理組，且36 h處理組有4只小鼠沒有觀察到A級精子。

圖3 SD處理對小鼠精子活率的影響

2.3 精子畸變率 從圖4可以看出，小鼠精子畸變率在SD 36 h處理后較對照組有明顯升高，且處理組與對照組存在極顯著差異(P＜0.01)。36 h SD組多見明顯畸變精子，以尾折疊、不定形頭部為常見。

圖4 SD處理對小鼠精子畸變率的影響

3 結(jié)論與討論

雄性動物的捕捉潛伏期(Capture incubation period，CIP)和捕捉次數(shù)(Capture times，CT)的改變作為一種生殖行為異常的特征，已被許多學(xué)者推薦或用于評價雄性生殖行為異常［4，10］。CIP和CT的改變是評價性功能的最優(yōu)指標(biāo)。該研究表明，睡眠剝奪對雄性小鼠CIP和CT有顯著影響，與對照組相比睡眠剝奪36 h可使雄性小鼠潛伏期極顯著延長(P＜0.01)，捕捉次數(shù)極顯著減少(P＜0.01)。這表明中長時間的睡眠剝奪(36 h SD)可使小鼠性行為能力明顯降低。

研究表明，長時間的睡眠剝奪可使小鼠精子活率顯著下降［5］。該研究表明中長時間(36 h)睡眠剝奪也可使精子活率有明顯的下降趨勢(P＜0.05)。睡眠剝奪能使精子活率下降，可能與氧自由基生成過多產(chǎn)生氧化應(yīng)激有關(guān)［11］。該研究還發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪36 h可使小鼠精子畸變率極顯著升高(P＜0.01)，其精子畸變多表現(xiàn)為無鉤、胖頭、無定形、尾折疊。尤其尾折疊和無定形現(xiàn)象已經(jīng)比較明顯，說明36 h的睡眠剝奪已經(jīng)對雄性動物精子質(zhì)量及子代健康造成嚴(yán)重威脅。

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