PAR2在肝細胞癌組織及其門靜脈癌栓中的表達

閃海霞，范崇桂，張懷宏

（河南省南陽市中心醫(yī)院感染性疾病科 473000）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma）在我國是常見的惡性腫瘤之一，其病死率已占我國惡性腫瘤病死率的第2位，據(jù)估計全球每年新增病例超過100萬［1］，部分患者可因早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療而獲得長期生存，但大部分患者確診時已處于中晚期，治療效果差，預(yù)后不理想。且肝細胞癌的轉(zhuǎn)移侵襲能力高，門靜脈癌栓（portal vein tumor thrombus）的發(fā)生是影響肝細胞癌患者預(yù)后的重要因素之一。目前肝細胞癌患者的總5年生存率仍低于5.0%［2］。因此研究和闡明肝細胞癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移侵襲機制，探索有效的治療阻斷靶點具有重要的意義。蛋白酶激活受體（PARs）屬于與G蛋白相耦聯(lián)蛋白。PAR2在消化道腫瘤中表達顯著升高，與多種消化系腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并在一定程度上參與了腫瘤的增殖、黏附、基質(zhì)降解和血管形成的調(diào)節(jié)等［3］。本研究通過免疫熒光染色、RT－PCR和Western bloot等手段檢測人肝細胞癌組織、癌旁正常組織及門靜脈癌栓中PAR2的表達情況，初步探索了PAR2在肝細胞癌中有較高的表達，并且與腫瘤組織的生長與侵襲能力有著重要的相關(guān)性?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 標(biāo)本取自本院普外科、腫瘤科2009～2013年肝細胞癌手術(shù)后保存的組織石蠟標(biāo)本，取其中帶有門靜脈癌栓的標(biāo)本21例，設(shè)為肝細胞癌組織組，同一標(biāo)本距離腫瘤邊緣5cm以外的肝組織為癌旁正常組織組，標(biāo)本中的癌栓設(shè)為門靜脈癌栓組。全部患者通過病史、體征癥狀、胸部平片檢查、CT等進一步明確診斷，術(shù)后經(jīng)病理明確為肝細胞癌。根據(jù)1987年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）的肝細胞癌TMN分期方案，21例Ⅰ期3例，Ⅱ期15例，Ⅲ期2例，Ⅳ期1例；細胞分型均為肝細胞癌3，其中男16例，女5例，平均年齡（59.6±3.1）歲，所有患者術(shù)前均未進行任何抗腫瘤治療。羊多抗PAR2（C－17）：sc－8205購自Santa Cruz公司；FITC標(biāo)記抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶（SP），購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；RT－PCR試劑盒（Takara公司）購于廣州瑞真生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理方法 21例肝細胞癌術(shù)后標(biāo)本采用10%甲醛固定后經(jīng)石蠟包埋，常規(guī)切片后染色觀察。

1.2.2 免疫熒光染色 切片常規(guī)脫蠟至水化，PBS液洗；枸櫞酸鹽緩沖液進行熱抗原修復(fù)12min；0.5%H2O2－甲醇封閉內(nèi)源性過氧化酶10min，PBS液清洗2遍；5%～10%正常山羊血清封閉；滴加1∶50PAR2羊多抗，4℃冰箱過夜，PBS液清洗2遍；滴加FITC標(biāo)記二抗工作液，4℃冰箱過夜，PBS液清洗2遍；hoechst染核，PBS液清洗1遍；防熒光淬滅封片劑封片。

1.2.3 Western blot 以含蛋白酶抑制劑的裂解液分別提取肝癌組織、門靜脈癌栓及癌旁正常組織的總蛋白，Bradford法蛋白定量；90mA恒流十二烷基硫酸鈉（SDS）電泳；90V恒壓轉(zhuǎn)膜120min，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜；麗春紅染色，根據(jù)Marker條帶位置和目的蛋白大小剪膜；含5%脫脂奶粉和TBST封閉液常溫封閉膜1h；4℃孵育1抗過夜；TBST洗膜10min 3次，常溫孵育2抗1h；TBST洗膜10min 3次，ECL法發(fā)光；圖像掃描、分析。

