固相萃取凈化-氣相色譜質(zhì)譜法測定茶葉中22種禁用農(nóng)藥殘留量

陸小磊，蔣美蓉，葉美君，周衛(wèi)龍

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，國家茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，浙江杭州 310016；2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州，310018）

固相萃取凈化-氣相色譜質(zhì)譜法測定茶葉中22種禁用農(nóng)藥殘留量

陸小磊1，蔣美蓉2，葉美君1，周衛(wèi)龍1

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，國家茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，浙江杭州 310016；
2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州，310018）

摘要：建立了測定茶葉中22種禁用農(nóng)藥殘留量的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。茶葉樣品經(jīng)乙腈均質(zhì)提取后，經(jīng)石墨化碳-氨基復(fù)合固相萃取小柱凈化后，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀在選擇離子監(jiān)測模式下進(jìn)行定性定量。結(jié)果表明，22種農(nóng)藥在0.05～1.00 μg/mL范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相關(guān)系數(shù)大于0.99；在1.00、0.25和0.025 mg/kg濃度添加水平下，22種農(nóng)藥的回收率在65%～120%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）小于10%；方法檢出限為0.001～0.031 mg/kg。該方法準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定，適合實際檢測需要。

關(guān)鍵詞：茶葉；禁用農(nóng)藥；殘留量；固相萃?。粴庀嗌V質(zhì)譜法

中國茶葉加工2015（1）：11～17

農(nóng)藥作為一項茶園生產(chǎn)過程中的重要投入品，對有效防治茶園病蟲害、增加茶葉產(chǎn)量、提高茶葉品質(zhì)起到重要作用。但是隨著對農(nóng)藥性質(zhì)、環(huán)境行為和生物安全性的深入研究，有些常用農(nóng)藥具有不易降解、致畸、致癌等特點，長期施用該類農(nóng)藥，將會嚴(yán)重污染環(huán)境和危害人體健康［1］。為此，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布194、199、274公告文件，列出禁用農(nóng)藥和限用農(nóng)藥清單，其中包括23種全面禁止使用的農(nóng)藥，16種不得在茶樹上使用的農(nóng)藥［2-3］。同時，國家衛(wèi)計委對GB 2763《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》進(jìn)行不斷修訂，計劃把所有禁用農(nóng)藥殘留限量列入國家食品強制性標(biāo)準(zhǔn)中［4］。因此，有必要建立一種準(zhǔn)確、快速、可靠的茶葉中禁用農(nóng)藥多殘留檢測方法。

目前對禁用農(nóng)藥的檢測手段主要有氣相色譜法（GC）、液相色譜法（LC）、色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［5-8］等，但針對茶葉中禁用農(nóng)藥測定的研究不多。茶葉中含有大量不確定的干擾物，傳統(tǒng)的分析方法凈化效果不佳，本文采用均質(zhì)提取和固相萃?。⊿PE）凈化，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）進(jìn)行測定，能夠準(zhǔn)確地對22種有機(jī)磷、有機(jī)氯和氨基甲酸酯類禁用農(nóng)藥進(jìn)行定性定量。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

主要儀器：Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 （GC-MS），配有電子轟擊離子源（Electron impact ion source，EI），ChemStation質(zhì)譜工作站（美國 Agilent公司）；分析天平（感量0.01 mg和0.1 mg，瑞士METTLER TOLEDO公司）；SC-3610低速離心機(jī) （安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；T10高速組織分散機(jī) （德國IKA公司），最大轉(zhuǎn)速30000 rpm；VM06型6位大體積負(fù)壓SPE裝置 （天津Agela公司）；CS501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海瑞立科學(xué)儀器有限公司）；MTN-2800D氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

試劑：乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；丙酮，乙酸乙酯，石油醚（分析純，華東醫(yī)藥股份有限公司）；CNW 50 mL塑料螺紋具塞離心管（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；200 mL圓底燒瓶，5 mL 和10 mL刻度移液管 （天津市天玻玻璃儀器有限公司）；GC-e/NH2500 mg/6 mL WondaSep SPE小柱（島津技邇商貿(mào)有限公司）；2 mL一次性無菌注射器 （杭州龍德醫(yī)用器械有限公司）；0.45 μm微孔過濾膜（尼龍，天津Agela公司）。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，包括涕滅威、克百威、內(nèi)吸磷、滅線磷、殺蟲脒、治螟磷、久效磷、甲拌磷、特丁硫磷、地蟲硫磷、氯唑磷、磷胺、甲基對硫磷、艾氏劑、三氯殺螨醇、對硫磷、甲基異柳磷、硫環(huán)磷、苯線磷、狄氏劑、除草醚、蠅毒磷等22種農(nóng)藥（100.0 μg/mL，1.5 mL，美國AccuStandard公司）；內(nèi)標(biāo)物質(zhì)：環(huán)氧七氯（純度100%，美國AccuStandard公司）。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