1.2.4 RT－PCR 用Trizol試劑提取肝細胞癌組織、門靜脈癌栓及癌旁正常組織的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用Omiga2.0設(shè)計 PAR2基因引物序列 FP：5′－AGA AGC CTT ATT GGT AAG GTT－3′，RP：5′－AAC ATC ATG ACA GGT CGT GAT－3′，PCR 片段長度為582bp，β－actin基因引物序列FP：5′－TGT TTG AGA CCT TCA ACA CCC－3′，RP：5′－AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG－3′，PCR擴增目的片段長度為540bp，以上引物均由英濰捷基公司廣州合成部合成。提取總RNA，并檢測RNA的含量和純度（A260／A280為1.8～2.0）。取1μg細胞總RNA用PCR儀（Applied Biosystems）進行相應(yīng)基因的擴增。反應(yīng)體系：Taq酶1.25U，10×PCR Buffer（含Mg離子）5μL，dNTP Mixture（各2.5mmol）4μL，cDNA 2.5 ng，引物1（20μmol）1μL，引物2（20μmol）1μL，滅菌雙蒸水補足至10μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃45s，51℃（PAR2）／58℃（β－actin）45s，72 ℃ 60s，33個擴增循環(huán)；2%瓊脂糖電泳PCR擴增產(chǎn)物，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，數(shù)據(jù)處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料數(shù)據(jù)均以表示，采用成組t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫熒光染色法檢測PAR2表達 癌旁組織中和門靜脈癌栓組織中綠色熒光染色明顯較強（圖1A、B）；免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)PAR2在癌旁正常組織中綠色熒光表弱（圖1C）。肝細胞癌組織中陽性染色細胞百分比為91.23±7.52，門靜脈癌栓組織中陽性染色細胞百分比為93.43±8.45，癌旁組織中陽性染色細胞百分比為51.73±8.41。分別作成組t檢驗后發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌組織與癌旁正常組織之間、門靜脈癌栓組織與癌旁正常組織之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），肝細胞癌組織與門靜脈癌栓組織間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 PAR2在肝細胞癌、門靜脈癌栓及癌旁正常組織中的表達（免疫熒光染色×200）

2.2 Western Blot檢測不同組別組織PAR2的表達 結(jié)果顯示肝細胞癌、癌旁正常、門靜脈癌栓3種組織均有PAR2表達，其中肝細胞癌組織與門靜脈癌栓組織表達明顯高于癌旁正常肝組織，見圖2。

圖2 PAR及β－actin分別在肝細胞癌、門靜脈癌栓及癌旁正常組織中的蛋白表達

2.3 RT－PCR在不同組織的表達 由于PAR2蛋白表達水平在不同組織中存在一定的差異，假設(shè)PAR2基因在不同組織中的表達也存在一定的差異。由此本研究設(shè)計了PAR2基因序列特異引物，β－actin基因為內(nèi)參進行RT－PCR驗證。結(jié)果表明，在各組織中，PAR2均有表達，但肝細胞癌組織及門靜脈癌栓組織與癌旁正常組織的PAR2mRNA表達存在差異，這與細胞表面相應(yīng)蛋白水平是相一致的，見圖3。