準(zhǔn)確稱取約5 mg（精確到0.01 mg）環(huán)氧七氯至50 mL容量瓶中，用丙酮溶解定容，再稀釋配置成濃度為2.10 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

用2 mL樣品空白溶液和一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配置成濃度為 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，并加入40 μL內(nèi)標(biāo)溶液?；|(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2樣品制備

取茶葉約500 g放入粉碎機(jī)中磨碎，制備供分析樣品，并放置于避光陰涼干燥處保存。

1.2.3樣品前處理

（a）提取。稱取2 g試樣（精確至0.0001 g）于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈，12000 rpm均質(zhì)1 min，3500 rpm離心后移取提取液，殘渣再用10 mL乙腈重復(fù)均質(zhì)提取一次，合并提取液于200 mL圓底燒瓶中，于40℃水浴中減壓濃縮至干，待凈化。

（b）凈化。將5 mL淋洗液（乙腈+丙酮+乙酸乙酯=3+2+1，體積比）以約每秒1滴的速度通過WondaSep SPE小柱，并保持柱子濕潤，棄去；然后用5 mL淋洗液對濃縮后的凈化液洗滌3次并加入SPE小柱，以約每秒1滴的速度通過小柱，并收集于200 mL圓底燒瓶中；再用20 mL淋洗液（乙腈+丙酮+乙酸乙酯=3+2+1，體積比）淋洗小柱，合并收集洗脫液。

（c）定容。將洗脫液在40℃下減壓濃縮近干，吹干，用石油醚準(zhǔn)確定容至2 mL，加入40 μL內(nèi)標(biāo)溶液，供GC-MS檢測。

1.2.4添加回收率試驗

稱取經(jīng)測定不含目標(biāo)農(nóng)藥的茶葉空白樣品2 g（精確至0.0001 g），分別添加不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其相當(dāng)于1.00、0.25、0.025 mg/kg濃度添加水平，混勻后，按照1.2.3進(jìn)行處理提取與凈化，每個濃度水平重復(fù)5次，設(shè)置1個空白樣品對照；移取相當(dāng)量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至進(jìn)樣小瓶中，加入按照1.2.3提取后的空白茶葉樣品溶液稀釋定容，加入40 μL內(nèi)標(biāo)溶液，作為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定，計算添加回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和檢出限。

1.2.5氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：DB-5 MS石英毛細(xì)管柱 （30 m× 0.25 mm×0.25 μm）；載氣：氦氣 （He），純度≥99.999%，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：290℃；進(jìn)樣量：1 μL，不分流進(jìn)樣；升溫程序：40℃保持1 min，然后以30℃/min程序升溫至130℃，再以5℃/min升溫至250℃，再以10℃/min升溫至300℃，保持5 min。電離方式：電子轟擊電離源（EI）70 eV；接口溫度：280℃；四級桿溫度：150℃；離子源溫度：230℃；溶劑延遲：5 min。

2　結(jié)果與討論

2.1前處理方法的優(yōu)化

在提取方式的選擇上，本試驗采用了均質(zhì)的提取方式，即在茶葉中加入一定量溶劑作為提取劑，通過高速均質(zhì)的方式，提高茶葉破碎度，使得茶葉基質(zhì)與提取溶劑充分接觸，提高農(nóng)藥的提取效率。與索氏提取、超聲提取等傳統(tǒng)提取方式相比，均質(zhì)提取具有操作簡單、快速的特點。因此，本文選用均質(zhì)提取方式。

在提取溶劑的選擇上，由于目標(biāo)農(nóng)藥包括有機(jī)磷、有機(jī)氯和氨基甲酸酯類化合物，這三種農(nóng)藥易溶于有機(jī)溶劑，乙腈、二氯甲烷、石油醚均為良好的提取劑，但考慮到茶葉基質(zhì)較多，而乙腈提取出的色素、油脂類雜質(zhì)較少，且能夠沉淀蛋白質(zhì)等雜質(zhì)［8］，因此，本試驗選取乙腈作為提取溶劑。

雖然采用乙腈提取可以選擇性地除去一部分茶葉基質(zhì)，但是還需做進(jìn)一步的凈化處理以除去剩余的色素和其他小分子雜質(zhì)。石墨化碳能很好地吸附色素，氨基能有效地吸附有機(jī)酸和糖分，同時使用兩種填料進(jìn)行凈化能夠很好地除去大部分雜質(zhì)［8］。

考慮到目標(biāo)化合物的極性不一，但均能溶于乙腈，因此選擇乙腈。根據(jù)GB/T 23204標(biāo)準(zhǔn)，洗脫液為乙腈+甲苯+乙酸（75+25+1，體積比），因甲苯毒性較大，且較難獲得，因此選擇一定比例極性較強的丙酮和極性較弱的乙酸乙酯來調(diào)節(jié)洗脫效率。在洗脫液的選擇上，通過餾分試驗（圖1），可以看出使用乙腈+丙酮+乙酸乙酯（3+2+1，體積比）可以使目標(biāo)化合物在洗脫量5～15 mL之間被洗出，考慮到該方法需要對更多的禁用農(nóng)藥進(jìn)行測定，個別農(nóng)藥可能在15 mL的洗脫量下不能被完全洗脫，因此試驗中采用20 mL的乙腈+丙酮+乙酸乙酯（3+ 2+1，體積比）來洗脫小柱中的目標(biāo)化合物。

圖1　乙腈+丙酮+乙酸乙酯（3+2+1，體積比）對22種農(nóng)藥的洗脫效果Fig.1 Elution rates of 22 pesticides in Carb-NH2with acetonitrile+acetone+ethyl acetate（3+2+1，volume ratio）

2.2氣相色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

石英毛細(xì)管柱DB-5 MS作為一款高性能通用色譜柱，不僅對大部分農(nóng)藥化合物有很好的保留特性，而且其低流失的特點能夠減少噪音，提高信噪比。采用不同的升溫速率能夠有效分離目標(biāo)化合物，并減少基質(zhì)干擾。在定性定量方法上，傳統(tǒng)的ECD、FPD是通過化合物的保留時間定性，容易造成假陽性；MSD通過保留時間，標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，碎片離子豐度比進(jìn)行定性，從而有效地降低了假陽性［5］。在定量方面，MSD中的選擇離子監(jiān)測（SIM）方式可以在一定程度上提高化合物的信噪比（表1）。

表 1　茶葉中22種農(nóng)藥和環(huán)氧七氯（內(nèi)標(biāo)）的定量離子、定性離子及豐度比Table 1　SIM parameters for GC-MS analysis of 22 pesticides

2.3方法評價

2.3.1線性方程

對基質(zhì)中22種農(nóng)藥的0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL濃度進(jìn)行測定，以化合物與內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)峰面積比作為縱坐標(biāo)，濃度作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 （表2），結(jié)果表明，22種農(nóng)藥在0.05～1.00 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，其工作曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明該定量方法適合在該濃度范圍內(nèi)對樣品中該22種農(nóng)藥的含量進(jìn)行測定。

2.3.2儀器最小檢出量和方法檢出限

根據(jù)信噪比S/N=3計算，儀器對22種農(nóng)藥的最小檢出量（Limit of Detection，LOD）為0.2～10.5 pg。根據(jù)信噪比S/N=10計算，該檢測方法對茶葉中22種農(nóng)藥的檢出限 （Limit of Quantification，LOQ）為0.001～0.031 mg/kg（表2）。

表2　22種農(nóng)藥的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、最小檢出量和定量限Table 2　Retention times，linear equations，correlation coefficients，detection limits of 22 pesticides

2.3.3方法準(zhǔn)確度和精密度

在1.00、0.25、0.025 mg/kg濃度添加水平下，22種農(nóng)藥的回收率見表3。由表3可知，在3個不同添加濃度下，22種農(nóng)藥的回收率在65%～120%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10.0%，該結(jié)果符合實際檢測工作中對于準(zhǔn)確度和精密度的要求（圖3、4）。

表3　22種農(nóng)藥在3個不同添加濃度下的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3　Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of 22 pesticides in tea