圖3 PAR及β－actin分別在肝細胞癌、門靜脈癌栓及癌旁正常組織中的mRNA表達

3 討 論

1994年，研究者發(fā)現(xiàn)了一種與凝血酶受體晶體結(jié)構(gòu)和活化機制相似的蛋白PAR2，PAR2是一種屬于G蛋白酶耦聯(lián)蛋白激活酶受體超家族成員的細胞膜表面受體。人源PAR2基因結(jié)構(gòu)域與小鼠編碼的PAR2基因結(jié)構(gòu)類似，人源PAR2蛋白屬于跨膜蛋白，由開放閱讀框編碼的397個氨基酸組成，與小鼠編碼的PAR2蛋白同源性達85.0%，PAR2跨膜蛋白主要由胞外蛋白（N末端）、跨膜區(qū)域（7個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)）及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)（細胞內(nèi)袢及C末端）組成，人源PAR2與小鼠編碼的PAR2都含有7個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。PAR2蛋白N端絲氨酸酶解位點和細胞外伴在蛋白活化過程中起著重要作用，C端在一定程度上介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。凝血因子Ⅻa、Ⅹa、膜型絲氨酸蛋白酶－1、人氣道胰蛋白酶樣蛋白酶等皆可激活PAR2，常用的人工PAR2激活劑為SLIGKV，但SLIGKV－NH2不能裂解受體N末端，可以直接與細胞外袢區(qū)域直接激活PAR2［4］，能夠在體內(nèi)外重復(fù)相應(yīng)配體的作用，目前已被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。PAR2廣泛分布于消化系統(tǒng)的各種組織結(jié)構(gòu)，有大量研究表明，PAR2的上調(diào)表達可促進消化道腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和浸潤，對腫瘤細胞增殖和血管形成以及基質(zhì)降解等生理生化過程具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，除消化系腫瘤外，在如乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤中，PAR2的表達也有所增加，在對食管癌等腫瘤的研究顯示腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移程度、浸潤深度、靜脈遠處轉(zhuǎn)移等與PAR2表達呈高度正相關(guān)［5－7］。有學(xué)者在人肝細胞癌細胞系HepG2上發(fā)現(xiàn)PAR2激動劑在不同濃度（1～50μmol／L）均可刺激肝細胞癌細胞增殖，并呈計量依賴性［8］。同時，有學(xué)者在對原發(fā)性肝細胞癌組織和癌旁正常組織進行分析后，發(fā)現(xiàn)PAR2在原發(fā)性肝細胞癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織［9］。

本研究表明，PAR2蛋白在肝細胞癌組織和門靜脈癌栓組織中表達量及強度均顯著高于癌旁正常組織，在蛋白表達水平上，肝細胞癌組織及門靜脈癌栓組織中PAR－2的表達要高于癌旁門靜脈組織，從分子水平上驗證了肝細胞癌組織及門靜脈癌栓組織中PAR2表達量要高于癌旁正常組織，提示肝細胞癌的生長與侵襲能力可能受到PAR2的影響。在RNA水平上，肝細胞癌組織及門靜脈癌栓組織中RNA表達相對值均高于癌旁組織，在肝細胞癌組織及癌栓組織中通過RNA調(diào)控PAR2表達增高，與以往一致［8，10］，提示腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移機制與PAR2有著密切的聯(lián)系。因而，本研究分別對比分析肝細胞癌組織與癌旁正常組織、門靜脈癌栓組織與癌旁正常組織這一不同角度表明PAR－2的過表達對肝細胞癌發(fā)生和進展具有促進作用，但此過程的具體分子機制目前推測其可能有：（1）PAR2受激活后促進磷酸肌醇水解及細胞內(nèi)Ca2＋自由移動，激活蛋氨酸受體激活酶，從而促進p42／p44MAPK通路的活動，從而達到促進腫瘤組織生長的目的［11］。（2）PAR2經(jīng)激活后胞內(nèi)Ca2＋動員增加，進而使得表皮生長因子被激活，隨后激活ras依賴的ERK1／2通路，從而激活經(jīng)典ras依賴的ERK1／2通路，從而引起DNA復(fù)制、細胞增殖效應(yīng)［12］。（3）PAR2激活后誘導(dǎo)Jun激活區(qū)域凝結(jié)蛋白1的蛋白修飾作用，促進細胞骨架的重新分布，從而減少機體自身的免疫應(yīng)答，有利于腫瘤細胞的遷徙移動［13］。（4）組織因子激活凝血因子Ⅶ結(jié)合后形成的復(fù)合物在作為激動劑激活PAR2的同時，亦可以特異性上調(diào)IL－8的表達，從而促進腫瘤組織血管生成，同時改變患者局部凝血功能，形成局部腫瘤微環(huán)境，使得腫瘤組織生長侵襲效果增強［5，14］。（5）有學(xué)者亦發(fā)現(xiàn) CD47（＋）肝細胞癌可通過自分泌組織蛋白S激活PAR2通路，從而促進自身的生長，而CD47則在腫瘤干細胞中優(yōu)先表達［15］。PAR2的高表達是否標(biāo)志著腫瘤的惡性程度更高、侵襲能力更強，仍需作進一步的深入研究。綜上所述，PAR2不僅有望作為新一代臨床篩選的腫瘤學(xué)標(biāo)志物，更因其定位明確有望成為肝細胞癌靶向治療的新靶點。

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