圖2　茶葉基質(zhì)中22種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的SIM譜圖（0.環(huán)氧七氯；1.涕滅威；2.克百威；3.內(nèi)吸磷；4.滅線磷；5.殺蟲脒；6.治螟磷；7.久效磷；8.甲拌磷；9.特丁硫磷；10.地蟲硫磷；11.氯唑磷；12.磷胺；13.甲基對硫磷；14.艾氏劑；15.三氯殺螨醇；16.對硫磷；17.甲基異柳磷；18.硫環(huán)磷；19.苯線磷；20.狄氏劑；21.除草醚；22.蠅毒磷）Fig.2 GC-MS SIM chromatogram of mixed pesticide standard solution（0.Heptachlor epoxide；1.Carbanolate；2.Carbofuran；3.Demeton；4.Ethoprophos；5.Chlordimeform；6.Sulfotep；7.Monocrotophos；8. Phorate；9.Terbufos；10.Dyfonate；11.Isazophos；12.Phosphamidon；13.Methyl-parathion；14.Aldrin；15.Dicofol；16.Parathion；17. Isofenphos-methyl；18.Phosfolan；19.Fenamiphos；20.Dieldrin；21.Nitrofen；22.Coumaphos）

圖3　茶葉基質(zhì)空白對照SIM譜圖（0.環(huán)氧七氯）Fig.3 GC-MS SIM chromatogram of blank tea sample（0.Heptachlor epoxide）

圖4　22種農(nóng)藥添加回收試驗SIM譜圖（0.環(huán)氧七氯；1.涕滅威；2.克百威；3.內(nèi)吸磷；4.滅線磷；5.殺蟲脒；6.治螟磷；7.久效磷；8.甲拌磷；9.特丁硫磷；10.地蟲硫磷；11.氯唑磷；12.磷胺；13.甲基對硫磷；14.艾氏劑；15.三氯殺螨醇；16.對硫磷；17.甲基異柳磷；18.硫環(huán)磷；19.苯線磷；20.狄氏劑；21.除草醚；22.蠅毒磷）Fig.4 GC-MS SIM chromatogram of tea sample spiked with 22 pesticides（0.Heptachlor epoxide；1.Carbanolate；2.Carbofuran；3.Demeton；4.Ethoprophos；5.Chlordimeform；6.Sulfotep；7.Monocrotophos；8. Phorate；9.Terbufos；10.Dyfonate；11.Isazophos；12.Phosphamidon；13.Methyl-parathion；14.Aldrin；15.Dicofol；16.Parathion；17. Isofenphos-methyl；18.Phosfolan；19.Fenamiphos；20.Dieldrin；21.Nitrofen；22.Coumaphos）

3　結(jié)論

該方法采用固相萃取凈化技術(shù)，氣相色譜-質(zhì)譜分析手段，建立了快速、準(zhǔn)確、有效地檢測茶葉中的有機(jī)磷、有機(jī)氯和氨基甲酸酯類禁用農(nóng)藥。采用乙腈作為提取溶劑，既能有效提取各種農(nóng)藥，又有效地降低了基質(zhì)干擾；凈化過程中采用的石墨化碳-氨基混合小柱可以吸收大部分色素、糖類物質(zhì)而不保留目標(biāo)化合物，有效的降低了基質(zhì)干擾，提高了方法的準(zhǔn)確度和精密度。采用加標(biāo)回收率試驗表明，本方法定量限、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿足茶葉中22種禁用農(nóng)藥日常檢測要求。

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中圖分類號：S571.1；F767.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：2095-0306（2015）01-0011-07

收稿日期：2014-09-11

作者簡介：陸小磊（1984-），男，浙江瑞安人，工程師，主要從事茶葉質(zhì)量安全檢測工作。

Determination of 22 Banned Pesticides Residues in Tea by Solid Phase Extraction and Gas Chromatography Mass Spectrometry

LU Xiao-lei1，JIANG Mei-rong2，YE Mei-jun1，ZHOU Wei-long1
（1.Hangzhou Tea Research Institute，CHINA COOP，China National Center of Quality Supervision and Inspection of Tea，
Hangzhou 310016，China；2.Zhejiang Economic and Trade Polytechnic，Hangzhou 310018，China）

Abstract:A method was developed for determination of 22 banned pesticides residues in tea by gas chromatography mass spectrometry（GC-MS）.The sample was homogenized by acetonitrile and cleaned-up by Carb-NH2SPE column，finally determinated by GC-MS coupled with DB-5 column.The Results indicated that the correlation coefficients（R）of standard working curve in tea matrix（0.05～1.00 μg/mL）were above 0.99.The recoveries of 22 pesticides were between 65%and 120%at spiked levels of 1.00，0.25 and 0.025 mg/kg，with relative standard deviations（RSDs）below 10%.The limits of quantitation（LOQ）were 0.001～0.031 mg/kg.The present method is rapid，stable and precise，and suitable for the determination of banned pesticides in tea.

Key words:Tea；Banned pesticides；Residues；Solid phase extraction；Gas chromatography mass spectrometry